Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Summary

Hier werden detaillierte Methoden zur Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Dünndarm- und Dickdarm-Organoiden beschrieben. Diese Methoden wurden entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, die Skalierbarkeit zu erweitern und die Arbeitszeit zu verringern, die für die Beschichtung und Passage von Organoiden erforderlich ist.

Abstract

Die intestinale Regionalspezifizierung beschreibt einen Prozess, durch den definierten Bereichen des sich entwickelnden gastrointestinalen (GI) Trakts eine einzigartige Morphologie und Funktion verliehen wird. Die regionale Spezifizierung im Darm wird durch mehrere Entwicklungswege gesteuert, einschließlich des Knochenmorphogenetischen Proteins (BMP). Basierend auf der normalen regionalen Spezifikation wurde eine Methode zur Erzeugung humaner Dickdarmorganoide (HCOs) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) entwickelt, zu denen auch humane embryonale Stammzellen (hES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) gehören. Eine dreitägige Induktion des BMP-Signalwegs strukturiert die Tubenkulturen des Mittel-/Hinterdarms ausreichend in spezielle AT-reiche sequenzbindende Protein 2 (SATB2)-exprimierende HCOs, die alle wichtigen Epithelzelltypen enthalten, die im menschlichen Dickdarm vorkommen, sowie in sich mitentwickelnden mesenchymalen Zellen. Das Weglassen von BMP (oder die Zugabe des BMP-Inhibitors NOGGIN) während dieser kritischen Strukturierungsphase führte zur Bildung von humanen Darmorganoiden (HIOs). HIOs und HCOs ähneln morphologisch und molekular dem sich entwickelnden Dünndarm bzw. Dickdarm des Menschen. Trotz des Nutzens von HIOs und HCOs für die Untersuchung der menschlichen Darmentwicklung ist die Generierung von HIOs und HCOs eine Herausforderung. In diesem Artikel werden Methoden zur Generierung, Pflege und Charakterisierung von HIOs und HCOs vorgestellt. Darüber hinaus werden die kritischen Schritte im Protokoll und Empfehlungen zur Problembehandlung bereitgestellt.

Introduction

Die Untersuchung der menschlichen Dickdarmentwicklung ist aufgrund von Einschränkungen bei der Verwendung von menschlichem fötalem Gewebe schwierig. Tiermodelle waren von unschätzbarem Wert und wurden in der Vergangenheit für genetische Ansätze bei Mäusen verwendet, um die Darmentwicklung zu untersuchen. Unterschiede zwischen der Darmentwicklung von Maus und Mensch schränken jedoch die Anwendbarkeit von Mäusen als Modellsystem ein. Obwohl beispielsweise die Kryptenbildung im Dünndarm und Dickdarm von Mäusen postnatal erfolgt, wird der Mensch mit vollständig ausgebildeten Krypten geboren¹. Darüber hinaus enthalt....

Protocol

1. Erzeugung von menschlichen Darm- und Dickdarmorganoiden

1. Vorbereiten von ECM-beschichteten Platten
   1. Geben Sie 50 mL kaltes DMEM-Medium in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
   2. Ein Aliquot von 4x hESC-qualifiziertem ECM (siehe Materialtabelle) aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und auf Eis auftauen.
      HINWEIS: Beziehen Sie sich auf das Analysezertifikat des Produkts, um das Volumen des ESC-qualifizierten ECM zu bestimmen, das für die Erstellung eines 4-fachen Materials erforderlich ist.
   3. Wenn die hESC-qualifizierte ECM nicht vollständig aufgetaut ist, entnehmen Sie 750 μl DMEM aus....

Results

Die erfolgreiche Erzeugung von Sphäroiden während der Induktionsphase des Mittel-/Hinterdarms ist ein Hinweis auf eine erfolgreiche Strukturierung. Führen Sie eine IF-Färbung für CDX2 auf schwebenden Sphäroiden und auf der Monoschicht durch, um zu bestätigen, dass die Strukturierung korrekt ist. Obwohl die Färbung im definitiven Endodermstadium (DE) auf die Wirksamkeit der DE-Induktion hinweisen kann, ist die Erzeugung von Sphäroiden ohne effiziente DE-Induktion nicht möglich. Um die Wirksamkeit der DE-Induktion zu teste.......

