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Summary

Eine erfolgreiche Keimbahntransformation im Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperdawurde unter Verwendung von mRNA der hyperaktiven PiggyBac-Transposase erreicht.

Abstract

Die stabile Insertion genetischer Fracht in Insektengenomen unter Verwendung transponierbarer Elemente ist ein leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle genomische Studien und die Entwicklung genetischer Schädlingsbekämpfungsstrategien. Das am häufigsten verwendete transponierbare Element in der Insektentransformation ist PiggyBac, und die PiggyBac-basierteKeimbahntransformation wurde erfolgreich in Modellinsekten durchgeführt. Es ist jedoch immer noch eine Herausforderung, diese Technologie bei Nicht-Modell-Insekten einzusetzen, zu denen auch landwirtschaftliche Schädlinge gehören. Dieser Artikel berichtet über die Keimbahntransformation eines globalen landwirtschaftlichen Schädlings, des Herbstheerwurms (FAW), Spodoptera frugiperda,unter Verwendung der hyperaktiven PiggyBac-Transposase (hyPBase).

In dieser Arbeit wurde die hyPBase mRNA hergestellt und anstelle von Helferplasmid in embryonalen Mikroinjektionen verwendet. Diese Veränderung führte zur erfolgreichen Generierung von transgenem FAW. Darüber hinaus werden auch die Methoden des Screenings transgener Tiere, des PCR-basierten Schnellnachweises der Transgeninsertion und der thermischen asymmetrischen Interlaced PCR (TAIL-PCR)-basierten Bestimmung der Integrationsstelle beschrieben. Daher stellt dieses Papier ein Protokoll zur Herstellung von transgenem FAW vor, das die PiggyBac-basierteTransgenese bei FAW und anderen Lepidoptera-Insekten erleichtern wird.

Introduction

Der Herbst-Heerwurm (FAW), Spodoptera frugiperda,stammt aus tropischen und subtropischen Regionen Amerikas. Derzeit ist dies ein verheerender Insektenpflanzenfresser in mehr als 100 Ländern weltweit¹. FAW-Larven ernähren sich von mehr als 350 Wirtspflanzen, darunter einige wichtige Grundnahrungsmittel². Die starke Migrationsfähigkeit der FAW-Erwachsenen trägt zu ihrer jüngsten raschen Ausbreitung von Amerika auf andere Orte bei^1,2. Infolgedessen bedroht dieses Insekt jetzt die Ernährungssicherheit auf internationaler Ebene. Die Anwendung neuer Technologien kann fortgeschrittene Studien in FAW erleichtern und neuartige Strategien zur Bekämpfung dieses Schädlings bieten.

Die Transformation der Keimbahn von Insekten wurde verwendet, um die Genfunktion zu untersuchen und transgene Insekten für die genetische Kontrolle zu erzeugen^3,4. Unter den verschiedenen Methoden, die verwendet werden, um eine genetische Transformation bei Insekten zu erreichen, ist die auf PiggyBac-Elementen basierende Methode die am häufigsten verwendete Methode⁵. Aufgrund der geringen Transpositionsrate ist es jedoch immer noch schwierig, die Transgenese bei Nicht-Modellinsekten durchzuführen. Vor kurzem wurde eine hyperaktive Version der piggyBac Transposase (hyPBase) entwickelt^6,7. Die Keimbahntransformation wurde kürzlich in FAW^{erreicht 8}, was der erste Bericht ist, der die hyPBase bei Lepidoptera-Insekten verwendete. In diesem Bericht werden detaillierte Informationen zum Einsatz von hyPBase mRNA bei der Erzeugung transgener FAW beschrieben. Die hier beschriebene Methode könnte angewendet werden, um die Transformation anderer Lepidoptera-Insekten zu erreichen.

Protocol

1. In vitro Synthese von hyPBase mRNA

HINWEIS: Die vollständige Codierungssequenz der hyPBase-Sequenz wurde synthetisiert und in einen pTD1-Cas9-Vektor eingefügt (siehe Materialtabelle),um das pTD1-hyPBase-Konstrukt zu erzeugen, das eine hyPBase-exprimierende Kassette enthält, T7-Promotor: Polyhedrin-5′ UTR: hyPBase: Polyhedrin-3′ UTR: Poly (A). Die vollständige Sequenz des pTD1-hyPBase-Konstrukts ist im Ergänzenden Material enthalten.

