Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem in vitro System.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans ist seit seiner Einführung im Jahr 1963 ein wichtiges Modellsystem für die biologische Forschung. C. elegans wurde jedoch nicht vollständig in der biochemischen Untersuchung biologischer Reaktionen unter Verwendung seiner Kernextrakte wie In-vitro-Transkription und DNA-Replikation eingesetzt. Eine wesentliche Hürde für die Verwendung von C. elegans in biochemischen Studien ist die Störung der dicken äußeren Kutikula des Fadenwurms, ohne die Aktivität des Kernextrakts zu beeinträchtigen. Während mehrere Methoden verwendet werden, um die Kutikula zu brechen, wie z.B. Dounce-Homogenisierung oder Beschallung, führen sie oft zu Proteininstabilität. Es gibt keine etablierten Protokolle für die Isolierung aktiver Kernproteine aus Larven oder erwachsenen C. elegans für In-vitro-Reaktionen . Hier beschreibt das Protokoll detailliert die Homogenisierung von Larvenstadium 4 C. elegans unter Verwendung eines Balch-Homogenisators. Der Balch-Homogenisator verwendet Druck, um die Tiere langsam durch eine enge Lücke zu zwingen, die dabei die Nagelhaut bricht. Das einheitliche Design und die präzise Bearbeitung des Balch Homogenisators ermöglichen ein gleichmäßiges Schleifen der Tiere zwischen den Versuchen. Die Fraktionierung des aus dem Balch-Homogenisator erhaltenen Homogenats ergibt einen funktionell aktiven Kernextrakt, der in einer In-vitro-Methode zur Bestimmung der Transkriptionsaktivität von C. elegans verwendet werden kann.

Einleitung

Der kleine, freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein einfacher, aber leistungsfähiger Modellorganismus zur Beantwortung einer Vielzahl biologischer Fragestellungen. Seit ihrer Einführung im Jahr 1963 sind die Nematoden von unschätzbarem Wert für die Beantwortung von Fragen der Neurobiologie, des Stoffwechsels, des Alterns, der Entwicklung, der Immunität und der ^Genetik1. Zu den vielen Eigenschaften des Tieres, die es zu einem idealen Modellorganismus machen, gehören die kurze Generationszeit, die Wirksamkeit der RNA-Interferenz, der transparente Körper und die vollständigen Karten seiner zellulären Abstammung und seines Nervensystems.

Während die Beiträge des Nematoden zur Wissenschaft enorm sind, wurden sie nicht ausreichend genutzt, um das eukaryotische Transkriptionssystem aufzuklären, wobei der größte Teil unseres Verständnisses über diese Mechanismen aus Studien stammt, die Kernextrakt aus Hefe, Fruchtfliege und Säugetierzellkultur ^verwenden2. Die größte Hürde, die Forscher davon abhält, funktionellen Kernextrakt zu extrahieren, ist die zähe äußere Kutikula des Nematoden. Dieses Exoskelett besteht aus vernetzten Kollagenen, Cuticlinen, Glykoproteinen und Lipiden, wodurch C. elegans vom Larvenstadium bis zum Erwachsenenalter resistent gegen die Proteinextraktion durch chemische oder mechanische Kräfte ^ist3. Ein In-vitro-Transkriptionssystem unter Verwendung von C. elegans-Kernextrakt wurde einst entwickelt, aber aufgrund des begrenzten Anwendungsbereichs des Systems nicht weit verbreitet, und die Verwendung eines Dounce-Homogenisators zur Herstellung des Extrakts könnte zu Proteininstabilität ^führen4,5.

