Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Summary

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Abstract

Die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3D EM) bietet die Möglichkeit, morphologische Parameter dendritischer Stacheln mit nanoskaliger Auflösung zu analysieren. Darüber hinaus können einige Merkmale der dendritischen Wirbelsäule, wie das Volumen der Wirbelsäule und die postsynaptische Dichte (PSD) (die den postsynaptischen Teil der Synapse darstellt), das Vorhandensein eines präsynaptischen Terminals und ein glattes endoplasmatisches Retikulum oder eine atypische Form der PSD (z. B. multiinnervierte Stacheln), nur mit 3D-EM beobachtet werden. Durch den Einsatz der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) ist es möglich, 3D-EM-Daten einfacher und reproduzierbarer zu erhalten als bei herkömmlichen seriellen Schnitten. Hier zeigen wir, wie man Hippocampusproben der Maus für die SBEM-Analyse vorbereitet und wie dieses Protokoll mit immunfluoreszenzuntersuchungen dendritischer Stacheln kombiniert werden kann. Die milde Fixierungsperfusion ermöglicht es uns, Immunfluoreszenzstudien mit Lichtmikroskopie an einer Hälfte des Gehirns durchzuführen, während die andere Hälfte für SBEM vorbereitet wurde. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der Tiere, die für die Studie verwendet werden sollen.

Introduction

Die meisten erregenden Synapsen im zentralen Nervensystem befinden sich auf dendritischen Stacheln - kleinen Vorsprüngen einer neuronalen Membran. Diese Vorsprünge bilden begrenzte biochemische Kompartimente, die die intrazelluläre Signaltransduktion steuern. Die strukturelle Plastizität von dendritischen Stacheln und Synapsen steht in engem Zusammenhang mit den funktionellen Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit, die so wichtigen Prozessen wie Lernen und Gedächtnis^{zugrunde liegen 1,2}. Es ist wichtig zu beachten, dass die Elektronenmikroskopie (EM) die einzige Technik ist, mit der festgestellt werden kann, ob eine dendritische Wirbelsäule einen präsynaptischen Eingang hat. Die EM-Auflösung ist auch erforderlich, um ultrastrukturelle Details wie die Form einer postsynaptischen Dichte (PSD), die einen postsynaptischen Teil einer Synapse darstellt, oder die Abmessungen einer dendritischen Wirbelsäule sowie die Größe und Form eines axonalen Boutons zu untersuchen. Darüber hinaus ist es mit EM möglich, Synapsen und ihre Umgebung zu visualisieren.

Dank der Fortschritte in der Bildgebung und Computertechnologie ist es möglich, ganze neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren. Volumenelektronenmikroskopische Techniken wie die serielle Transmissionselektronenmikroskopie (ssTEM), die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) und die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-REM) werden häufig für neuronale Schaltkreisrekonstruktionen verwendet³.

In unseren Studien wird die SBEM-Methode erfolgreich eingesetzt, um die strukturelle Plastizität von dendritischen Stacheln und PSDs in Proben des Maus-Hippocampus und organotypischer Hirnschnitte zu untersuchen ^4,5. Das SBEM basiert auf der Installation eines Miniatur-Ultramikrotoms in der Rasterelektronenmikroskopkammer^6,7,8,9. Die Oberseite des Probenblocks wird abgebildet, und dann wird die Probe in einer bestimmten Tiefe durch das Ultramikrotom geschnitten, wodurch eine neue Blockfläche frei wird, die erneut abgebildet wird und dann der Prozess wiederholt wird⁸. Dadurch bleibt nur das Bild einer Blockfläche übrig, während die geschnittene Scheibe als Schutt verloren geht. Aus diesem Grund wird SBEM als destruktive Technik bezeichnet, was bedeutet, dass es nicht möglich ist, denselben Ort erneut abbilden zu können. Der Vorteil der destruktiven On-Block-Methoden besteht jedoch darin, dass sie nicht unter Warping-Problemen und Abschnittsverlusten leiden, die die Datenqualität und die Datenanalyse erheblich beeinträchtigen können³. Darüber hinaus bietet SBEM die Möglichkeit, ein relativ großes Sichtfeld ( > 0,5 mm × 0,5 mm) mit hoher Auflösung^{3 abbilden.}

Um SBEM einsetzen zu können, müssen Proben aufgrund des rückgestreuten Elektronendetektors, der für die Bildaufnahme verwendet wird, nach einem dedizierten, kontrastreichen Protokoll vorbereitet werden. Wir zeigen hier, wie die Probenvorbereitung nach dem Protokoll durchgeführt wird, das auf einem von Deerinck¹⁰ (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) -Methode) entwickelten Verfahren basiert, wobei reduzierte Osmium-Thiocarbohydrazid-Osmium (rOTO) -Flecken verwendet^werden,die in den 1980er Jahren entwickelt wurden⁸,¹¹. Darüber hinaus führen wir einen zweistufigen Fixierungsansatz mit leichter Fixierungsperfusion ein, der es ermöglicht, dasselbe Gehirn sowohl für Immunfluoreszenzstudien mit Lichtmikroskopie als auch sbEM zu verwenden.