1. Vorbereitung der Schablone für die In-vitro-Synthese
   1. Führen Sie eine PCR-Reaktion durch, um die hyPBase-exprimierende Kassette zu amplifizieren, indem Sie einen Forward-Primer, 5′- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3′ und einen Reverse Primer 5′- tagaggccccaaggggttatgctag-3′, eine High-Fidelity-Polymerase und ein pTD1-hyPBase-Plasmid als Vorlage verwenden.
      HINWEIS: Die PCR-Reaktion (Endvolumen von 50 μL) enthält 5,0 μL 10x Reaktionspuffer, 4,0 μL 10 mM Desoxynukleosidtriphosphat (dNTP), 1,0 μL Plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL High-Fidelity-Polymerase, jeweils 1,0 μL 10 μM Forward- und Reverse-Primer und 33 μL nukleasefreies Wasser. Die Einstellungen waren wie folgt: eine anfängliche Inkubation von 95 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 60 °C für 15 s und 68 °C für 2 min.
   2. Überprüfen Sie das PCR-Produkt auf einem 1% igen Agarosegel bei 120 V in frischem Tris-Acetat-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (TAE) -Puffer für 30 min und reinigen Sie das Produkt mit dem Gelextraktionskit.
      HINWEIS: Verwenden Sie nicht das PCR-Produktreinigungskit. Selbst eine Spurenmenge des pTD1-hyPBase-Plasmids verringert die Effizienz der In-vitro-Synthese signifikant.
2. In-vitro-Synthese von hyPBase-mRNA mit einem kommerziellen Kit
   1. Die gefrorenen Reagenzien vollständig auftauen, das Enzym und die 2x NTP/CAP-Lösung auf Eis aufbewahren und den aufgetauten 10x Reaktionspuffer bei Raumtemperatur belassen.
   2. Montieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur unter Zugabe der folgenden Komponenten: 2x NTP/CAP-Lösung: 10 μL; 10x Reaktionspuffer: 2 μL; Template DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymmischung: 2 μL; Nukleasefreies Wasser bis 20 μL.
   3. Mischen Sie die Reagenzien gründlich, indem Sie die Mischung vorsichtig auf und ab pipettieren und bei 37 ° C für 2-4 h inkubieren.
3. Rückgewinnung synthetisierter mRNA durch Lithiumchlorid-Fällung
   1. Fügen Sie 30 μL LiCl Precipitation Solution hinzu, mischen Sie gründlich durch Flicken des Röhrchens und halten Sie es dann bei -20 ° C für ≥ 30 min.
   2. Zentrifugiere bei 4 °C für 15 min mit der maximalen Geschwindigkeit und entferne vorsichtig den Überstand.
   3. Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 ml 70% Ethanol, zentrifugieren Sie es erneut und entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
   4. Trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur für 1-2 min und resuspenieren Sie das Pellet dann mit 20-40 μL nukleasefreiem Wasser.
   5. Verdünnen Sie 1 μL mRNA-Lösung mit 9 μL nukleasefreiem Wasser. Nehmen Sie 2 μL, um die mRNA-Konzentration zu bestimmen, und verwenden Sie 8 μL, um die mRNA-Qualität auf einem 1% igen Agarosegel bei 100 V in frischem TAE-Puffer für 40 min zu überprüfen.
   6. Aliquotieren Sie die mRNA-Lösung und lagern Sie sie gefroren bei -70 °C bis zu einem Jahr.
      HINWEIS: Trocknen Sie das mRNA-Pellet nicht vollständig; Es kann schwieriger sein, es in Wasser aufzulösen.

2. Mikroinjektion

1. Eiersammlung
   1. Legen Sie 12 männliche Puppen und 12 weibliche Puppen in eine 15 cm x 15 cm x 10 cm große Box. Decken Sie die Box mit einem Papiertuch ab. Geben Sie eine 10% ige Saccharoselösung in die Box zur Fütterung von Erwachsenen.
   2. Setzen Sie die Erwachsenen am Tag 2 nach der Eklosion über Nacht intensivem Licht aus.
   3. Am Tag 3 nach der Eklosion bringen Sie die Erwachsenen von Schritt 2.1.2 an einen dunklen Ort. Sammeln Sie die Embryonen innerhalb von 2 h nach der Eiablage.
   4. Fügen Sie Wassertropfen zu dem Stück eines Papiertuchs mit frischen Eiern hinzu, die in einer Petrischale auf Eis aufbewahrt werden. Übertragen Sie die Eier vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf einen Glasträger und richten Sie sie nacheinander auf einem Glasobjektträger aus. Bewahren Sie die Glasobjektträger mit den ausgerichteten Eiern vor der Mikroinjektion auf Eis auf.
2. Mikroinjektionsaufbau
   1. Injizieren Sie eine Mischung aus einem transgenen verstärkten grün fluoreszierenden Protein (EGFP)-exprimierenden Plasmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) und sterilem destilliertem Wasser unter Verwendung des Kompensationsdrucks des automatisierten Mikroinjektors in die Eier (siehe Materialtabelle).
   2. Die injizierten Eier bis zum Schlüpfen bei 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahren.
   3. Füttern Sie die geschlüpften Larven künstlich und übertragen Sie jede Larve im frühen^3. Stadium des Stadiums (~ 6 mm lang und die Körperfarbe wird schwarz).

