Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Abstract

Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem Ribosomenprofile erstellt, spezifische mRNAs identifiziert werden können, die von Ribosomen übersetzt werden, und Polysomen-assoziierte Faktoren analysiert werden können. Während automatisierte Gradientenhersteller und Gradientenfraktionierungssysteme häufig mit dieser Technik verwendet werden, sind diese Systeme im Allgemeinen teuer und können für Laboratorien, die über begrenzte Ressourcen verfügen oder die Kosten aufgrund ihrer seltenen oder gelegentlichen Notwendigkeit, diese Methode für ihre Forschung durchzuführen, unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Polysomenprofilen mit Standardgeräten vorgestellt, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien ohne spezielle Fraktionierungsinstrumente verfügbar sind. Darüber hinaus wird ein Vergleich von Polysomenprofilen bereitgestellt, die mit und ohne Gradientenfraktionierungssystem erzeugt wurden. Strategien zur Optimierung und Herstellung reproduzierbarer Polysomenprofile werden diskutiert. Saccharomyces cerevisiae wird in diesem Protokoll als Modellorganismus verwendet. Dieses Protokoll kann jedoch leicht modifiziert und angepasst werden, um Ribosomenprofile für viele verschiedene Organismen und Zelltypen zu erstellen.

Introduction

Ribosomen sind Mega-Dalton-Ribonukleoproteinkomplexe, die den grundlegenden Prozess der Übersetzung von mRNA in Proteine durchführen. Ribosomen sind für die Synthese aller Proteine innerhalb einer Zelle verantwortlich. Eukaryotische Ribosomen umfassen zwei Untereinheiten, die entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten als kleine ribosomale Untereinheit (40S) und große ribosomale Untereinheit (60S) bezeichnet werden. Das vollständig zusammengesetzte Ribosom wird als 80S-Monosom bezeichnet. Polysomen sind Gruppen von Ribosomen, die an der Übersetzung eines einzelnen mRNA-Moleküls beteiligt sind. Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugat....

Protocol

1. Herstellung von 7% - 47% Saccharosegradienten

HINWEIS: Der lineare Bereich des Saccharosegradienten kann je nach verwendetem Zelltyp modifiziert werden, um eine bessere Trennung zu erreichen. Dieses Protokoll ist für Polysomenprofile für S. cerevisiae optimiert.

1. Stammlösungen von 7% und 47% Saccharose in Saccharosegradientenpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM_MgCl2 und 1 mM DTT) herzustellen. Filter sterilisieren die Saccharose-Stammlösungen durch einen 0,22 μm Filter und lagern bei 4 °C.
2. Bereiten Sie 14 ml 17%, 27% und 37% Saccharoselösungen durch Dosieren und Mischen der 7%igen und 47%....

Results

In Abbildung 3 sind drei repräsentative Polysomenprofile dargestellt. Alle Profile stammen vom gleichen Hefestamm. Ein typisches Polysomenprofil hat gut aufgelöste Peaks für die ribosomalen Untereinheiten 40S, 60S und 80S sowie Polysomen. Der Kamm jeder ribosomalen Untereinheit und jedes Polysomenpeaks ist auf jedem Profil sichtbar (Abbildung 3). Ein repräsentatives Profil eines automatisierten Dichtefraktionierungssystems ist in Abbildung 3.......

Discussion

Hier wurde eine Methode beschrieben, um Polysomenprofile ohne den Einsatz teurer automatisierter Fraktionierungssysteme zu erstellen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Polysomenprofilierung für Labore zugänglich macht, die nicht über automatisierte Fraktionierungssysteme verfügen. Die Hauptnachteile dieses Protokolls sind die langwierige Handfraktionierung und die reduzierte Empfindlichkeit im Vergleich zum dedizierten Dichtefraktionierungssystem.

Dieses Protokoll beinhalt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatischer Fraktionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximid	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glasperlen, säuregewaschen	Sigma Aldrich	G8772	425– 600 μm m
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesiumchlorid, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Nadel, 22 g, Metallnabe	Hamilton Company	7748-08	benutzerdefinierte Länge 9 Zoll, Punktausführung 3
Optima XL-100K Ultrazentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylen Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	331372
Polypropylen Reagenzglas Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Angewandte Biosysteme	N8080119
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Schwingschaufelrotor Pkg	Beckman Schar	331336
Spritze, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M, pH 7,4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Mikrotiterplatte, 96 Vertiefungen	Greiner Bio-One