Im Protokoll wird ein Mausgehirn hauptsächlich mit einem milden Fixiermittel fixiert und dann in Zwei hälften geschnitten, und eine Hemisphäre wird postfixiert und für Immunfluoreszenz (IF) vorbereitet, während die andere für EM-Studien vorbereitet wird (Abbildung 1).

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Workflows für die dendritischen Stacheln Vorbereitung für die Analyse mit SBEM. Mäuse wurden geopfert und mit einem milden primären Fixiermittel durchtränkt. Das Gehirn wurde in Zwei hälften geschnitten, und eine Hemisphäre wurde mit Immunfluoreszenz (IF) -dediziertem Fixiermittel postfixiert, kryogeschützt, mit einem Kryostaten geschnitten und für IF-Studien verarbeitet, während die andere Hemisphäre mit EM-Fixiermitteln postfixiert, mit dem Vibratom geschnitten und für EM-Studien vorbereitet wurde. Gehirnschnitte für SBEM-Studien wurden kontrastiert, flach in Harz eingebettet, dann wurde eine CA1-Region des Hippocampus am Pin montiert und mit SBEM abgebildet (Abbildung 1). Der Teil des Protokolls, der in einem gelben Kasten hervorgehoben ist, wurde im Video gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Nencki-Instituts und der Genehmigung des Lokalen Ethikkomitees durchgeführt. Die Studien wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG), dem polnischen Tierschutzgesetz, durchgeführt und von der ersten lokalen Ethikkommission in Warschau genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren.

ACHTUNG: Alle unten beschriebenen Verfahren müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit der verwendeten Reagenzien. Persönliche Sicherheitsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille und eine Gesichtsmaske sind erforderlich.

1. Herstellung des Fixiermittels für die Perfusion (2 % gew/vol Paraformaldehyd (PFA) und 0,5 % vol/vol Glutaraldehyd (GA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,4)

HINWEIS: Bereiten Sie die Fixierlösung am selben Tag vor, an dem sie verwendet wird, und lagern Sie sie nicht länger als 3 Stunden. Bei Zeitmangel am Vortag 2% PFA in 0,1 M PB zubereiten, bei 4 °C lagern und kurz vor der Perfusion frisches GA hinzufügen.

1. Nehmen Sie 400 ml steriles doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) und erhitzen Sie es mit einer Rührplatte auf 60 °C. Dann fügen Sie 20 g PFA hinzu. Fügen Sie Tropfen von 1 M NaOH hinzu, bis PFA vollständig gelöst ist, und lassen Sie die Mischung abkühlen.
2. Fügen Sie 500 ml 0,2 M PB (pH 7,4) hinzu.
3. Filtern Sie die Lösung, um eventuelle Ablagerungen zu entfernen und kühlen Sie sie auf 4 °C ab.
4. Kurz vor der Perfusion 20 ml 25% GA in die Lösung geben und dann das Volumen mit ddH₂O auf 1 L auffüllen.

2. Herstellung von Postperfusionsfixiermitteln für SBEM (2% wt/vol PFA und 2,5% vol/vol GA in 0,1 M PB, pH 7,4)

1. Nehmen Sie 50 ml des Fixiermittels zur Perfusion (2% PFA und 0,5% GA in 0,1 M PB).
2. Fügen Sie 5 ml 25% GA hinzu.

3. Herstellung von Postperfusionsfixiermittel für die IF-Färbung (4% PFA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS))

1. Eine Tablette mit 1x PBS (pH 7,4) in einem gereinigten und entionisierten Wasser_(H2O) gemäß den Anweisungen des Herstellers auflösen.
2. Verwenden Sie eine Rührplatte, um die Lösung auf 60 °C zu erhitzen und fügen Sie 40 g PFA hinzu.
3. Fügen Sie Tropfen von 1 M NaOH hinzu, bis das PFA vollständig gelöst ist, und lassen Sie die Mischung abkühlen.
4. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,5 mit 1 M HCl ein und beladen Sie dann das Volumen mit H₂O auf 1 L.
5. Filtern Sie die Lösung, um Ablagerungen zu entfernen.

