Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Summary

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Abstract

Die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3D EM) bietet die Möglichkeit, morphologische Parameter dendritischer Stacheln mit nanoskaliger Auflösung zu analysieren. Darüber hinaus können einige Merkmale der dendritischen Wirbelsäule, wie das Volumen der Wirbelsäule und die postsynaptische Dichte (PSD) (die den postsynaptischen Teil der Synapse darstellt), das Vorhandensein eines präsynaptischen Terminals und ein glattes endoplasmatisches Retikulum oder eine atypische Form der PSD (z. B. multiinnervierte Stacheln), nur mit 3D-EM beobachtet werden. Durch den Einsatz der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) ist es möglich, 3D-EM-Daten einfacher und reproduzierbarer zu erhalten als bei herkömmlichen seriellen Schnitten. Hier zeigen wir, wie man Hippocampusproben der Maus für die SBEM-Analyse vorbereitet und wie dieses Protokoll mit immunfluoreszenzuntersuchungen dendritischer Stacheln kombiniert werden kann. Die milde Fixierungsperfusion ermöglicht es uns, Immunfluoreszenzstudien mit Lichtmikroskopie an einer Hälfte des Gehirns durchzuführen, während die andere Hälfte für SBEM vorbereitet wurde. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der Tiere, die für die Studie verwendet werden sollen.

Introduction

Die meisten erregenden Synapsen im zentralen Nervensystem befinden sich auf dendritischen Stacheln - kleinen Vorsprüngen einer neuronalen Membran. Diese Vorsprünge bilden begrenzte biochemische Kompartimente, die die intrazelluläre Signaltransduktion steuern. Die strukturelle Plastizität von dendritischen Stacheln und Synapsen steht in engem Zusammenhang mit den funktionellen Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit, die so wichtigen Prozessen wie Lernen und Gedächtnis^{zugrunde liegen 1,2}. Es ist wichtig zu beachten, dass die Elektronenmikroskopie (EM) die einzige Technik ist, mit der festgestellt werden kann....

Protocol

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Nencki-Instituts und der Genehmigung des Lokalen Ethikkomitees durchgeführt. Die Studien wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG), dem polnischen Tierschutzgesetz, durchgeführt und von der ersten lokalen Ethikkommission in Warschau genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren.

ACHTUNG: Alle unten beschriebenen Verfahren müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Aufgrund der Gefährlichkeit der verwendeten Reagenzien. Persö....

Results

Mit der oben beschriebenen Methode können kontrastreiche Bilder des Gehirngewebes der Maus mit guter Auflösung erhalten werden. Ein großes Sichtfeld, das die SBEM-Technik bietet, ermöglicht die präzise Auswahl der region von Interesse. Das große Bild der CA1-Region des Hippocampus wurde aufgenommen, um die Länge des Stratum radiatum (SR) zu messen (Abbildung 2A) und die Bildgebung genau in der Mitte einzustellen (Abbildung 2B). Als nächstes wurde der Bi.......