Discussion

Die Unterscheidung von hPSCs in HIOs und HCOs ist ein komplexer Prozess, der bei jedem Schritt Qualitätskontrollen erfordert. Die Ausgangs-hPSCs müssen eine minimale Differenzierung aufweisen, bevor sie mit der Differenzierung in DE beginnen. Die Optimierung der Dichte von hPSCs, die für die DE-Differenzierung plattiert werden, ist entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Um die Qualität der DE-Differenzierung sicherzustellen, führen Sie IF für FOXA2 und SOX17 durch, um die Effizienz .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning Röhrchen	Falke	21008-918	N/A
30% Saccharose	N/A	N/A	Hergestellt in PBS.
5% Normales Eselserum	Jackson ImmunForschungslabor	017-000-121	N/A
50 mL Corning Röhrchen	Falke	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Lösung zur Zellablösung; aliquotieren Sie 5 mL Accutase in 10 ml-Röhrchen mit insgesamt 20 Röhrchen und lagern Sie es bei -20 & deg; C für bis zu 6 Monate. Bei 4 Grad platzieren; C über Nacht vor Gebrauch.
Activin A	Zellführungssysteme	GFH6-100x10	Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver bei 100 & Mikro; g/ml in sterilem PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA). Aliquot 38 &Mikro; L von Activin A in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei -80 ° C lagern; C (Röhren verfallen 12 Monate nach dem Datum des Erhalts).
Activin Tag 1 mittel (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Verwenden Sie nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, Corning 11140050) und lagern Sie es bei 4 °C. Basismedium Tag 1: 500 ml RPMI 1640 und 500 ml NEAA. Bei der Zubereitung von Activin Day 1 Medium fügen Sie 13 ml Basic Day 1 Medium, 13 & micro; l von Activin A (100 µ g/mL) und 2 µ l BMP4 (100 µ g/mL). Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Activin Tag 2 mittel (RPMI 1640, 0,2 % FBS vol/vol)	Hyklon	SH30070,03 T	Verwenden Sie nicht-essentielle Aminosäuren (Corning 11140050) und lagern Sie es bei 4 °C. Basismedium für Tag 2: 500 ml RPMI 1640, 500 ml NEAA und 1 ml 0,2% Serum. Bei der Zubereitung von Activin Day 2 Medium fügen Sie 12,5 ml Basic Day 2 Medium und 12,5 & micro; L von Activin A (100 & Mikro; g/mL). Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Activin Tag 3 mittel (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyklon	SH30070,03 T	Verwenden Sie nicht-essentielle Aminosäuren (Corning 11140050) und lagern Sie es bei 4 °C. Basic Tag 3 Medium: 500 ml RPMI 1640, 500 mL NEAA und 10 ml 2% Serum. Bei der Zubereitung von Activin Day 3 Medium fügen Sie 12,5 ml Basic Day 3 und 12,5 & micro hinzu. L von Activin A (100 & Mikro; g/mL). Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege	Thermo Scientific	Nr. A11055	1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen	Thermo Scientific	Nr. A21206	1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)
Alexa Fluor 546 Esel Anti-Maus	Thermo Scientific	Nr. A10036	1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)
Alexa Fluor 647 Esel Anti-Maus	Thermo Scientific	Nr. A31571	1:500 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)
Grundform	Fischer	22-363-552	N/A
Basic Darm Medium (Advanced DMEM)	Gibco	12491015	Bei der Zubereitung von Basic Darmmedium fügen Sie 500 ml DMEM, 500 ml N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml B27 (Gibco), 500 ml L-Glutamin hinzu, um 2 mM L-Glutamin (Corning A2916801), 5 ml 100 μl/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122) und 7,5 ml L  1 M HEPES, um 15 mM HEPES zu erhalten. Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Biorad CFX96 Touch Echtzeit-PCR-Nachweissystem	Biorad	N/A	Es können auch andere qRT-PCR-Systeme verwendet werden.