4. Transkardiale Perfusion von Tieren

HINWEIS: Alle PFA- und GA-Abfälle müssen gemäß den lokalen Vorschriften gesammelt und zur Entsorgung gelagert werden. Anästhesie und Perfusion sollten den lokalen Vorschriften folgen. In dem beschriebenen Protokoll wurden erwachsene 3 Monate alte und 20±1 Monate alte weibliche Thy1-GFP(M)-Mäuse (Thy1-GFP ^+/-)12 exprimierendes grünes Fluoreszenzprotein (GFP) in einer spärlich verteilten Population glutamaterger Neuronen verwendet, aber auch jedes andere kann verwendet werden. Die Tiere wurden als Heterozygoten mit dem C57BL/6J-Hintergrund im Tierhaus des Nencki Institute of Experimental Biology gezüchtet.

1. Vor der Perfusion eine Maus durch Verabreichung einer Ketamin/Xylazin-Mischung (bis zu 90 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin) mittels intraperitonealer Injektion (27-Gauge-Nadel) betäuben.
   1. Beurteilen Sie, ob die Tiefe der Anästhesie ausreichend ist, indem Sie den Reflex auf Schmerzreize (Kneifen) und den Hornhautreflex (Schielen) überprüfen.
2. Nach 20 Minuten führen Sie eine intraperitoneale Injektion (27-Gauge-Nadel) von Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) durch.
3. Perfusionsen einer Maus nach einem perfusionschirurgischen Protokoll, das von Gage et al.¹³ beschrieben wird (siehe Punkt 4; Abbildung 5-6). Beginnen Sie mit einer Perfusionspumpe mit einem 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 (30 ml) für 3 Minuten und fahren Sie mit 2% PFA und 0,5% GA in 0,1 M PB, pH 7,4 für 6 Minuten (80 ml) fort.
   1. Sezieren Sie das Gehirn vorsichtig vom Schädel und teilen Sie es in zwei Hälften (siehe Abbildung 9-10 in Gage et al., 2012¹³). Legen Sie ein Stück in eine Durchstechflasche, die Fixiermittel für SBEM enthält, und das zweite in die Durchstechflasche mit 4% PFA / PBS für die IF-Färbung.
   2. Halten Sie die Hemisphären über Nacht bei 4 °C im Fixiermittel.

5. Gehirnschnitte Vorbereitung für die Elektronenmikroskopie

1. Wählen Sie die Vibrationseinstellungen (Klingenverfahrgeschwindigkeit: 0,075 mm/s, Schnittfrequenz: 80 Hz).
2. Legen Sie die Scheibenkammer in die Halterung, befestigen Sie sie am Vibratom und umgeben Sie sie mit Eis. Legen Sie dann eine Rasierklinge in den Vibratom-Klingenhalter.
3. Verwenden Sie einen Löffel oder ein ähnliches Objekt und legen Sie das gekühlte Gehirn (dorsale Oberfläche nach oben) auf eine harte Schnittfläche (z. B. einen Glasdeckel der Petrischale). Um eine koronale Scheibe des Hippocampus vorzubereiten, machen Sie einen senkrechten Schnitt zwischen der Gehirnhemisphäre und dem Kleinhirn mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell und entfernen Sie so das Kleinhirn. Der Riechkolben kann auch entfernt werden.
4. Tragen Sie Cyanacrylatkleber auf die trockene Plattform des Vibratoms auf.
5. Nehmen Sie das Gehirn mit einer Zette auf und trocknen Sie es vorsichtig auf Filterpapier.
6. Kleben Sie die Halbkugel mit der Rostralspitze nach oben auf die Plattform in der Nähe der Schneidklinge. Befestigen Sie die Plattform an der Halterung und füllen Sie sie sofort mit eiskalten 0,1 M PB, pH 7,4. Wenn der senkrechte Schnitt richtig gemacht wird, steht die Hemisphäre gerade nach oben und bietet einen Winkel von 90 °, der für einen symmetrischen koronalen Schnitt mit dem Hippocampus erforderlich ist. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn mit PB bedeckt ist.
7. Positionieren Sie die Vibratomklinge vor der Hemisphäre und senken Sie sie auf die koronale Seite der Hemisphäre. Senken Sie die Klinge in kaudaler Richtung weiter auf 400 μm und beginnen Sie mit dem Schneiden. Schneiden Sie weiter, bis die ersten beiden Scheiben vollständig vom Gewebeblock getrennt sind.
8. Ziehen Sie die Klinge ein und senken Sie weitere 100 μm, dann schneiden Sie sie erneut.
9. Wenn der Hippocampus sichtbar wird (verwenden Sie den Maus-Hirnatlas Paxinos und Franklin, 2004¹⁴), sammeln Sie die Scheiben mit dem kleinen Pinsel oder der verbreiterten Pasteur-Pipette aus Kunststoff.
10. Die Scheiben in eine 12-Well-Platte geben, die mit kaltem 0,1 M PB, pH 7,4 gefüllt ist.
11. Sezieren Sie den Hippocampus in einer mit 0,1 M PB, pH 7,4 gefüllten Glas-Petrischale mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell und legen Sie ihn in Glasfläschchen mit dem gleichen Phosphatpuffer.
    HINWEIS: Zur Langzeitlagerung der Scheiben 0,1 M PB mit 0,05% Natriumazid_(NaN3)ergänzen.