Im Gegensatz zum vorherigen Protokoll zur Isolierung von Kernextrakten, bei dem ein Dounce-Homogenisator zum Brechen von C. elegans verwendet wurde, verwendet dieses Protokoll einen Balch-Homogenisator. Der Balch Homogenisator besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Hartmetallkugel und einem Edelstahlblock mit einem Kanal, der von einem Ende zum anderen durchbohrt ist. Der Balch Homogenisator wird mit der Hartmetallkugel beladen und auf beiden Seiten verschlossen, um die Mahlkammer abzudichten. Spritzen können auf die beiden vertikalen Ports geladen werden, die in die Mahlkammer führen. Wenn das Material durch die Mahlkammer von einer Spritze zur anderen geleitet wird, drückt der Druck der Spritzen das Material durch einen engen Spalt zwischen der Kugel und der Wand der Kammer. Dieser langsame und konstante Druck bricht das Material, bis es eine konstante Größe erreicht, die in der Lage ist, den engen Spalt leicht zu passieren. C . elegans durch einen konstanten, aber sanften Druck durch den engen Spalt zu zwingen, bricht die Tiere auf und gibt ihren Inhalt in den umgebenden Puffer ab. Das Umschalten der Kugelgrößen verschärft den Spalt weiter, bricht die neu freigesetzten Zellen auf und befreit die Kerne in den Puffer. Mehrere Fälle von Zentrifugation trennen die Kerne vom Rest der Zelltrümmer, was die Sammlung eines sauberen Kernextrakts ermöglicht. Der Balch-Homogenisator wird aus mehreren Gründen gegenüber dem Dounce-Homogenisator bevorzugt: Das System kann eine große Anzahl von Tieren verarbeiten, so dass es möglich ist, eine hohe Menge an aktiven Proteinen in einem einzigen Versuch zu extrahieren; die präzise Bearbeitung der Kugeln und des Stahlblocks ermöglicht ein gleichmäßiges Schleifen zwischen mehreren Proben; Der schwere Stahlblock wirkt wie ein Kühlkörper, der die Wärme gleichmäßig von der Mahlkammer ableitet und eine Denaturierung verhindert.

Nach der Isolierung muss die Transkriptionsaktivität des Kernextrakts überprüft werden, bevor sie in biochemischen Experimenten verwendet wird. Traditionell wurde die Transkriptionsaktivität mit radioaktiv markierten Nukleotiden gemessen, um die neu synthetisierte RNA zu verfolgen und zu visualisieren. Die radioaktive Markierung kann jedoch aufwändig sein, da sie während des Gebrauchs und der Entsorgung Vorsichtsmaßnahmen ^erfordert6. Technologische Fortschritte ermöglichen es Forschern heute, viel weniger schädliche oder lästige Methoden zu verwenden, um selbst kleine RNA-Größen mit Techniken wie der quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR)⁷ zu messen. Hier beschreibt das Protokoll eine Methode zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 (L4) C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem In-vitro-System.