Lösung zur Zellrückgewinnung	Corning	354253	ECM-schädigende Lösung
CHIR99021	Reprocell	4000410	Rekonstituieren Sie durch Zugabe von 2,15 mL DMSO bei 10 mM. Vorbereiten 50 & Mikro; L aliquotiert und bei -20°C lagern. Pulver bei 4 Grad lagern; C, vor Licht geschützt.
STRG HIO Musterung mittel	N/A	N/A	Grundlegendes Darmmedium und 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	Nr. D9542	1:100 Verdünnung (Sekundärer Antikörper)
DE Monolayer	N/A	N/A	Die Monoschicht wurde in den vorangegangenen Schritten (Abschnitt 4.4) erzeugt.
Dispase	Gibco	17105041	Resuspendieren Sie lyophilisiertes Pulver in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml. Filtern Sie die Lösung für die Sterilisation durch Vakuumieren mit einem Millipore-Filtersterilisationsröhrchen. Machen Sie 10 ml-Aliquots (1 mg/ml) und lagern Sie sie bei -20 μg; C für bis zu 6 Monate. Bei 4 Grad platzieren; C über Nacht vor Gebrauch.
EGF	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 236-EG-01M	Bei der Herstellung von 100 ng/ml EGF-Rekonstitution von 500 & micro; g/ml in sterilem PBS. Fügen Sie als nächstes 2 ml steriles PBS zu 1 mg EGF hinzu und stellen Sie 500 & Mikro her. g/mL EGF-Lösung. Aliquot 100 &Mikro; L EGF in 20 Röhrchen.
Fisherbrand 6 cm Petrischalen mit durchsichtigem Deckel	Fischer	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Zellheber	Fischer	08-100-240	N/A
Fisherbrand Klarglasfläschchen der Klasse B mit Gewinde und angebrachten Verschlüssen	Fischer	03-338B	N/A
Fisherbrand Einweg-Pasteur-Pipette aus Borosilikatglas	Fischer	Artikel-Nr.: 13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Objektträger Einbettmedium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Anti-E-Cadherin von Ziegen	Forschung & Forschung D-Systeme	Nr. AF648	1:400 Verdünnung (Primärer Antikörper)
Anti-SOX17-Ziege	Forschung & Forschung D-Systeme	Nr. AF1924	1:500 Verdünnung (Primärer Antikörper)
HCOs Strukturierungsmittel	N/A	N/A	Grundisches Darmmedium, 100 ng/mL EGF und 100 ng/mL BMP2. Bei der Zubereitung von BMP2 1 ml steriles 4 mM HCl 0,1 % BSA in BMP2-Fläschchen (100 & Mikro; g). Aliquot 25 µ L der BMP4-Lösung in 4 Röhrchen. Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Hämozytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Humane pluripotente Stammzellen (hPSC)	Einrichtung für pluripotente Stammzellen	N/A	Die Zellen wurden in einer mit Matrigel beschichteten 24-Well-Platte (Thermo Scientific 73520-906) ausgesät.
Eiskalte 4%ige Paraformaldehyd-Lösung (PFA)	N/A	N/A	N/A
Eiskalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	N/A	N/A	Der pH-Wert muss 7,4 betragen.
ImmEdge Hydrophober Barrierestift	Vector Laboratorien	101098-065	N/A
Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs)	Einrichtung für pluripotente Stammzellen (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Andere hESC- oder iPSC-Linien können verwendet werden, aber das Protokoll muss für jede Zelllinie optimiert werden.
Leica Mikrotom	N/A	N/A	N/A
LSM 880			Konfokales Mikroskop
Matrigel Basalmembran-Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix	Corning	354277	Bereiten Sie 4 x Matrigel-Aliquots zu, was einem Volumen entspricht, das ausreicht, um genügend verdünntes Matrigel für 4 x 6-Well-Gerichte herzustellen.
Induktionsmedium für den mittleren Hinterdarm (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nicht-essentielle Aminosäuren (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 & Mikro; M CHIR99021 und 500 ng/mL FGF4. Das Basismedium ist bis zu 3 Wochen haltbar, sollte aber sofort nach Zugabe von Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Sphäroide im mittleren Hinterdarm	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Maus Anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 Verdünnung (Primärer Antikörper)