6. Hirnprobenvorbereitung zur Immunfärbung

1. Nach der Fixierung über Nacht in 4% PFA/PBS-Lösung in einem Abzug das Hirngewebe in die Kryokonservierungslösung (30% Saccharose in PBS mit 0,05%_NaN3)geben und bei 4 °C für 2 Tage (bis zum Versenken) aufbewahren.
2. Bereiten Sie eine Frostschutzlösung (15% Saccharose / 30% Ethylenglykol / 0,05% NaN₃/ PBS) vor.
3. Stellen Sie die Schranktemperatur des Kryostaten auf -19 °C ein und stellen Sie sicher, dass die Temperatur erreicht ist, bevor Sie fortfahren. Achten Sie beim Schnitten darauf, dass die Schranktemperatur zwischen -18 °C und -20 °C bleibt.
4. Verwenden Sie einen Löffel oder ein ähnliches Objekt und legen Sie das gekühlte Gehirn (dorsale Oberfläche nach oben) auf eine harte Schnittfläche (z. B. einen Glasdeckel der Petrischale). Um eine koronale Scheibe des Hippocampus vorzubereiten, machen Sie einen senkrechten Schnitt zwischen der Gehirnhemisphäre und dem Kleinhirn mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell und entfernen Sie so das Kleinhirn.
5. Wählen Sie eine vorgekühlte Probenscheibe, bedecken Sie sie mit einem Medium zum Einfrieren auf einem Befreiendegal und befestigen Sie die Hemisphäre mit einer Rostralspitze nach oben an der Scheibe und warten Sie, bis die Probe vollständig eingefroren ist. Legen Sie die Probenscheibe in einen Probenkopf ein.
6. Setzen Sie eine Klinge in einen Klingenhalter in der Kryokammer ein und schneiden Sie 40 μm dicke Scheiben.
7. Die Scheiben mit einem kleinen Pinsel auf die mit kalter Frostschutzlösung gefüllte 96-Well-Platte geben und die Abschnitte vorsichtig abrollen (nach jeder Runde schneiden eine Scheibe sammeln, um zu verhindern, dass sie in der Scheibenkammer verloren gehen).
   HINWEIS: Gehirne oder Abschnitte können lange Zeit in einer Frostschutzlösung bei -20 °C gelagert werden.

7. Immunfärbung von Hirnscheiben

HINWEIS: Alle Färbeschritte wurden in einer 24-Well-Platte auf einem Plattform-Shaker durchgeführt.

1. Waschen Sie die Scheiben dreimal mit PBS, jedes Mal für 6 Minuten.
2. Inkubieren Sie die Scheiben in 300 μL Blocklösung (5% normales Eselserum (NDS)/0,3% Triton X-100) für 1 Stunde mit sanftem Schütteln auf einem Rotator.
3. Die Scheiben werden mit dem primären Antikörper gegen PSD-95, verdünnt 1:500 in 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 μL pro Vertiefung), über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Endkonzentration des primären Antikörpers beträgt 2 μg/ml.
4. Waschen Sie die Scheiben dreimal mit 0,3% Triton X-100/PBS bei Raumtemperatur (RT), jeweils 6 Minuten lang.
5. Inkubieren Sie die Scheiben mit dem sekundären Antikörper, der 1:500 in 300 μL 0,3% Triton X-100/PBS verdünnt ist, für 90 Minuten. Die Endkonzentration des sekundären Antikörpers beträgt 4 μg /ml.
6. Waschen Sie die Scheiben dreimal mit PBS, jedes Mal für 6 Minuten.
7. Montieren Sie die Scheiben mit einem Montagemedium auf Dias und schließen Sie sie dann mit einem Abdeckschieber.
8. Untersuchen Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop (63 × Ölobjektiv, NA 1,4, Pixelgröße 0,13 μm × 0,13 μm).
   HINWEIS: Für die Langzeitlagerung: Bewahren Sie die Proben bei 4 °C auf, schützen Sie sie vor Licht.