3. Fluoreszenzscreening und genetische Kreuzung

1. Sammeln Sie die Puppen und legen Sie ~ 150 weibliche Puppen und ~ 150 männliche Puppen in einen 35 cm x 35 cm x 35 cm großen Käfig. Hängen Sie mehrere Stücke Papiertücher (~ 30 cm x 15 cm) in den Käfig, um die Eier zu sammeln.
2. Sammeln Sie die Papiertücher täglich mit Eiern und bewahren Sie die Eier bis zum Schlüpfen bei 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit auf.
3. Halten Sie die neugeborenen Larven 5 Minuten lang bei 4 ° C, um sie zu immobilisieren, und übertragen Sie sie dann auf eine eiskalte Platte.
4. Screenen Sie die immobilisierten Neugeborenenlarven unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Wählen Sie die EGFP-positiven Neugeborenen aus, heben Sie sie in ~ 2 Wochen bei 27 ± 1 ° C in das Puppenstadium und trennen Sie sie nach Geschlecht nach den Phänotypunterschieden an den ventralen Abdomensegmenten.
   HINWEIS: Die weibliche Puppe hat eine schlitzartige Genitalöffnung am achten Bauchsegment und die Kopfränder des neunten und zehnten Segments, die sich zur Genitalöffnung hin krümmen. Die Genitalöffnung der männlichen Puppe hat eine leichte Erhöhung auf dem neunten Bauchsegment.
5. Legen Sie die EGFP-positiven Puppen und die Wildtyppuppen des anderen Geschlechts in ein Männchen:Weibchen-Verhältnis von 1:1 in einen Käfig. Sib-Kreuzung der EGFP-exprimierenden Erwachsenen, um die folgenden Generationen zu produzieren.

4. PCR-Nachweis der transgenen Insertion

1. Extrahieren Sie genomische DNA aus den Wildtyp- und EGFP-positiven einzelnen Larven mit einem kommerziellen genomischen DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Durchführung einer PCR-Reaktion unter Verwendung der genomischen DNA als Vorlage; eine Vorwärtsprimierung, 5′- acgtacgctcctcgttccgttccgttc-3′ in der ie1 Promoter-Region; und ein umgekehrter Primer, 5′- aagcactgcacgccgtaggtcag-3′, der sich im EGFP-Bereich des Transformationsvektors befindet.
3. Richten Sie jede PCR-Reaktion (Endvolumen von 40 μL) so ein, dass sie 20 μL der Polymerasemischung, 1,0 μL genomische DNA (40 μg/μL), jeweils 1,0 μL 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 17 μL nukleasefreies Wasser enthält. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: eine anfängliche Inkubation von 95 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95 °C für 20 s, 56 °C für 20 s und 68 °C für 40 s Einstellungen.
4. Überprüfen Sie die PCR-Produkte auf einem 1% igen Agarosegel bei 120 V für 30 min.

5. Bestimmung der transgenen Einfügestelle

1. Führen Sie eine hocheffiziente TAIL-PCR unter Verwendung genomischer DNA als Vorlage durch, um die Integrationsstelle der Transgen-Insertion in die EGFP-positiven Insekten zu bestimmen.
   1. Führen Sie die PCR-Reaktionen gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Schritten^{durch 9}.
      1. Verwenden Sie drei Primer, P1′-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3′, P2: 5′-tcacgggagctccaagcggcgactg-3′ und P3: 5′-atgtcctaaatgcacagcgccggattcgcgct-3′, die spezifisch für den piggyBac-Vektor sind, in den 3 Runden der PCR-Reaktion.
2. Sequenzieren Sie die endgültigen PCR-Produkte, um den Integrationsort zu bestimmen.

Representative Results

Discussion

Die geringe Transpositionsrate und die Schwierigkeit, transgene Komponenten in frische Embryonen zu liefern, begrenzen den Erfolg der Keimbahntransformation bei vielen Nicht-Modellinsekten, insbesondere bei Lepidoptera. Um die Keimbahntransformationsrate zu erhöhen, wurde eine hyperaktive Version der am weitesten verbreiteten PiggyBac-Transposase (hyPBase) entwickelt^7,10. Bis heute wird eine erfolgreiche Keimbahntransformation bei Lepidoptera-Insekten hauptsächlich bei der Modellinsekten-Seidenraupe Bombyx mori¹¹berichtet. Die Durchführung von Transgenese-Arbeiten bei anderen Lepidoptera-Insekten, einschließlich einiger großer landwirtschaftlicher Schädlinge, ist jedoch immer noch eine Herausforderung.