Protokoll

1. Medienvorbereitungen

1. Bereiten Sie sterile Lysogenbrühe (LB) Agarplatten und flüssige Medien nach den Anweisungen des Herstellers vor.
2. Streifen Escherichia coli (E. coli) Stamm OP50 auf einer LB-Agarplatte. Den Bakterienstreifen über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Lagern Sie die E. coli OP50 Streifenplatte nach der Inkubation bei 4 °C. Die E. coli OP50 Platte kann sicher bei 4 °C für 2 Wochen gelagert werden, wenn sie in Parafolie eingewickelt ist, um Feuchtigkeitsverlust zu verhindern.
4. Bereiten Sie 2 l Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) nach dem Rezept in Tabelle 1 vor.
   HINWEIS: Nystatin ist optional. Nystatin hilft zu verhindern, dass Schimmel und andere Pilzverunreinigungen auf den NGM-Platten wachsen. Die großen Platten mit einem Durchmesser von 150 mm haben eine höhere Chance, Pilzsporen zu fangen, wenn der Deckel zum Gießen und Aussaaten von E. coli OP50 entfernt wird. Nystatin kann vorgemischt in steriler Lösung von Anbietern für 10.000 Einheiten / ml erworben oder als steriles Pulver gekauft und mit sterilem Wasser gemischt werden. Nystatin kann weder autoklaviert noch effektiv filtriert werden. Die Beachtung der aseptischen Technik ist entscheidend beim Mischen einer Nystatinlösung im Labor. Autoklav 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 und 1 M _MgSO4 bei 121 °C für 15 min. Filter sterilisieren Cholesterin durch einen 0,22 μm Filter, nachdem es in 95% Ethanol gelöst wurde.
5. Nachdem Sie die Reagenzien in das Medium gegeben haben, gießen Sie NGM in vierzig 150 mm Petrischalen. Jede 150-mm-Schüssel benötigt 50 ml zum Befüllen. Lassen Sie die NGM-Platten über Nacht bei Raumtemperatur abkühlen.
6. Impfen Sie zwei 50 mL konische Röhrchen mit 25 ml sterilem LB mit E. coli OP50 aus der vorherigen Streifenplatte. Die Brühe bei 37 °C für 24 h in einem Schüttelbrutschrank bei 200 U/min inkubieren.
   HINWEIS: Um die Konsistenz zu gewährleisten, impfen Sie beide Röhrchen mit derselben einzelnen Kolonie von der Streifenplatte. Wenn sich dies als schwierig erweist, impfen Sie 5 ml sterile LB mit einer einzigen Kolonie in einem konischen 50-ml-Röhrchen und inkubieren Sie die Kultur für 16 h bei 37 ° C in einem Schüttelbrutschrank, der am Tag vor der Vorbereitung der NGM-Platten bei 200 U / min gehalten wird. Lagern Sie die frische Flüssigkultur bei 4 °C bis zu zwei Tage. Impfen Sie die beiden 25 ml Brühe mit 25 μL Flüssigkultur und inkubieren Sie unter den gleichen Bedingungen wie oben erwähnt.
7. Samen Sie frische NGM-Platten mit 1 ml frischer E. coli OP50 Flüssigkultur und verteilen Sie sie mit einem flammensterilisierten Streuer gleichmäßig über die Oberfläche der Platte aseptisch, um einen großen Bakterienrasen zu schaffen, der den Großteil der Platte bedeckt, wobei darauf zu achten ist, dass die Bakterien nicht von Rand zu Rand verteilt werden. Lassen Sie die E. coli OP50 72-96 h bei Raumtemperatur wachsen oder bis ein sichtbar dicker Rasen erscheint.
   HINWEIS: Nach 24 h die frisch gesäten NGM-Platten in einen abgedeckten Behälter geben, um den Feuchtigkeitsverlust zu reduzieren und die Lebensdauer der Platten zu verlängern.