8. SBEM-Probenvorbereitung

ACHTUNG: Aufgrund der Gefährlichkeit der verwendeten Reagenzien müssen alle unten beschriebenen Verfahren in einem Laborabzug durchgeführt werden. Bevor Sie diese Chemikalien verwenden, lesen Sie sorgfältig die von den Herstellern bereitgestellten Sicherheitsdatenblätter und fragen Sie den Sicherheitsbeauftragten nach den lokalen Regeln, um eine sichere Handhabung und Abfallentsorgung zu gewährleisten.

1. Beispielkontrast
   HINWEIS: Scheibenwaschungen und inkubation bei Raumtemperatur sollten mit leichtem Schütteln (z. B. auf einem Plattformstreuer) durchgeführt werden. Autoklaven entgastes Wasser wurde verwendet.
   1. Waschen Sie die Scheiben mit kaltem 0,1 M PB, pH 7,4 fünfmal, jedes Mal für 3 Minuten.
   2. Bereiten Sie eine 1:1-Mischung aus 4% wässrigem Osmiumtetroxid und 3% Kaliumferrocyanid (1:1 vol) vor. Das Endprodukt wird braun. Tauchen Sie die Proben in diese Mischung, legen Sie sie auf Eis und ab diesem Stadium ist es wichtig, sie vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie sie mit sanftem Schütteln für 1 Stunde.
   3. In der Zwischenzeit eine Thiocarbohydrazid (TCH) -Lösung vorbereiten. 10 mL doppelt destilliertes_H2O (ddH₂O) und 0,1 g TCH mischen und 1 Stunde in einen bei 60 °C eingestellten Ofen geben. Es ist wichtig, die Lösung von Zeit zu Zeit zu schwenken (z. B. alle 10 Minuten). Wenn Sie fertig sind, kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab.
   4. Waschen Sie die Scheiben fünfmal mit ddH₂O, jedes Mal für 3 Minuten.
   5. Filtern Sie TCH-Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenfilter und tauchen Sie die Probe in gefilterte Lösung. Die Scheiben werden schwarz. Inkubieren Sie sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Waschen Sie die Proben fünfmal mit ddH₂O, jedes Mal für 3 Minuten.
   7. Inkubieren Sie die Proben mit einer 2% igen wässrigen Lösung von OsO₄ für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
   8. Waschen Sie die Proben fünfmal mit ddH₂O, jedes Mal für 3 Minuten.
   9. Die Proben in gefiltertes 1% wässriges Uranylacetat geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Verwenden Sie einen 0,22 μm Spritzenfilter für die Filtration.
   10. Bereiten Sie L-Asparaginsäurelösung vor, indem Sie 0,4 g L-Asparaginsäure und 80 ml ddH₂O mischen, den pH-Wert auf 3,8 einstellen, um das Auflösen zu erleichtern, und dann mit Wasser auf 100 ml aufladen.
   11. Beginnen Sie am nächsten Tag mit Waltons Lead Aspartate¹⁵ Vorbereitung. 0,066 g Bleinitrat mit 10 ml L-Asparaginsäurelösung (Nummer 8.1.10) vorgewärmt auf 60 °C mischen und den pH-Wert auf 5,5 (gemessen bei 60 °C) mit 1 M NaOH einstellen. Die Durchstechflasche mit Bleiaspartat verschließen und bei 60 °C 30 Minuten in einem Wasserbad stehen lassen. Die Lösung sollte klar sein. Wenn es bewölkt wird, muss es verworfen und ein neues vorbereitet werden.
   12. In der Zwischenzeit die Proben fünfmal, jeweils 3 Minuten lang, mit entgastem ddH_2Owaschen. Anschließend 30 Minuten im Ofen bei 60 °C eingestellt aufbewahren.
   13. Tauchen Sie die Proben in die frisch zubereitete Bleiaspartatlösung und ubatieren Sie sie 20 Minuten lang im Bei 60 °C eingestellten Ofen.
   14. Waschen Sie die Proben fünfmal mit entgastem ddH₂O, jeweils für 3 Minuten.
2. Dehydratisierung und Harzeinbettung
   1. Bereiten Sie Epoxidharz vor. Wiegen Sie die Zutaten (33,3 g Komponente A/M, 33,3 g Komponente B und 1 g Komponente D) und mischen Sie das Harz mindestens 30 Minuten lang gut (z. B. auf einem Rotationsschüttler in einem 15-ml-Röhrchen schütteln), bevor Sie 16 Tropfen Beschleuniger DMP 30 hinzufügen. Weitere 10 Minuten umrühren.
      HINWEIS: Wiegen Sie die Zutaten unter dem Abzug. Diese Menge an Komponenten ergibt etwa 60 ml Harz, was für 15 Fläschchen mit Proben ausreicht. Sie können weniger vorbereiten oder den Rest des Harzes in einer Spritze bei 4 °C lagern und am nächsten Tag verwenden. Denken Sie daran, die Spitze der Spritze zu versiegeln.
   2. Durchstechflaschen mit abgestuften Ethanolverdünnungen (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% Ethanol in Wasser und 100% auf einem Molekularsieb getrocknet) vorbereiten.
   3. Mischen Sie das Harz mit 100% Ethanol im Verhältnis 1:1, um 50% Harz zu erhalten. Mischen Sie es gut.
   4. Die Proben werden für 5 Minuten in jeder Ethanolverdünnung ab 30% getrocknet und endend mit 100% wasserfreiem Ethanol, das auf Molekularsieb getrocknet wird, getrocknet. Denken Sie daran, dass die Proben niemals vollständig trocknen dürfen.
   5. Infiltrieren Sie die Proben zuerst in 50% Harz für 30 Minuten, dann in 100% Harz für eine Stunde und dann wieder in 100% Harz über Nacht. Führen Sie alle Infiltrationsschritte mit konstantem langsamem Schütteln durch.
   6. Am nächsten Tag legen Sie die Proben für eine Stunde in frisches 100% Harz und betten sie dann zwischen Fluorpolymer-Einbettungsplatten ein. Entfetten Sie Stücke der Einbettungsplatte mit Ethanol und betten Sie die Proben flach zwischen zwei Schichten ein, wobei zwei Glasobjektträger als Unterstützung verwendet werden. Versuchen Sie, Luftblasen in Harz auf oder in der Nähe der Probe zu vermeiden.
   7. Die Proben im Ofen bei 70 °C mindestens 48 Stunden aushärten.
3. Trimmen und Montieren
   1. Trennen Sie die Einbettungsblätter und schneiden Sie ein Stück der eingebetteten Probe (ca. 1 mm x 1 mm) mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie es auf einen Parafilm. Dadurch wird die Gefahr minimiert, dass die Probe aufgrund von Elektrostatik verloren geht.
   2. Nehmen Sie einen Aluminiumstift, der mit Ethanol entfettet wurde. Mischen Sie ein leitfähiges Epoxidharz gut und verwenden Sie eine kleine Menge davon, um die Probe am Stift zu befestigen. Härten Sie leitfähiges Epoxidharz bei 70 °C für 10 Minuten aus.
   3. Schneiden Sie jede Seite des Probenblocks mit dem Diamantmesser ab und polieren Sie dann die Vorderseite des Blocks, bis das Gewebe freigelegt ist.
      HINWEIS: Bestätigen Sie in diesem Schritt das Vorhandensein einer Region von Interesse, indem Sie einige Abschnitte sammeln und toluidinblaue^{Färbung 16} durchführen oder unter dem Elektronenmikroskop überprüfen.
   4. Reduzieren Sie die Größe der Probe so weit wie möglich. Anschließend die Probe mit leitfähiger Farbe auf den Stift einmahlen und aushärten (24 Stunden bei Raumtemperatur oder im Ofen bei 65 °C für 40 Minuten).
   5. Um Ladeartefakte zu minimieren, beschichten Sie die Proben mit einer dünnen Schicht Gold oder Gold / Palladium.