Die Haupteinschränkungen und die wichtigsten Schritte bei der Etablierung einer transgenen FAW-Linie mit diesem Protokoll sind die Synthese hochwertiger hyPBase-mRNA und die Abgabe von PiggyBac-Transpositionskomponenten in die frühen Embryonen. Die beiden Kernkomponenten des traditionellen piggyBac-Systems sind ein Donorplasmid, das die in das Genom einzufügende Fracht enthält, und ein Helferplasmid, das die Transposase¹²bereitstellt. Um die Transformationseffizienz zu erhöhen, werden hochaktive Promotoren im Helferplasmid verwendet, um die Expression der Transposase^13,14zu steuern. Da diese Promotoren in der Regel aus Modellinsekten gewonnen werden, ist ihre Aktivität bei anderen Insekten möglicherweise nicht hoch wie bei der Art, aus der der Promotor identifiziert wurde. Somit ist transposase mRNA effektiver als das Helferplasmid, was die Keimbahntransformation bei den meisten Nicht-Modellinsekten verbessern kann.

In diesem Protokoll wurde hyPBase-mRNA in vitro hergestellt, indem ein Plasmid konstruiert wurde, das die hyPBase-exprimierende Kassette (T7-Promotor: Polyhedrin-5’UTR: hyPBase: Polyhedrin-3’UTR: Poly(A)-Signal) enthielt. Der T7-Promotor ermöglicht die In-vitro-Synthese von mRNA unter Verwendung kommerziell erhältlicher mRNA-Synthesekits. Sowohl Polyhedrin-5’UTR als auch Polyhedrin-3’UTR könnten bei der Verbesserung der Transkription von hyPBase mRNA in vitro und der Translation des hyPBase-Proteins in vivohelfen. Das Vorhandensein des Poly(A)-Signals trägt dazu bei, die Stabilität der hyPBase-mRNA in vivozu verbessern¹⁵. Darüber hinaus ist die Injektion der PiggyBac-Komponenten in die sehr frühen Embryonen mit einer begrenzten Anzahl von sich teilenden Zellen ebenfalls entscheidend, um die Chancen zu verbessern, die Vorläufer der Keimbahnzellen der PiggyBac-Systemkomponenten zu liefern. Die in den Keimbahnzellen auftretenden Transpositionsereignisse könnten vererbt werden. In diesem Protokoll wurden FAW-Embryonen, die weniger als 2 Stunden alt waren, gesammelt und auf Eis gehalten, um ihre Entwicklung vor der Injektion zu verlangsamen. Für die meisten Insekten könnte es auch helfen, Embryonen so früh wie möglich zu sammeln und einen Weg zu finden, ihre Entwicklung zu verlangsamen, um eine erfolgreiche Keimbahntransformation zu erreichen.

Die Verwendung fluoreszierender Proteine in der Transgenese von Insekten hilft bei der Identifizierung transgener Tiere. In diesem Protokoll wurde der IE1-Promotor, von dem berichtet wurde, dass er ein effizienter und ubiquitärer Promotor bei Lepidoptera-Insekten¹¹ist, der aus dem unmittelbaren frühen Gen des Autographa california multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) stammt, mit dem hr5-Enhancer verschmolzen, um die Expression von EGFP voranzutreiben. Bei transgenen Individuen, bei denen EGFP in das FAW-Genom eingefügt wurde, konnte das EGFP-Signal in allen Stadien beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Die molekulare Bestätigung der PiggyBac-vermitteltenInsertion wurde in der Regel durch Southern Blot oder inverse PCR und Sequenzierung durchgeführt. In diesem Protokoll wurde die PCR-Amplifikation eines Fragments in der transgenen Ladung verwendet, um die transgene Insertion schnell zu bestätigen. Zusätzlich wurde eine PCR-basierte hocheffiziente TAIL-PCR-Methode eingesetzt, um die Integrationsstelle der transgenen Insertion⁹zu identifizieren, die im Vergleich zur weit verbreiteten inversen PCR-Methode leicht zu manipulieren ist. Die hocheffiziente TAIL-PCR-Methode wurde entwickelt, um die transgenen Integrationsstellen in Pflanzen zu identifizieren. In dieser Studie wird diese Methode zum ersten Mal bei Insekten angewendet. Das vorgestellte Protokoll bietet eine effektive Möglichkeit, transgene FAW zu erzeugen und könnte auch auf viele andere Modell- und Nicht-Modellinsekten angewendet werden.

Materials

1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	 43217-45074	REARING
<em>Spodoptera frugiperda</em> Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
<em>Spodoptera frugiperda</em> Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture