Dieses Protokoll stellt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode vor, die eine Klasse von pH-empfindlichen Lipidfluorophoren verwendet, um den Lipidmembrantransport während der Zellexozytose und des Endozytosezyklus zu überwachen.
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Methodenartikel
Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Exo-/Endozytose ist ein gängiger Prozess, der den Austausch von Biomolekülen zwischen Zellen und ihrer Umgebung sowie zwischen verschiedenen Zellen vermittelt. Spezialisierte Zellen nutzen diesen Prozess, um lebenswichtige Körperfunktionen wie die Insulinsekretion von β Zellen und die Freisetzung von Neurotransmittern aus chemischen Synapsen auszuführen. Aufgrund ihrer physiologischen Bedeutung ist die Exo-/Endozytose eines der am meisten untersuchten Themen in der Zellbiologie. Es wurden viele Werkzeuge entwickelt, um diesen Prozess auf Gen- und Proteinebene zu untersuchen, weshalb viel über die an diesem Prozess beteiligte Proteinmaschinerie bekannt ist. Es wurden jedoch nur sehr wenige Methoden entwickelt, um den Membranlipidumsatz zu messen, der die physikalische Grundlage der Exo-/Endozytose ist.
In dieser Arbeit wird eine Klasse neuer fluoreszierender Lipidanaloga vorgestellt, die eine pH-abhängige Fluoreszenz aufweisen, und ihre Verwendung zur Verfolgung des Lipidrecyclings zwischen der Plasmamembran und den sekretorischen Vesikeln demonstriert. Mit Hilfe einfacher pH-Manipulationen ermöglichen diese Analoga auch die Quantifizierung der Lipidverteilung über die Oberfläche und die intrazellulären Membrankompartimente sowie die Messung der Lipidumsatzrate während der Exo-/Endozytose. Diese neuartigen Lipidreporter werden für verschiedene biologische Forschungsbereiche wie Zellbiologie und Neurowissenschaften von großem Interesse sein.
Einleitung
Die Lipiddoppelschicht ist eine der häufigsten Biomolekül-Anordnungen und für alle Zellen unverzichtbar. Außerhalb der Zellen bildet es die Plasmamembran, die Zellen und ihre Umgebung miteinander verbindet; In Zellen unterteilt es verschiedene Organellen, die auf bestimmte Funktionalitäten spezialisiert sind. Lipidmembranen sind eher dynamisch als still und erfahren ständig Fusion und Spaltung, die den Transport von Biomaterial, die Organellenreform, die Morphologieänderung und die zelluläre Kommunikation vermittelt. Zweifellos ist die Lipidmembran die physikalische Grundlage für fast alle zellulären Prozesse, und ihre Funktionsstörung spielt eine entscheidende Rolle ....
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Protokoll
Das folgende Protokoll enthält (1) ein vereinfachtes Verfahren zur Etablierung von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus auf der Grundlage eines etablierten Protokolls22, (2) eine kurze Einführung in einen Epifluoreszenzmikroskop-Aufbau für lebende Neuronen, (3) eine detaillierte Beschreibung der Beladung und Abbildung von ND6 in Mausneuronen, (4) eine Diskussion über die Quantifizierung des Membrantransports durch ND6-Signal. Alle Verfahren folgen den Biosicherheits- und IACUC-Richtlinien der Florida Atlantic University. Die Synthese von ND6 wurde bereits beschrieben20.
1. Präparation von ....
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Ergebnisse
SVs sind auf die Freisetzung von Neurotransmittern über evozierte Exo-/Endozytosespezialisiert 27. SVs haben ein stark saures Lumen (d. h. pH 5,5), was ideal für ND6 ist. Wir verwendeten eine hohe K+ -Stimulation, um SV-Exo-/Endozytose hervorzurufen, um ND6 den Zugang zu SV zu ermöglichen. Erwartungsgemäß zeigten sich nach dem Laden hellgrün fluoreszierende Punkte entlang neuronaler Prozesse (Abbildung 9A). Das in Abbildung 4B gezeigte Lini.......
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Diskussion
Farbstoffe auf Lipidbasis wie 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin (DiI) und 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO) werden seit langem verwendet, um die Zellmorphologie zu veranschaulichen und zelluläre Prozesse wie die Axonprojektionen von Neuronen zu verfolgen. Styrylfarbstoffe wie FM1-43 wurden erfunden und erfolgreich zur Untersuchung der Exozytoseeingesetzt 34. Aufgrund ihrer geringen Membranaffinität markieren sie selektiv endozytierte Vesikel, wo sie eingeschlossen .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch das Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry Grant (M.J.S.), das Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), das Alzheimer's Association Grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) und das NIA R21 Grant AG061656-01A1 (Q.Z.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Digidata 1440A Datenerfassungssystem | Molekulare Bauelemente | Digidata 1440A | Für synchronisierte Stimulation und Lösungsaustausch |
| Zweikanal-Temperaturregler | Warner Instruments | TC-344B | Für die Bildgebung |
| lebender Zellen Fötales Rinderserum | OMEGA Scientific | FB-01 | Zur Herstellung von H+20-Lösungen für die Dissektion und Gewebekultur |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS Kamera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | hochempfindliche Kamera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | Zur Herstellung von H+20-Lösung, die in der Dissektion und Gewebekultur verwendet |
| Beheizte Plattform | Warner Instruments | PH-1 | Für die Bildgebung lebender Zellen |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Für Gewebekulturen |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | Für die Bildgebung lebender Zellen |
| Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | NA | Für die Bildaufnahmekontrolle |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | Für die Bildgebung von lebenden Zellen |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | Für Gewebekulturen |
| Nikon Ti-E Inverses Mikroskop | Nikon | Ti-E/B | Für die Bildgebung von lebenden Zellen |
| ORCA-Flash4.0 Digitale CMOS-Kamera | Hamamatsu | C1340-20CU | Für die Bildgebung von lebenden Zellen |
| Perfusionskammer | Warner Instruments | RC-26G | Für die Bildgebung von lebenden Zellen |
| Sechskanal-Ventilsteuerung Perfusionssystem | Warner Instruments | VC-6 | Für den Lösungsaustausch |
| Rechteckpulsstimulator | Grass Instrument | SD9 | Für die Stimulation elektrischer Felder |
Referenzen
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010....
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Nachdrucke und Genehmigungen