2. Synchronisierung von Tierzubereitungen und Bleichmitteln

1. Übertragen Sie 5 gut genährte, wildartige, gravide erwachsene C. elegans auf jede der 10 frischen NGM-Platten, die mit E. coli OP50 gesät wurden, für insgesamt 50 Tiere.
2. Erlauben Sie den Tieren, Eier zu legen. Lassen Sie die Nachkommen bei 20 °C wachsen, bis sie das Gravid-Adult-Stadium erreichen.
3. Verwenden Sie 15 ml M9-Puffer (Tabelle 2), um die neuen gut genährten Wildtyp-, graviden Erwachsenen aus den zehn Erhaltungsplatten zu sammeln und die Tiere in ein markiertes konisches 15-ml-Röhrchen zu überführen.
4. Zentrifugieren Sie die Tiere bei 1.000 x g für 3 min, um alle Tiere am Boden des Röhrchens zu pelletieren.
5. Mischen Sie in einem separaten, beschrifteten konischen 15-ml-Rohr 2 ml Bleichmittel mit 5 ml 1 N NaOH für die Bleichmittelsynchronisation. Vortex die Lösung gründlich mischen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Bleichmittel + NaOH-Lösung am selben Tag, an dem sie darauf vorbereitet ist, wirksam zu sein.
6. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig von den zentrifugierten Tieren mit einer 10 ml sterilen Pipette. Versuchen Sie, so viel M9-Puffer wie möglich zu entfernen, um das Brechen von Tieren zu verbessern.
7. Geben Sie 500 μL der Bleichmittel + NaOH-Lösung in das Tierpellet und starten Sie einen Timer für 4 min.
8. Entweder von Hand oder mit einer Wippe, schaukeln Sie das Rohr vorsichtig, um das Tierpellet vollständig zu brechen und die Tiere sich frei in der Bleichmittel + NaOH-Lösung bewegen zu lassen. Schaukeln Sie die Röhre während der gesamten Dauer von 4 Minuten weiter.
   HINWEIS: Die Menge an Bleichmittel + NaOH-Lösung, die benötigt wird, kann je nach Größe des zu synchronisierenden Tierpellets variieren. Optimieren Sie diese Technik im Voraus mit unterschiedlichen Mengen an Tieren und Bleichmittel + NaOH-Lösung.
9. Überprüfen Sie nach 4 Minuten die Brucheffizienz unter einem Dissektionsmikroskop. Stellen Sie sicher, dass ein Großteil der erwachsenen Tiere mit Gravid gebrochen und ihr innerer Inhalt, einschließlich der Eier, freigesetzt wird.
10. Wenn die Tiere nicht aufgebrochen sind, wirbeln Sie das Röhrchen kurz mit maximaler Geschwindigkeit und überprüfen Sie es dann erneut unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Während die Eier gegen die Bleichmittel + NaOH-Lösung resistent sind, sind sie nicht undurchlässig. Eier dürfen der Bleichmittel + NaOH-Lösung nicht länger als nötig ausgesetzt werden. Ein zu langes Abschleppen während des Tierbruchschritts kann zu Entwicklungsproblemen für die Nachkommen führen.
11. 10 ml des M9-Puffers in die zerbrochene tierexperimentelle Lösung geben.
12. Die Eier und die Reste bei 1.000 x g für 3 min zentrifugieren.
13. Den Überstand wegpfeifen und sicherstellen, dass das neue Pellet mit allen Eiern am Boden des Röhrchens nicht berührt wird.
14. Weitere 10 ml des M9-Puffers zugeben und erneut für 3 min bei 1.000 x g zentrifugieren.
15. Wiederholen Sie die Schritte 2.13-2.14 noch zwei weitere Male, um sicherzustellen, dass nichts von der Bleichmittel + NaOH-Lösung übrig bleibt.
16. Nach der dritten M9-Pufferwäsche den Überstand entfernen und 10 ml des S-Basalpuffers hinzufügen (Tabelle 2).
17. Kehren Sie das Rohr um, um das Pellet am Boden zu brechen, um die Eier gleichmäßig im Puffer zu suspendieren.
18. Legen Sie das Röhrchen auf eine Wippe und schaukeln Sie das Röhrchen 22 h bei 20 °C vorsichtig, damit die Eier schlüpfen und den Larvenstadium 1 (L1) erreichen können.
19. Nach 22 h zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den synchronisierten L1-Tieren für 3 min bei 1000 x g.
20. Den Überstand pipettieren und verwerfen und etwa 1 ml Puffer im Röhrchen belassen.
21. Mit einer Mikropipette das Tierpellet stören, um eine homogene Suspension von L1-Tieren im verbleibenden Puffer herzustellen.
22. Ein einzelnes Tröpfchen der homogenen Suspension von L1-Tieren wird auf eine markierte 150 mm NGM-Platte übertragen, die mit E. coli OP50 ausgesät ist.
23. Berechnen Sie die Tierdichte pro Tropfen, indem Sie die Anzahl der L1-Tiere pro Tropfen mit einem Dissektionsmikroskop visuell zählen. Eine 150 mm NGM-Platte mit einem ausgewachsenen Rasen aus E. coli OP50 kann bis zu 500 Tiere des L1-Stadiums unterstützen, um das Gravid-Adult-Stadium zu erreichen.
24. Überführen Sie die L1-Tiere mit E. coli OP50 auf sechs 150 mm NGM-Platten. Achten Sie darauf, die Platte nicht zu überladen.
    HINWEIS: Wenn unklar ist, ob die Tiere genügend Nahrung für die Entwicklung zwischen L1 und Gravid Adult haben, fügen Sie weniger Tiere auf jeden Teller hinzu und verwenden Sie mehr Teller.
25. Lassen Sie die Tiere 72 h bei 20 °C wachsen, bis sie das graviide Erwachsenenstadium erreicht haben, und beginnen Sie mit der Eiablage.
26. Führen Sie eine zweite Runde der Bleichmittelsynchronisation an den synchronisierten, gut gefütterten erwachsenen Wildtyp-Gravid-Tieren durch.
27. Legen Sie die synchronisierten L1-Tiere auf zehn 150 mm NGM-Platten, die mit E. coli OP50 ausgesät sind, mit etwa 1.000 Tieren pro Platte.
28. Lassen Sie die neuen synchronisierten L1-Tiere 48 h bei 20 °C wachsen, bis sie das L4-Stadium erreichen.
    HINWEIS: Ziel ist es, ein ca. 700 - 800 μL Pellet von L4-Tieren zu erhalten. Zu viele Tiere können die Verwendung des Balch-Homogenisators erschweren. Dies kann zu Muskelzerrungen beim Betrieb des Homogenisators und möglichen Leckagen aus den Spritzen aufgrund des erhöhten Drucks führen.

