Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige Methode zur Anwendung von Gentherapien auf Subpopulationen von Zellen bei neonatalen Ratten im postnatalen Alter von 5-10 Tagen durch Injektion eines anterograden chemogenetischen Modifikators in den somatomotorischen Kortex und einer retrograden transportablen Cre-Rekombinase in das zervikale Rückenmark.
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Methodenartikel
Targeting des kortikospinalen Trakts bei neonatalen Ratten mit einem doppelviralen Vektor mittels kombinierter Gehirn- und Wirbelsäulenchirurgie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die erfolgreiche Überwindung der Hindernisse, die die Forschung an neonatalen Ratten behindern, ist wichtig, um die Unterschiede in den Ergebnissen bei pädiatrischen Rückenmarksverletzungen (SCIs) im Vergleich zu erwachsenen SCIs zu untersuchen. Darüber hinaus kann die zuverlässige Einführung von Therapien in die Zielzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) eine Herausforderung darstellen, und Ungenauigkeiten können die Wirksamkeit der Studie oder Therapie beeinträchtigen. Dieses Protokoll kombiniert die virale Vektortechnologie mit einer neuartigen chirurgischen Technik, um Gentherapien bei neonatalen Ratten am postnatalen Tag 5 präzise einzuführen. Hier wird ein Virus, das für den retrograden Transport (retroAAV2) von Cre entwickelt wurde, an den Axonendigungen kortikospinaler Neuronen im Rückenmark eingeschleust, wo es anschließend zu den Zellkörpern transportiert wird. Ein doppelt gefloxter Designer-Rezeptor mit umgekehrter Orientierung (DIO), der ausschließlich durch das Designer-Drug-Virus (DREADD) aktiviert wird, wird dann in den somatomotorischen Kortex des Gehirns injiziert. Diese Doppelinfektionstechnik fördert die Expression der DREADDs nur in den koinfizierten Neuronen des kortikospinalen Trakts (CST). Daher ist die gleichzeitige Co-Injektion des somatomotorischen Kortex und der zervikalen CST-Terminals eine gültige Methode zur Untersuchung der chemogenetischen Modulation der Genesung nach zervikalen SCI-Modellen bei neonatalen Ratten.
Einleitung
Während Rückenmarksverletzung in der pädiatrischen Bevölkerung relativ selten vorkommt, ist sie besonders traumatisch und verursacht eine dauerhafte Behinderung, die eine immense logistische Voraussicht erfordert. Darüber hinaus wird ein höherer Anteil pädiatrischer Rückenmarksverletzungen als zervikal und vollständig eingestuft als in der erwachsenen Bevölkerung 1,2. Ein Kennzeichen aller Säugetierarten ist, dass sich Neugeborene deutlich besser von einer Rückenmarksverletzung erholen als erwachsene Tiere, und dies bietet die Möglichkeit, die treibenden Mechanismen für die Erholung in ....
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Protokoll
Alle folgenden chirurgischen und tierpflegerischen Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Temple University genehmigt. Das beschriebene Protokoll ist eine Überlebensoperation, und die Tiere wurden schließlich durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Natriumpentobarbital nach Ablauf ihrer Zeitpunkte eingeschläfert.
1. Präoperative Vorbereitung
- Bereiten Sie mindestens zwei gezogene Glasnadeln für die Virusinjektion mit 3,5 nL Glaskapillarpipetten vor. eine Nadel für den DREADD und eine Nadel für den rCre. Bereiten Sie vorsichtshalber 4-5 Nadeln vor, falls sie intraoperativ brechen.
- Schneiden Sie mit e....
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Ergebnisse
Eine erfolgreiche Injektion und ein erfolgreicher Transport des viralen Vektors sollten zur Transduktion von einseitigen Neuronen im Rückenmark und im motorischen Kortex führen. Abbildung 4 zeigt die Markierung von CST-Neuronen der Schicht V im motorischen Kortex eines koronalen Hirnschnitts, der Cre-abhängige-DREADDs-mCherry exprimiert, die zusammen mit einer kontralateralen Wirbelsäuleninjektion von rCre injiziert wurden. Die Schnitte wurden mit dsRed-Antikörpern gefärbt.
