Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.
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Methodenartikel
Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3D EM) bietet die Möglichkeit, morphologische Parameter dendritischer Stacheln mit nanoskaliger Auflösung zu analysieren. Darüber hinaus können einige Merkmale der dendritischen Wirbelsäule, wie das Volumen der Wirbelsäule und die postsynaptische Dichte (PSD) (die den postsynaptischen Teil der Synapse darstellt), das Vorhandensein eines präsynaptischen Terminals und ein glattes endoplasmatisches Retikulum oder eine atypische Form der PSD (z. B. multiinnervierte Stacheln), nur mit 3D-EM beobachtet werden. Durch den Einsatz der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) ist es möglich, 3D-EM-Daten einfacher und reproduzierbarer zu erhalten als bei herkömmlichen seriellen Schnitten. Hier zeigen wir, wie man Hippocampusproben der Maus für die SBEM-Analyse vorbereitet und wie dieses Protokoll mit immunfluoreszenzuntersuchungen dendritischer Stacheln kombiniert werden kann. Die milde Fixierungsperfusion ermöglicht es uns, Immunfluoreszenzstudien mit Lichtmikroskopie an einer Hälfte des Gehirns durchzuführen, während die andere Hälfte für SBEM vorbereitet wurde. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der Tiere, die für die Studie verwendet werden sollen.
Einleitung
Die meisten erregenden Synapsen im zentralen Nervensystem befinden sich auf dendritischen Stacheln - kleinen Vorsprüngen einer neuronalen Membran. Diese Vorsprünge bilden begrenzte biochemische Kompartimente, die die intrazelluläre Signaltransduktion steuern. Die strukturelle Plastizität von dendritischen Stacheln und Synapsen steht in engem Zusammenhang mit den funktionellen Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit, die so wichtigen Prozessen wie Lernen und Gedächtniszugrunde liegen 1,2. Es ist wichtig zu beachten, dass die Elektronenmikroskopie (EM) die einzige Technik ist, mit der festgestellt werden kann....
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Protokoll
Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Nencki-Instituts und der Genehmigung des Lokalen Ethikkomitees durchgeführt. Die Studien wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG), dem polnischen Tierschutzgesetz, durchgeführt und von der ersten lokalen Ethikkommission in Warschau genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren.
ACHTUNG: Alle unten beschriebenen Verfahren müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit der verwendeten Reagenzien. Persö....
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Ergebnisse
Mit der oben beschriebenen Methode können kontrastreiche Bilder des Gehirngewebes der Maus mit guter Auflösung erhalten werden. Ein großes Sichtfeld, das die SBEM-Technik bietet, ermöglicht die präzise Auswahl der region von Interesse. Das große Bild der CA1-Region des Hippocampus wurde aufgenommen, um die Länge des Stratum radiatum (SR) zu messen (Abbildung 2A) und die Bildgebung genau in der Mitte einzustellen (Abbildung 2B). Als nächstes wurde der Bi.......
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Diskussion
Es gibt viele Variationen der primären NCMIR-Methode, die von Deerinck im Jahr 2010 beschrieben wurde10. Die Grundprinzipien bleiben gleich, aber je nach Art des untersuchten Materials werden geringfügige Änderungen umgesetzt. Es wurde bereits beschrieben, dass verschiedene Harze verwendet werden können, um Proben für SBEM einzubetten, und zum Beispiel im Falle von Pflanzen ist Spurr's aufgrund seiner niedrigen Viskosität, die eine bessere Infiltration durch die Zellwände ermöglicht, das Harz der .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
SBEM-Bildgebung, Lichtmikroskopie-Bildgebung und elektronenmikroskopische Probenvorbereitung wurden mit den Geräten des Laboratory of Imaging Tissue and Function durchgeführt, das als bildgebende Kerneinrichtung am Nencki Institute of Experimental Biology dient.
Zur Vorbereitung von Abbildung 1 wurde das Bild einer Maus (Souris_02) und eine Durchstechflasche aus dem https://smart.servier.com/ verwendet.