9. SBEM-Bildgebung

1. Legen Sie den Stift mit einer Probe in die Kammer des seriellen Rasterelektronenmikroskops. Richten Sie die Probe am Messer aus. Schließen Sie die Kammer und stellen Sie die Parameter ein.
2. Sammeln Sie einen Stapel bilder mit der gewünschten Vergrößerung, Pixelgröße, Slice-Dicke, beschleunigter Spannung (EHT), Blende, Druck usw.
   HINWEIS: Die Parameter hängen von der Probe und dem Ziel des Experiments ab. Beispielhafte erste Bildgebungseinstellungen sind in der Materialtabelle enthalten.

10.3D Rekonstruktionen

HINWEIS: Für die unten genannten Schritte verwenden wir Open-Access-Software wie z.B. FijiJ¹⁷ (ImageJ Version 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)¹⁸ und Reconstruct^19, aber es können verschiedene andere Software verwendet werden.

1. Konvertieren Sie digitale Mikrographendateien (dm) in das TIFF-Format. Importieren Sie zuerst die Bildsequenz (in FijiJ: File > Import > Image sequence > Choose 8 Bit Format) und speichern Sie sie dann als TIFF (in FijiJ: File > Save As > Image Sequence > Choose Tiff).
2. Passen Sie Helligkeit und Kontrast des Bildstapels an (in FijiJ: Bild > passen Sie > Helligkeit / Kontrast an) und denoise es bei Bedarf (verwenden Sie das DenoisEM-Plugin für FijJ^20: Plugins > DenoiseEM > Denoise).
3. Richten Sie den Stack aus (in FijiJ: Plugins > StagReg oder MIB: Dataset > Alignment Tools).
4. Segment dendritische Stacheln und Synapsen (In der MIB- oder Reconstruct-Software stehen umfassende Tutorials zur Verfügung (Siehe Materialtabelle für Details).