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Diskussion
Die induzierbare genetische Modulation der Gehirnaktivität mit injizierbaren chemogenetischen Modifikatoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der verschiedenen Mechanismen, die der Genesung von Rückenmarksverletzungen zugrunde liegen. Die Genauigkeit des Targetings für die induzierbaren G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (DREADDs) wird weiter erhöht, wenn man bedenkt, dass die Fluoreszenzverfolgung die anatomische Präzision in der Histologie validiert. Dieser Artikel diskutiert eine zuverlässige Method.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Shriners Hospitals for Children SHC-84706 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| #11 Skalpellklingen | Roboz | RS-9801-11 | Zur Verwendung mit dem Skalpell. |
| #10 Skalpellklingen | Roboz | RS-9801-10 | Zur Verwendung mit dem Skalpell. |
| 1 mL Spritzen | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Für die Anästhesie-SC-Injektion und den Flüssigkeitsbolus |
| 4.0 Seidennaht | Ethicon | 771-683G | Für den Hautverschluss |
| 4.0 Chromic Catgut Naht | DemeTECH | NN374-16 | Zur erneuten Bindung des Muskels während des Verschlusses. |
| 48000 Mikropipette Anfaser | World Precision Instruments | 32416 | Wird verwendet, um die Spitzen der gezogenen Glaskapillarrohre abzuschrägen, um funktionelle Glasnadeln zu formen. |
| 5% Jodlösung | Purdue Products L.P. | L01020-08 | Zur Verwendung bei der Sterilisation des Operationsfeldes. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Zur Sterilisation von neu hergestellten Glasnadeln, Tiermodellen während der chirurgischen Vorbereitung |
| Ketamin (Ketaset) | Zoetis | 240048 | Um das Tier während der Operation in der richtigen Bewusstseinsebene zu halten. |
| Bead-Sterilisator | CellPoint | 5-1450 | Zur Wärmesterilisation von chirurgischen Instrumenten. |
| Digitalwaage | Okaus | REV.005 | Zum Wiegen des Tieres während der chirurgischen Vorbereitung. |
| Flexibler Nadelaufsatz | World Precision Instruments | MF34G-5 | Zum Reinigen von Glasnadeln und zum Befüllen von Glasnadeln mit rotem Öl. |
| Glaskapillarrohre | World Precision Instruments | 4878 | Für gezogene Glasnadeln - sollten für Nanoliter-Injektoren ausgelegt sein. |
| Hämostatika | Roboz | RS-7231 | Für den allgemeinen Gebrauch in der Chirurgie. |
| Gebogene Zange mit mittlerem Punkt | Roboz | RS-5136 | Für den allgemeinen Einsatz in der Chirurgie. |
| Mikromanipulator mit einer Nonius-Skala | Kanetec | N/A | Für präzises Zielen während der Operation. |
| Mikroschere | Roboz | RS-5621 | Zum Schneiden von Glasflüstern von frisch gezogenen Glaskapillarrohren. |
| Stereotaktisches Instrument nach Laborstandard | Stoelting | 51600 | Zum Halten des sterotaktischen Halters für Neugeborene |
| Laborstandard mit Maus & Neugeborenen-Adapter | 51615 | Für die Fixierung des Schädels von Neugeborenen bei Schädeloperationen und Wirbelsäuleninjektionen | |
| Mikroskop mit Licht und Nonius-Skala Okular | Leitz Wetzlar | N/A | Wird zur Visualisierung und Messung des Anfasens von gezogenen Glaskapillarrohren zu funktionsfähigen Glasnadeln verwendet. |
| Steuerung der MikroSpritzenpumpe | World Precision Instruments | 62403 | Zur Steuerung der Injektionsrate. |
| Nanoliter 2000 Pumpenkopf-Injektor | World Precision Instruments | 500150 | Zum kontrollierten Laden und Injizieren von Viren. |
| Nadelabzieher | Narishige | PC-100 | Zum Erhitzen und Auseinanderziehen von Glaskapillarrohren zu Glasnadeln. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu Labor | Cre-Plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (Plasmid #44361) | Bryan Roth' s Labor durch Addgene | DREADD Plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Zur Unterstützung beim Laden von Viren in den Nanoinjektor. |
| PrecisionGlide Nadeln (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Zur Verwendung mit den 1-ml- und 10-ml-Spritzen, um die Injektion des Tiermodells zu ermöglichen. |
| Rattenzahnzange | Roboz | RS-5152 | Zum Greifen von Dornfortsätzen. |
| Rotes Öl | N/A | N/A | Zur Bereitstellung einer Front für die Visualisierung von Viren, die während der Injektion in das Gewebe eindringen. |
| Retraktoren | Roboz | RS-6510 | Um die Operationswunde offen zu halten. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Zur Entfernung von Muskeln aus der Wirbelsäule während der Operation. |
| Skalpellklingengriff | Roboz | RS-9843 | Zum Aufschneiden der Haut und des Fettpolsters eines Tiermodells während der Operation. |
| Schere | Roboz | RS-5980 | Für den allgemeinen Einsatz in der Chirurgie. |
| Zange zum Entfernen von Klammern | Kent Scientific | INS750347 | Um die Klammern zu entfernen, wenn sie falsch angebracht wurden. |
| Steriles Tuch | Phenix Research Products | BP-989 | Um eine sterile Oberfläche für die Operation bereitzustellen. |
| Sterile Applikatoren mit Wattespitze | Puritan | 806-WC | Zum Aufsaugen von Blut in der Operationswunde unter Beibehaltung der Sterilität. |
| Sterile | Gaze Covidien | 2146 | Zur Reinigung des Operationsbereichs und der chirurgischen Instrumente unter Beibehaltung der Sterilität. |
| Sterile Kochsalzlösung | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | Zur Verwendung bei der Blutreinigung und zum Ersatz von Flüssigkeiten nach der Operation. |
| OP-Handschuhe | N/A | N/A | Zur Verwendung durch den Chirurgen, um ein steriles Feld während der Operation zu erhalten. |
| Chirurgisches Heizkissen | N/A | N/A | Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tiermodells während der Operation. |
| Operationsmikroskop | N/A | N/A | Zur besseren Visualisierung der Operationswunde. |
| Chirurgisches Klammergerät | Kent Scientific | INS750546 | Zum Auftragen der Klammern. |
| Wasser-Konvektions-Wärmekissen | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Für den Einsatz im postoperativen Erholungsbereich, um die Körpertemperatur des bewusstlosen Tieres aufrechtzuerhalten. |
| Gewichtete Haken | N/A | N/A | Zum Offenhalten der Operationswunde. |
| Flüssiger Verband | NewSkin | 985838 | Zum Anlegen entlang der Nähte nach einer Operation und zur Förderung der Wundheilung |
| Drahtkäfiglampe | ZooMed | LF10EC | Um Tieren zu helfen, sich von der Narkose zu erholen und die warme Körpertemperatur auf natürliche Weise zu halten |
Referenzen
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