3. Balch Homogenisator Vorbereitung

1. Bereiten Sie sowohl hypotone als auch hypertone Puffer vor, wie in Tabelle 3 und Tabelle 4 erwähnt.
   HINWEIS: Die hypotonen und hypertonen Puffer können im Voraus vorbereitet und bei 4 °C sicher gelagert werden.
2. Reinigen Sie den Balch-Homogenisator, indem Sie die Mahlkammer mit 70% Ethanol fluten, und spülen Sie die Kammer dann mit deionisiertem Wasser ab, um überschüssiges Ethanol zu entfernen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Laugen, um den Balch-Homogenisator zu reinigen. Gründliches Spülen mit Ethanol und entionisiertem Wasser sollte ausreichen, um es zu reinigen.
3. Setzen Sie die 7,9820 mm (18 μm Spaltabstand) lange Wolframcarbidkugel in die Schleifkammer ein.
4. Verschließen Sie jedes Ende des Fasses des Balch Homogenisators und sichern Sie die Kappen mit den mitgelieferten Rändelschrauben.
5. 5 ml "kompletter hypotonischer Puffer" pro Probe zubereiten: 5 μL 1 M DTT (Endkonzentration: 1 mM DTT) und 100 μL 100x Proteaseinhibitor, Einwegcocktail (Endkonzentration: 2x) zugeben. Halten Sie den Puffer auf Eis.
6. 5 ml "vollständiger hypertoner Puffer" pro Probe zubereiten: 5 μL 1 M DTT (Endkonzentration: 1 mM DTT) und 100 μL 100x Proteaseinhibitor, Einwegcocktail (Endkonzentration: 2x) zugeben. Halten Sie den Puffer auf Eis.
   HINWEIS: Verwenden Sie den vollständigen hypotonen und hypertonen Puffer am selben Tag der Zubereitung. Bewahren Sie es nicht für die spätere Verwendung auf. 1 M DVB-T als Einweg-Aliquots bei -20 °C lagern. Den Proteasehemmer-Einwegcocktail bei 4 °C lagern.
7. Füllen Sie eine sterile 2-ml-Spritze mit 1 ml "komplettem hypotonischen Puffer" und spülen Sie vorsichtig die Mahlkammer des Balch-Homogenisators. Lassen Sie ungefähr 500 μL "vollständigen hypotonen Puffer" in der Kammer.
8. Den gespülten Homogenisator auf Eis lagern und 30 min abkühlen lassen.
   HINWEIS: Der Homogenisator muss vor dem Mahlen der Tiere eiskalt sein. Der Mahlprozess kann durch Reibung Wärme erzeugen und die Kernproteine denaturieren. Stellen Sie sicher, dass der Metallhomogenisator eiskalt ist, um dies zu verhindern. Achten Sie darauf, zu vermeiden, dass Wasser aus dem umgebenden Eis in den Homogenisator gelangt. Verwenden Sie zwei sterile Spritzen, um die Löcher im Homogenisator zu stopfen und unbeabsichtigte Flüssigkeiten daran zu hindern, in die Mahlkammer einzudringen.