Results

Mit der oben beschriebenen Methode können kontrastreiche Bilder des Gehirngewebes der Maus mit guter Auflösung erhalten werden. Ein großes Sichtfeld, das die SBEM-Technik bietet, ermöglicht die präzise Auswahl der region von Interesse. Das große Bild der CA1-Region des Hippocampus wurde aufgenommen, um die Länge des Stratum radiatum (SR) zu messen (Abbildung 2A) und die Bildgebung genau in der Mitte einzustellen (Abbildung 2B). Als nächstes wurde der Bi...

Discussion

Es gibt viele Variationen der primären NCMIR-Methode, die von Deerinck im Jahr 2010 beschrieben wurde¹⁰. Die Grundprinzipien bleiben gleich, aber je nach Art des untersuchten Materials werden geringfügige Änderungen umgesetzt. Es wurde bereits beschrieben, dass verschiedene Harze verwendet werden können, um Proben für SBEM einzubetten, und zum Beispiel im Falle von Pflanzen ist Spurr's aufgrund seiner niedrigen Viskosität, die eine bessere Infiltration durch die Zellwände ermöglicht, das Harz der ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anästhetikum:
Ketamin/Xylazin-Mischung (Ketamina / Sedazin)	Biowet Pulawy, Pulawy, Polen
Natrium-Pentobarbital (Morbital)	Biowet Pulawy, Pulawy, Polen
Fixiermittel:
Glutaraldehyd (GA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	G5882	Grade I, 25% in H2O, speziell gereinigt für den Einsatz als Elektronenmikroskopie-Fixiermittel
Salzsäure (HCl)	POCH, Gliwice, Polen	575283115	rein p.a.
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	441244	geprillt, 95%
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P4417-50TAB	Tabletten
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	Reagenzqualität, 98%, Pellets (
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3264
Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3139
Perfusion:
Groß stumpf/stumpf gebogen Schere (~14,5 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14519-14
Mikrospatel (doppelte 2" flache Enden, eines abgerundet, eines verjüngt auf 1/8")	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10091-12
Nadelspitze, 15 GA, stumpf (Perfusionsnadel)	KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Deutschland	KD-FINE 900413	1,80 x 40 mm
feine (Graefe) Pinzetten	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11050-10
Perfusionspumpe	Lead Fluid	BQ80S
Kunststofffläschchen	Profilab, Warschau, Polen	534.02	Kunststofffläschchen mit blauer Kappe zur Gewebeaufbewahrung, 20 ml, 31 x 48 mm
Gerade Irisschere (~9 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14058-11
Vorbereitung von Gehirnschnitten für EM: strong>12-Well-Platte
	NEST, Rahway, NJ, USA	712001
Cyanoacryl-Kleber	Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glasfläschchen	Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA	72632	20 ml Szintillationsfläschchen, eine Packung mit 100
Stück Pasteurpipette	VWR, Radnor, PA, USA	612-4545	LDPE, Einweg, 7,5 ml
Rasierklinge	Wilkinson Sword, London, UK		Klassische zweischneidige Sicherheitsrasierklingen
Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, UK	Nr. 20
Vibratome	Leica Microsystems, Wien, Österreich	Leica VT1000 S
Brain-Scheiben Vorbereitung für IF:
96-Well-Platte	NEST, Rahway, NJ, USA	701101
Criostat	Leica Microsystems, Wien, Österreich	Leica CM 1950
Ethylenglykol	Bioshop, Burlington, Kanada	ETH001
Einwegklinge mit niedrigem Profil 819	Leica Biosystems Inc., USA	14035838925
Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, UK	Nr. 20
Natriumazid (NaN3)	POCH, Gliwice, Polen	792770426
Saccharose	POCH, Gliwice, Polen	772090110
Einfriermedium für die Kryosektion, OCT-Compound	Leica Biosystems, Schweiz	14020108926
Immunfärbung: 24-Well-Platte
	NEST, Rahway, NJ, USA	702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antikörper	Merck-Millipore, Burlington, MA, USA	MAB1598
Konfokalmikroskop	Zeiss, Gö ttingen, Deutschland		Zeiss Spinning Disc Mikroskop (63 x Ölobjektiv, NA 1,4, Pixelgröße 0,13 & Mikro; m & times; 0,13 & Mikro; m)
Deckobjektträger	Menzel Glaser, Braunschweig, Deutschland	B-1231	24 x 60 mm
Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	A31570
Fluormount-G Eindeckmedium, mit DAPI	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	00-4959-52