Discussion

Es gibt viele Variationen der primären NCMIR-Methode, die von Deerinck im Jahr 2010 beschrieben wurde¹⁰. Die Grundprinzipien bleiben gleich, aber je nach Art des untersuchten Materials werden geringfügige Änderungen umgesetzt. Es wurde bereits beschrieben, dass verschiedene Harze verwendet werden können, um Proben für SBEM einzubetten, und zum Beispiel im Falle von Pflanzen ist Spurr's aufgrund seiner niedrigen Viskosität, die eine bessere Infiltration durch die Zellwände ermöglicht, das Harz der .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anästhetikum:
Ketamin/Xylazin-Mischung (Ketamina / Sedazin)	Biowet Pulawy, Pulawy, Polen
Natrium-Pentobarbital (Morbital)	Biowet Pulawy, Pulawy, Polen
Fixiermittel:
Glutaraldehyd (GA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	G5882	Grade I, 25% in H2O, speziell gereinigt für den Einsatz als Elektronenmikroskopie-Fixiermittel
Salzsäure (HCl)	POCH, Gliwice, Polen	575283115	rein p.a.
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	441244	geprillt, 95%
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P4417-50TAB	Tabletten
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	Reagenzqualität, 98%, Pellets (
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3264
Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3139
Perfusion:
Groß stumpf/stumpf gebogen Schere (~14,5 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14519-14
Mikrospatel (doppelte 2" flache Enden, eines abgerundet, eines verjüngt auf 1/8")	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10091-12
Nadelspitze, 15 GA, stumpf (Perfusionsnadel)	KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Deutschland	KD-FINE 900413	1,80 x 40 mm
feine (Graefe) Pinzetten	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11050-10
Perfusionspumpe	Lead Fluid	BQ80S
Kunststofffläschchen	Profilab, Warschau, Polen	534.02	Kunststofffläschchen mit blauer Kappe zur Gewebeaufbewahrung, 20 ml, 31 x 48 mm
Gerade Irisschere (~9 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14058-11
Vorbereitung von Gehirnschnitten für EM: strong>12-Well-Platte
	NEST, Rahway, NJ, USA	712001
Cyanoacryl-Kleber	Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glasfläschchen	Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA	72632	20 ml Szintillationsfläschchen, eine Packung mit 100
Stück Pasteurpipette	VWR, Radnor, PA, USA	612-4545	LDPE, Einweg, 7,5 ml
Rasierklinge	Wilkinson Sword, London, UK		Klassische zweischneidige Sicherheitsrasierklingen
Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, UK	Nr. 20
Vibratome	Leica Microsystems, Wien, Österreich	Leica VT1000 S
Brain-Scheiben Vorbereitung für IF:
96-Well-Platte	NEST, Rahway, NJ, USA	701101
Criostat	Leica Microsystems, Wien, Österreich	Leica CM 1950
Ethylenglykol	Bioshop, Burlington, Kanada	ETH001
Einwegklinge mit niedrigem Profil 819	Leica Biosystems Inc., USA	14035838925
Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, UK	Nr. 20
Natriumazid (NaN3)	POCH, Gliwice, Polen	792770426
Saccharose	POCH, Gliwice, Polen	772090110
Einfriermedium für die Kryosektion, OCT-Compound	Leica Biosystems, Schweiz	14020108926
Immunfärbung: 24-Well-Platte
	NEST, Rahway, NJ, USA	702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antikörper	Merck-Millipore, Burlington, MA, USA	MAB1598
Konfokalmikroskop	Zeiss, Gö ttingen, Deutschland		Zeiss Spinning Disc Mikroskop (63 x Ölobjektiv, NA 1,4, Pixelgröße 0,13 & Mikro; m & times; 0,13 & Mikro; m)
Deckobjektträger	Menzel Glaser, Braunschweig, Deutschland	B-1231	24 x 60 mm
Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	A31570
Fluormount-G Eindeckmedium, mit DAPI	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	00-4959-52
Objektträger	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	AGAA00008	SuperFrost
Normales Eselserum (NDS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA	017-000-121
Shaker	JWElectronic, Warschau, Polen	KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop	, Burlington, Kanada	TRX506
Elektronenmikroskopische Probenvorbereitung
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat	POCH, Gliwice, Polen	746980113
Aclar 33C Film	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	50425	Fluorpolymer-Filmeinbettungsblatt
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	T58203	Epoxid-Einbettmedium-Beschleuniger
Durcupan ACM Einzelkomponente A, M	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44611	Durcupan ACM Einkomponenten-A, M Epoxidharz
Durcupan ACM Einkomponenten-B	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44612	Durcupan ACM Einkomponenten-B, Härter 964
Durcupan ACM Einkomponenten-D	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44614	Durcupan ACM Einkomponenten-D, Weichmacher
Ethylalkohol absolut	POCH, Gliwice, Polen	64-17-5	Ethylalkohol absolut 99,8 % rein P.A.-BASIC
Genlab Laborofen	Wolflabs, York, UK	Mino/18/SS	Ofen Genlab MINO/18/SS 18l Volumen, keine Lüfterumwälzung, keine Digitalanzeige, Standard-Temperaturgradient, Standard-Rückgewinnungsrate, kein Timer, 250°; C maximale Temperatur, 240V Stromversorgung
L-Asparaginsäure	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	A-9256	Reagenzqualität, 98% (HPLC)
Blei (II)-nitrat	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	467790	99,95% Spurenmetalle Basis
Osmiumtetroxid	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	75632	für die Elektronenmikroskopie, 4% in H2O pH-Messgerät
	Elmetron, Zabrze, Polen	CP-5-5
Rotator	BioSan, Jó zefó w, Polen	Multi Bio RS-24	Rotator Multi Bio RS-24
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	Reagenzqualität, 98%, Pellets (wasserfrei)
Sonnenblumen-Mini-Shaker	Grant bio, Shepreth,UK	PD-3D
Spritzenfilter	Millipore, Burlington, MA, USA	SLGP033NB	0,22 &Mikro; m Porengröße
Thiocarbohydrazid	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	88535	purum p.a., für die Elektronenmikroskopie, 99,0% (N)
Uranylacetat	Serva, Heidelberg, Deutschland	77870	Uranylacetat&Middot; 2H2O, Wasserbad für Forschungszwecke
	WSL, Swietochlowice, Polen	LWT
Probenaufnahme für SBEM
96-Well-Kulturplatte	VWR, Radnor, PA, USA	734-2782	96-Well-Platten, runder Boden, unbehandelt
AM Gatan 3View Pinzette für die Handhabung	Micro to Nano, Haarlem, Niederlande Niederlande	50-001521
Binokular	OPTA-TECH, Warschau, Polen	X2000
Leitfähiger Kleber	Chemtronics, Georgia, USA	CW2400	Leitfähiger Kleber
Gatan 3View Probe Pin Stubs	Micro to Nano, Haarlem, Niederlande Niederlande	10-006003
Parafilm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	P7793	Rollengröße 20  in. &mal; 50  ft
Pelco leitfähige Silberfarbe	Ted Pella, Redding, CA, USA	16062-15	PELCO®   Leitfähige Silberfarbe, 15g
Rasierklingen doppelschneidig	Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA	72000	Edelstahl "PTFE" beschichtet. PERSONNA Marke .004" dick, einzeln verpackt, 250 Klingen in einer Schachtel.
Rasterelektronenmikroskop	Zeiss, Oberkochen, Deutschland		Sigma VP mit Gatan 3View2 Kammer, Beschleunigungsspannung 2,5 kV, variabler Druck 5 Pa, Apertur 20 & Mikro; m, Verweildauer 6 µ s, Schichtdicke 60 nm, Vergrößerung 15 000 x, Bildauflösung 2048 x 2048 Pixel, Pixelgröße 7,3 nm
Beschnitt 90°; Diamantmesser	Diatome Ltd., Nidau, Schweiz	DTB90
Ultramikrotom	Leica Microsystems, Wien, Österreich	Leica ultracutR
Software	Webseite		Tutorials
FidschiJ	https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser	http://mib.helsinki.fi/		http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct	https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0		https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Tiere
Mäuse	Erwachsener 3 Monate alt und  20± 1  Monat alt  weiblich  Thy1-GFP(M)-Mäuse (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000), die GFP in einer spärlich verteilten Population von glutamatergen Neuronen exprimieren. Die Tiere wurden als Heterozygoten mit dem C57BL/6J-Hintergrund im Tierhaus des Nencki Institute of Experimental Biology gezüchtet.