4. Sammlung von Tieren

HINWEIS: Es wird eine Kurzanleitung bereitgestellt, in der die wichtigsten Schritte für die Sammlung, Unterbrechung und Fraktionierung der Tiere aufgeführt sind (Abbildung 1).

1. Sammeln Sie die gut gefütterten L4-Tiere mit M9-Puffer in einem 15 mL konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Tiere bei 1000 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Tierpellet weiter, bis der Überstand klar ist.
2. Die Tiere mit 3 ml 4 °C hypotonem Puffer waschen und 3 min bei 1000 x g erneut zentrifugieren.
   HINWEIS: Während der letzten Wäsche mit dem 4 °C hypotonischen Puffer können die Tiere an der Seite des Röhrchens kleben. Dies ist normal und kann zu einem geringen Verlust von Tieren während der Entfernung des Überstandes führen.
3. Entfernen Sie den hypotonen Puffer und fügen Sie dem Tierpellet 1 ml "vollständigen hypotonischen Puffer" hinzu. Die Suspension des Tieres wird in eine neue sterile 2-ml-Spritze gegeben.
   HINWEIS: Während Sie die Tiere mit einer Mikropipette auf die Spritze geben, pipettieren Sie vorsichtig eine sterile 0,1% ige Tween20-Lösung, um die Innenseite der Pipettenspitze zu beschichten, um die Anzahl der Tiere zu reduzieren, die durch das Verkleben an den Wänden der Pipettenspitze verloren gehen.

5. Fraktionierung

1. Homogenisieren Sie die Tiere auf Eis, indem Sie die Tiere vorsichtig durch die Mahlkammer des mit der 7.9820 mm Kugel beladenen Balch Homogenisators in eine neue sterile Spritze drücken. Wiederholen Sie das Schieben der Tiere durch die Mahlkammer für 30 vollständige Zyklen.
   HINWEIS: Ein "vollständiger Zyklus" ist definiert als die vollständige Auf- und Abwärtsbewegung des Kolbens einer Spritze.
   Bei diesem Schleifschritt werden 7,9820 mm Kugel (18 μm Kugellager) verwendet.
2. Nach 30 Zyklen so viel wie möglich von der tierischen Suspension aus dem Balch Homogenisator entfernen und die Spritze in einem 1,7 ml Mikroröhrchen aufbewahren.
3. Entfernen Sie die 7.9820 mm Kugel aus der Mahlkammer und reinigen Sie sie mit entionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Kugel und bringen Sie sie in die beschriftete Tube zurück.
4. Führen Sie die Kugel mit einer Größe von 7,9880 mm (12 μm Spaltabstand) in die Mahlkammer ein und verschließen Sie den Homogenisator erneut.
5. Spülen Sie die Mahlkammer erneut mit 1 ml eiskaltem "komplettem hypotonischen Puffer".
6. Schleifen Sie die Suspension für 25 komplette Zyklen.
7. Nach 25 Zyklen die tierische Suspension aus dem Balch Homogenisator nehmen, die Suspension in ein sauberes 1,7 ml Mikroröhrchen geben und auf Eis lagern.
   HINWEIS: Zerlegen und reinigen Sie den Balch Homogenisator mit 70% Ethanol und entionisiertem Wasser. Achten Sie darauf, die 7,9880-mm-Kugel in das richtige Rohr zurückzubringen.
8. Pelletieren Sie die Tierkörper und Ablagerungen durch Zentrifugieren der Suspension bei 500 x g, 4 °C für 5 min.
9. 40 μL des Überstandes werden in ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Eingangsfraktion" pipettiert und auf Eis gespeichert.
   HINWEIS: Schreiben Sie alle Etiketten mit einem alkoholdichten Stift, um zu vermeiden, dass sie später verschmiert werden.
10. Übertragen Sie den verbleibenden Überstand in ein neues 1,7-ml-Rohr, wobei Sie darauf achten, dass das Pellet nicht am Boden des Rohrs berührt wird, und entsorgen Sie das Pellet dann.
11. Zentrifugieren Sie den Überstand, um die Kerne bei 4.000 x g, 4 °C für 5 min zu pelletieren.
12. Übertragen Sie den Überstand, wobei darauf zu achten ist, die pelletierten Kerne nicht zu stören, in ein neues 1,7 ml Röhrchen und kennzeichnen Sie das Röhrchen als "zytosolische Fraktion".
    HINWEIS: Zentrifugieren Sie die zytosolische Fraktion weiter bei 17.000 x g, 4 °C für 30 min, um verbleibendes unlösliches Material zu entfernen, und verwenden Sie es als Negativkontrolle für Western Blots (speziell für Kernproteine).
13. Waschen Sie das Kernpellet mit 500 μL "vollständigem hypotonischem Puffer" und übertragen Sie das Pellet in ein neues 1,7 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie das suspendierte Pellet bei 4.000 x g, 4 °C für 5 min.
14. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 500 μL frischen "vollständigen hypotonischen Puffer" in das Kernpellet und übertragen Sie die Suspension auf ein neues 1,7 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 4.000 x g, 4 °C für 5 min.
15. Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 40 μL "vollständigem hypertonen Puffer" auf. Übertragen Sie die neue Kernsuspension auf ein neues 1,7-ml-Rohr, kennzeichnen Sie das Rohr als "Kernfraktion" und lagern Sie es auf Eis.
16. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der drei Fraktionen mit einem fluoreszierenden Quantifizierungskit.
    HINWEIS: Die Menge an Kernprotein, die mit dieser Methode gewonnen wird, kann zwischen 1-2 μg/μL liegen.
17. Aliquotieren Sie die Kernfraktionen in Einwegröhrchen, die 6 μg des Kernproteins enthalten, und frieren Sie sie in einem Trockeneis- und Ethanolbad ein. Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.