Maus Anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 Verdünnung
mTeSR1 vollständiges Wachstumsmedium	Technologien für Stammzellen	85870	Geben Sie 100 ml mTeSR-Supplement (85870) in ein 400-ml-mTeSR-Medium (85870) und aliquotieren Sie es in 50-ml-Röhrchen, wobei eine Kontamination vermieden wird. Bei 4° lagern; C bis zum Gebrauch.
Murray's Clear-Lösung (auch bekannt als BABB)	Murrays	N/A	1:2 Benzylbenzoat und Benzylalkohol.
NOG HIO Musterung mittel	N/A	N/A	Grundlegendes Darmmedium, 100 ng/mL EGF und 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 & micro; g NOGGIN in 250 & micro; l steriles PBS mit 0,1 % BSA).
NukleoSpin-RNA	Takara	740955.25	Andere RNA-Isolationskits können verwendet werden.
Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale mit 24 Vertiefungen (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale 24 Vertiefungen, beschichtet mit Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale 6-Wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon Delta-Oberflächen-Gewebekulturschale 6-Wells, beschichtet mit  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth-Medium für HIOs, CTRL-HIOs und HCOs	N/A	N/A	Basis-Darmmedium und 100 ng/mL EGF (Endkonzentration)
Phosphatpuffer Kochsalzlösung, 0,5 % Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Zündkapseln	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	Die Primer sind in Tabelle 2 des Protokolls aufgeführt.
Kaninchen Anti-CDX2	Cell-Marke	EPR22764Y	1:100 Verdünnung (Primärer Antikörper)
Kaninchen Anti-SATB2	Cell-Marke	EP281	1:100 Verdünnung (Primärer Antikörper)
Rekombinantes humanes BMP-4-Protein	Forschung & Forschung D-Systeme	Artikel-Nr.: 314-BP-010	Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver bei 100 & Mikro; g/ml in sterilem 4 mM HCl mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA). Fügen Sie 4,17 mL HCl-Lösung zu 45,83 mL molekularem Wasser hinzu, insgesamt 50 mL 1 M HCl. Fügen Sie dann 200 & Mikro hinzu; L von 1 M HCl bis 49,8 mL Wasser in molekularer Qualität, insgesamt 50 mL von 4 mM HCl. Geben Sie anschließend 0,05 g BSA zu 50 mL 4 mM HCl und filtrieren Sie, um es steril zu machen. Aliquot steril 4 mM HCl 0,1 % BSA auf 33 Mikrozentrifugenröhrchen aufsummieren und bei -20 μC lagern. 100 μC hinzufügen l steriler 4 mM HCl 0,1 % BSA auf die BMP4-Fläschchen (10 & Mikro; g) um BMP4-Lösung bei 100 & Mikro herzustellen; g/ml.
Rekombinantes humanes FGF-4-Protein	Forschung & Forschung D-Systeme	235-F4-01M	Rekonstituieren bei 100 & Mikro; g/ml in sterilem PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin. Fügen Sie 0,05 g BSA in 50 ml PBS hinzu, um 0,1 % BSA zu erhalten. Filter 0.22 &Mikro; M BSA zur Sterilisation der BSA. Aliquot 10 mL 0,1 % BSA in 5 Röhrchen. Fügen Sie 1 mg FGF-4 in 10 ml steriles 0,1% BSA hinzu. Aliquot 250 &Mikro; L in vorgekühlte 40 Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei -80 °C lagern.
ROCK-Inhibitor Y-27632	Tocris	1254	Die Endkonzentration beträgt 10 mM (10 mmol/L). In DMSO bei 10 mM resuspendieren und mit Filter sterilisieren. Geben Sie 3 ml steriles PBS in jede Durchstechflasche. Aliqout 100 & micro; L des ROCK-Inhibitors in 30 Röhrchen abfüllen und bei -20 °C lagern.
SuperScript VILO cDNA-Synthese-Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus Objektträger
Tissue Tek O.C.T. Verbindung	VWR	25608-930	N/A