In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Methode des Wachstums, der Reinigung und der Titration des onkolytischen Herpes-simplex-Virus für die präklinische Anwendung.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Onkolytische Viren (OVs), wie das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV), sind eine schnell wachsende Behandlungsstrategie im Bereich der Krebsimmuntherapie. OVs, einschließlich oHSV, replizieren sich selektiv in Krebszellen und töten sie ab (schonen gesunde / normale Zellen), während sie eine Anti-Tumor-Immunität induzieren. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften werden oHSV-basierte Behandlungsstrategien zunehmend präklinisch und klinisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt, einschließlich des von der FDA zugelassenen Talimogens Laherparevec (T-Vec). Wachstum, Reinigung und Titration sind drei wesentliche Labortechniken für alle OVs, einschließlich oHSVs, bevor sie für experimentelle Studien verwendet werden können. Dieses Papier beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode zur Verstärkung von oHSV in Vero-Zellen. Wenn sich oHSVs vermehren, erzeugen sie einen zytopathischen Effekt (CPE) in Vero-Zellen. Sobald 90-100% der infizierten Zellen eine CPE aufweisen, werden sie schonend geerntet, mit Benzonase und Magnesiumchlorid(MgCl2)behandelt, filtriert und mit der Saccharose-Gradienten-Methode gereinigt. Nach der Reinigung wird die Anzahl der infektiösen oHSV (als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet) durch einen "Plaque-Assay" in Vero-Zellen bestimmt. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um hochtitere oHSV-Bestände für In-vitro-Studien in Zellkultur und in vivo Tierversuchen vorzubereiten.
Einleitung
Onkolytische Viren (OVs) sind eine aufkommende und einzigartige Form der Krebsimmuntherapie. OVs replizieren sich selektiv in tumoren Zellen und lysieren sie (schonen normale/gesunde Zellen)1 und induzieren gleichzeitig eine Antitumorimmunität2. Das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV) ist eines der am umfangreichsten untersuchten Viren unter allen OVs. Talimogene Laherparepvec (T-VEC) ist die erste und einzige OV, die in den USA die FDA-Zulassung für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms3erhalten hat. Neben T-VEC werden viele weitere gentechnisch veränderte oHSVs präklinisch und klini....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1) oHSV-Wachstum
HINWEIS: Stellen Sie die Genehmigung des institutionellen Biosicherheitsausschusses sicher, bevor Sie mit oHSV zusammenarbeiten. Diese Studie wurde unter dem genehmigten IBC-Protokoll Nr. 18007 durchgeführt. Halten Sie die BSL2-Vorsichtsmaßnahmen ein: Bleichen Sie alle Pipetts, Spitzen, Röhrchen und andere Materialien, die mit dem Virus in Kontakt kommen. Sprühen Sie Handschuhe mit 70% Isopropylalkohol, bevor die Hände die BSL2-Zellkulturhaube verlassen. Waschen Sie die Hände nach der Arbeit mit einem Virus immer gründlich mit Seife.
- Am Tag -1 Vero-Zellen mit niedriger Passage in 20 T-150 cm2 Kolben mit....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Ein kurzer Überblick über das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt, die die kritischen Schritte beim Wachstum, der Reinigung und der Titration von oHSV darstellt. CPE in Vero-Zellen kann bereits 4 Stunden nach HSV-Infektion nachgewiesen werden19. Abbildung 2 zeigt CPE in Vero-Zellen zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach einer oHSV-Infektion. Das Niveau des CPE wird im Laufe der Zeit erhöht. In diesem Protokoll wird 90-100% CPE.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das Protokoll beginnt mit dem Wachstum von oHSV in Vero-Zellen mit niedriger Passage. Die Konfluenz der Vero-Zellmonoschicht sollte zum Zeitpunkt der Virusimpfung ~ 80% betragen, da überwachsene Zellen enge faserige Strukturen entwickeln können, die den Eintritt von oHSV in Vero-Zellen reduzieren können20. Sobald 90-100% CPE beobachtet wurde, wird der Kulturüberstand entfernt, Zellen geerntet, in VB/Überstand resuspendiert (siehe Schritt 1.4.6), einrastig eingefroren und bei -80 °C zur späteren Re.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
SDR ist Miterfinder von Patenten im Zusammenhang mit onkolytischen Herpes-simplex-Viren, im Besitz und verwaltet von der Georgetown University und dem Massachusetts General Hospital, die Lizenzgebühren von Amgen und ActiVec Inc. erhalten haben und im wissenschaftlichen Beirat von EG 427 sind. Die anderen Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Die Forschung im Saha-Labor wurde teilweise durch Mittel des DOD (W81XWH-20-1-0702) und der Dodge Jones Foundation-Abilene unterstützt. Samuel D. Rabkin und Melissa R.M. Humphrey wurden teilweise von NIH unterstützt (R01 CA160762).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zentrifugenröhrchen | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen | Falcon | 352097 | |
| 5 mL Röhrchen aus Polypropylen | Falcon | 352063 | |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen | Falcon | 352098 | |
| 6-Well-Zellkulturplatten | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuklease | Sigma | E8263-25KU | |
| Zellschaber | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethylsulfoxid | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco' s modifizierte Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fötales Rinderserum-Hyklon | SH3007003 | ||
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyd | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerin | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| Dulbecco mit hohem Glukosegehalt s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Sigma | D4031 | |
| Humanes Immunglobulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesiumchlorid | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Sterilisationsfilter für Medien, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E Sterilisationsfilter | |
| für Medien, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutralrote Lösung | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyd | Fisher wissenschaftlich | 15710S | |
| Tellerwippe | Fisher | 88861043 | |
| Kaliumferricyanid | Sigma | P8131 | |
| Kaliumferrocyanid | Sigma | P9387 | |
| Natriumchlorid | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Zentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Zentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Saccharose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Spritzenvorsatzfilter, 0,45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Spritzenvorsatzfilter, 0,8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Spritzenvorsatzfilter, 5 & Mikro; m PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 Kulturflasche | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultraschall-Wasserbad | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
Referenzen
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and developmen....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