6. Transkriptionsassay

1. Einen Heizblock einschalten und auf 30 °C vorheizen.
2. Entfernen Sie Folgendes aus dem In-vitro-Transkriptionssystem von Nulcear Extract: 50 mM _MgCl2, Kernextrakt 1x Transkriptionspuffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP und die CMV-Promotor-Positivkontrollvorlage. Tauen sie auf Eis.
   HINWEIS: Amplifizieren Sie die Positivkontroll-DNA-Vorlage mit einer High-Fidelity-Polymerase und speichern Sie sie als normalisierte Einweg-Aliquots.
3. Mischen und zentrifugieren Sie die aufgetauten rNTPs, bevor Sie eine 10 mM Arbeitslösung vorbereiten.
   HINWEIS: Fügen Sie 2 μL von jedem rATP, rCTP, rGTP und rUTP zu 12 μL _H2O hinzu, um 10 mM jedes rNTP zu erreichen. Diese Zusammensetzung kann bei Bedarf hochskaliert werden.
4. Aliquotieren Sie die rNTP-Mischung zu markierten Einwegröhrchen und lagern Sie sie bei -20 °C für die zukünftige Verwendung.
5. In ein frisches 1,5 ml Röhrchen mit der Aufschrift "Mastermix" die in Tabelle 5 genannten Reagenzien pro Reaktion geben
6. Übertragen Sie 14 μL des Mastermixes auf jedes Reaktionsröhrchen
7. Jedem Reaktionsröhrchen werden 11 μL minus (Volumen für 5 μg des Kernextrakts) 1x Transkriptionspuffer zugegeben.
8. Jedem Reaktionsröhrchen werden 5 μg des Kernextrakts zugegeben.
9. Klopfen Sie vorsichtig auf das Reaktionsrohr, um den Inhalt im Inneren zu mischen, und zentrifugieren Sie die Röhrchen nach dem Mischen, um sicherzustellen, dass kein Reaktionsmaterial an der Wand der Röhrchen klebt.
10. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 30 °C für 30 min.
11. Stoppen Sie die Reaktion sofort, indem Sie 400 μL RLT-Puffer hinzufügen, der vom RNA-Extraktionskit bereitgestellt wird.
    HINWEIS: An diesem Punkt ist es sicher zu stoppen. Proben können bei -80 °C bis zur weiteren Reinigung mit dem RNA-Extraktionskit gelagert werden.