Objektträger	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	AGAA00008	SuperFrost
Normales Eselserum (NDS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA	017-000-121
Shaker	JWElectronic, Warschau, Polen	KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop	, Burlington, Kanada	TRX506
Elektronenmikroskopische Probenvorbereitung
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat	POCH, Gliwice, Polen	746980113
Aclar 33C Film	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	50425	Fluorpolymer-Filmeinbettungsblatt
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	T58203	Epoxid-Einbettmedium-Beschleuniger
Durcupan ACM Einzelkomponente A, M	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44611	Durcupan ACM Einkomponenten-A, M Epoxidharz
Durcupan ACM Einkomponenten-B	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44612	Durcupan ACM Einkomponenten-B, Härter 964
Durcupan ACM Einkomponenten-D	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44614	Durcupan ACM Einkomponenten-D, Weichmacher
Ethylalkohol absolut	POCH, Gliwice, Polen	64-17-5	Ethylalkohol absolut 99,8 % rein P.A.-BASIC
Genlab Laborofen	Wolflabs, York, UK	Mino/18/SS	Ofen Genlab MINO/18/SS 18l Volumen, keine Lüfterumwälzung, keine Digitalanzeige, Standard-Temperaturgradient, Standard-Rückgewinnungsrate, kein Timer, 250°; C maximale Temperatur, 240V Stromversorgung
L-Asparaginsäure	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	A-9256	Reagenzqualität, 98% (HPLC)
Blei (II)-nitrat	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	467790	99,95% Spurenmetalle Basis
Osmiumtetroxid	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	75632	für die Elektronenmikroskopie, 4% in H2O pH-Messgerät
	Elmetron, Zabrze, Polen	CP-5-5
Rotator	BioSan, Jó zefó w, Polen	Multi Bio RS-24	Rotator Multi Bio RS-24
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	Reagenzqualität, 98%, Pellets (wasserfrei)
Sonnenblumen-Mini-Shaker	Grant bio, Shepreth,UK	PD-3D
Spritzenfilter	Millipore, Burlington, MA, USA	SLGP033NB	0,22 &Mikro; m Porengröße
Thiocarbohydrazid	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	88535	purum p.a., für die Elektronenmikroskopie, 99,0% (N)
Uranylacetat	Serva, Heidelberg, Deutschland	77870	Uranylacetat&Middot; 2H2O, Wasserbad für Forschungszwecke
	WSL, Swietochlowice, Polen	LWT
Probenaufnahme für SBEM
96-Well-Kulturplatte	VWR, Radnor, PA, USA	734-2782	96-Well-Platten, runder Boden, unbehandelt
AM Gatan 3View Pinzette für die Handhabung	Micro to Nano, Haarlem, Niederlande Niederlande	50-001521
Binokular	OPTA-TECH, Warschau, Polen	X2000
Leitfähiger Kleber	Chemtronics, Georgia, USA	CW2400	Leitfähiger Kleber
Gatan 3View Probe Pin Stubs	Micro to Nano, Haarlem, Niederlande Niederlande	10-006003
Parafilm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	P7793	Rollengröße 20  in. &mal; 50  ft
Pelco leitfähige Silberfarbe	Ted Pella, Redding, CA, USA	16062-15	PELCO®   Leitfähige Silberfarbe, 15g
Rasierklingen doppelschneidig	Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA	72000	Edelstahl "PTFE" beschichtet. PERSONNA Marke .004" dick, einzeln verpackt, 250 Klingen in einer Schachtel.
Rasterelektronenmikroskop	Zeiss, Oberkochen, Deutschland		Sigma VP mit Gatan 3View2 Kammer, Beschleunigungsspannung 2,5 kV, variabler Druck 5 Pa, Apertur 20 & Mikro; m, Verweildauer 6 µ s, Schichtdicke 60 nm, Vergrößerung 15 000 x, Bildauflösung 2048 x 2048 Pixel, Pixelgröße 7,3 nm
Beschnitt 90°; Diamantmesser	Diatome Ltd., Nidau, Schweiz	DTB90
Ultramikrotom	Leica Microsystems, Wien, Österreich	Leica ultracutR
Software	Webseite		Tutorials
FidschiJ	https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser	http://mib.helsinki.fi/		http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct	https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0		https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Tiere
Mäuse	Erwachsener 3 Monate alt und  20± 1  Monat alt  weiblich  Thy1-GFP(M)-Mäuse (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000), die GFP in einer spärlich verteilten Population von glutamatergen Neuronen exprimieren. Die Tiere wurden als Heterozygoten mit dem C57BL/6J-Hintergrund im Tierhaus des Nencki Institute of Experimental Biology gezüchtet.