Diese Arbeit wurde durch das Grant Opus des Nationalen Wissenschaftszentrums (Polen) (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) unterstützt, das kr verliehen wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anästhetikum: | |||
| Ketamin/Xylazin-Mischung (Ketamina / Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Polen | ||
| Natrium-Pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Polen | ||
| Fixiermittel: | |||
| Glutaraldehyd (GA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, speziell gereinigt für den Einsatz als Elektronenmikroskopie-Fixiermittel |
| Salzsäure (HCl) | POCH, Gliwice, Polen | 575283115 | rein p.a. |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | geprillt, 95% |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | Tabletten |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | Reagenzqualität,  98%, Pellets ( |
| Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusion: | |||
| Groß stumpf/stumpf gebogen Schere (~14,5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Mikrospatel (doppelte 2" flache Enden, eines abgerundet, eines verjüngt auf 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Nadelspitze, 15 GA, stumpf (Perfusionsnadel) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Deutschland | KD-FINE 900413 | 1,80 x 40 mm |
| feine (Graefe) Pinzetten | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Perfusionspumpe | Lead Fluid | BQ80S | |
| Kunststofffläschchen | Profilab, Warschau, Polen | 534.02 | Kunststofffläschchen mit blauer Kappe zur Gewebeaufbewahrung, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Gerade Irisschere (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Vorbereitung von Gehirnschnitten für EM: strong>12-Well-Platte | |||
| NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | ||
| Cyanoacryl-Kleber | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glasfläschchen | Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Szintillationsfläschchen, eine Packung mit 100 |
| Stück Pasteurpipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, Einweg, 7,5 ml |
| Rasierklinge | Wilkinson Sword, London, UK | Klassische zweischneidige Sicherheitsrasierklingen | |
| Skalpellklinge | Swann-Morton, Sheffield, UK | Nr. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Wien, Österreich | Leica VT1000 S | |
| Brain-Scheiben Vorbereitung für IF: | |||
| 96-Well-Platte | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Wien, Österreich | Leica CM 1950 | |
| Ethylenglykol | Bioshop, Burlington, Kanada | ETH001 | |
| Einwegklinge mit niedrigem Profil 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Skalpellklinge | Swann-Morton, Sheffield, UK | Nr. 20 | |
| Natriumazid (NaN3) | POCH, Gliwice, Polen | 792770426 | |
| Saccharose | POCH, Gliwice, Polen | 772090110 | |
| Einfriermedium für die Kryosektion, OCT-Compound | Leica Biosystems, Schweiz | 14020108926 | |
| Immunfärbung: 24-Well-Platte | |||
| NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | ||
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antikörper | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Konfokalmikroskop | Zeiss, Gö ttingen, Deutschland | Zeiss Spinning Disc Mikroskop (63 x Ölobjektiv, NA 1,4, Pixelgröße 0,13 & Mikro; m & times; 0,13 & Mikro; m) | |
| Deckobjektträger | Menzel Glaser, Braunschweig, Deutschland | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluormount-G Eindeckmedium, mit DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Objektträger | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normales Eselserum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warschau, Polen | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop | , Burlington, Kanada | TRX506 | |
| Elektronenmikroskopische Probenvorbereitung | |||
| Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat | POCH, Gliwice, Polen | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluorpolymer-Filmeinbettungsblatt |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxid-Einbettmedium-Beschleuniger |
| Durcupan ACM Einzelkomponente A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM Einkomponenten-A, M Epoxidharz |
| Durcupan ACM Einkomponenten-B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM Einkomponenten-B, Härter 964 |
| Durcupan ACM Einkomponenten-D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM Einkomponenten-D, Weichmacher |
| Ethylalkohol absolut | POCH, Gliwice, Polen | 64-17-5 | Ethylalkohol absolut 99,8 % rein P.A.-BASIC |
| Genlab Laborofen | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Ofen Genlab MINO/18/SS 18l Volumen, keine Lüfterumwälzung, keine Digitalanzeige, Standard-Temperaturgradient, Standard-Rückgewinnungsrate, kein Timer, 250°; C maximale Temperatur, 240V Stromversorgung |
| L-Asparaginsäure | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | Reagenzqualität, 98% (HPLC) |
| Blei (II)-nitrat | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99,95% Spurenmetalle Basis |
| Osmiumtetroxid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | für die Elektronenmikroskopie, 4% in H2O pH-Messgerät |
| Elmetron, Zabrze, Polen | CP-5-5 | ||
| Rotator | BioSan, Jó zefó w, Polen | Multi Bio RS-24 | Rotator Multi Bio RS-24 |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | Reagenzqualität, 98%, Pellets (wasserfrei) |
| Sonnenblumen-Mini-Shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
| Spritzenfilter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 &Mikro; m Porengröße |
| Thiocarbohydrazid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., für die Elektronenmikroskopie, 99,0% (N) |
| Uranylacetat | Serva, Heidelberg, Deutschland | 77870 | Uranylacetat&Middot; 2H2O, Wasserbad für Forschungszwecke |
| WSL, Swietochlowice, Polen | LWT | ||
| Probenaufnahme für SBEM | |||
| 96-Well-Kulturplatte | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-Well-Platten, runder Boden, unbehandelt |
| AM Gatan 3View Pinzette für die Handhabung | Micro to Nano, Haarlem, Niederlande Niederlande | 50-001521 | |
| Binokular | OPTA-TECH, Warschau, Polen | X2000 | |
| Leitfähiger Kleber | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | Leitfähiger Kleber |
| Gatan 3View Probe Pin Stubs | Micro to Nano, Haarlem, Niederlande Niederlande | 10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | P7793 | Rollengröße 20 in. &mal; 50 ft |
| Pelco leitfähige Silberfarbe | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Leitfähige Silberfarbe, 15g |
| Rasierklingen doppelschneidig | Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Edelstahl "PTFE" beschichtet. PERSONNA Marke .004" dick, einzeln verpackt, 250 Klingen in einer Schachtel. |
| Rasterelektronenmikroskop | Zeiss, Oberkochen, Deutschland | Sigma VP mit Gatan 3View2 Kammer, Beschleunigungsspannung 2,5 kV, variabler Druck 5 Pa, Apertur 20 & Mikro; m, Verweildauer 6 µ s, Schichtdicke 60 nm, Vergrößerung 15 000 x, Bildauflösung 2048 x 2048 Pixel, Pixelgröße 7,3 nm | |
| Beschnitt 90°; Diamantmesser | Diatome Ltd., Nidau, Schweiz | DTB90 | |
| Ultramikrotom | Leica Microsystems, Wien, Österreich | Leica ultracutR | |
| Software | Webseite | Tutorials | |
| FidschiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Tiere | |||
| Mäuse | Erwachsener 3 Monate alt und 20± 1 Monat alt weiblich Thy1-GFP(M)-Mäuse (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000), die GFP in einer spärlich verteilten Population von glutamatergen Neuronen exprimieren. Die Tiere wurden als Heterozygoten mit dem C57BL/6J-Hintergrund im Tierhaus des Nencki Institute of Experimental Biology gezüchtet. |
Referenzen
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
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Nachdrucke und Genehmigungen