7. RNA-Bereinigung

1. Bereiten Sie die DNase I-Stammlösung mit dem RNase-Free DNase-Set vor, das im RNA-Extraktionskit enthalten ist. Lösen Sie die lyophilisierte DNase I in 550 μL RNase-freiem Wasser auf. Mischen Sie die Lösung vorsichtig. Nicht wirbeln . Aliquotieren Sie die DNase I Lösung in 10 μL Einwegröhrchen und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
2. Bereiten Sie 70% und 80% Ethanol unter Verwendung von Ethanol in Molekularqualität und RNase-freiem Wasser vor.
3. Verschieben Sie die Proben und Reagenzien in einen RNase-freien Arbeitsbereich, bevor Sie mit der Bereinigung beginnen.
4. Geben Sie 400 μL 70% Ethanol zu jeder Probe hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um gut zu mischen.
5. 400 μL der Probe in eine markierte RNA-Extraktionsspinsäule mit einem 2 ml Sammelröhrchen überführen und die Probe bei 8.500 x g für 30 s zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
6. Wiederholen Sie Schritt 7.5 mit der verbleibenden Probe und verwerfen Sie den Durchfluss.
7. Fügen Sie 350 μL RW1-Puffer (RNA-Extraktionskit) zu jeder Säule hinzu. Zentrifugieren Sie die Säulen bei 8.500 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
8. Fügen Sie 70 μL RDD-Puffer (RNA-Extraktionskit) zu einem einzigen 10 μL Aliquot DNase I-Stammlösung hinzu und mischen Sie vorsichtig. Nicht wirbeln.
9. Die DNase I Inkubationsmischung (80 μL) direkt in die Spinsäulenmembran geben. Inkubieren Sie die Säulen bei Raumtemperatur für 15 min.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die DNase I-Lösung zur Membran hinzuzufügen. Vermeiden Sie es, einen Teil der Lösung an die Säulenwand oder den O-Ring zu verlieren.
10. Nach 15 min 350 μL RW1-Puffer in die Säulen geben. Zentrifuge für 30 s bei 8.500 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss.
11. Legen Sie die Säulen in neue 2 ml Auffangrohre. Fügen Sie 500 μL RPE-Puffer (RNA-Extraktionskit) zur Spinsäule hinzu. Zentrifugieren Sie die Säulen bei 8.500 x g für 30 s, um die Membran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
12. Zu jeder Säule 500 μL 80% Ethanol geben und die Säulen bei 8.500 x g für 30 s zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
13. Legen Sie die Säulen in neue 2 ml Auffangrohre. Lassen Sie die Säulendeckel offen und zentrifugieren Sie die Säulen bei 17.900 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Durchfluss.
14. Legen Sie die Säulen in beschriftete 1,7 ml Rohre. 17 μL RNase-freies Wasser direkt in die Mitte der Spinsäulenmembran geben. Lassen Sie die Säulen 1 Min. bei Raumtemperatur ruhen. Zentrifugieren Sie die Säulen bei 17.900 x g für 1 min.
15. Entsorgen Sie die Säule und bewahren Sie das 1,7 ml Röhrchen mit der frisch gereinigten RNA-Probe auf.

8. DNA-Verdauung

1. Zwei Wärmeblöcke bei 37 °C und 65 °C vorheizen.
2. Jeder Probe werden 2 μL 10x Reaktionspuffer zugesetzt.
3. Jeder Probe werden 1 μL (1 MBU) DNase zugegeben.
4. Stellen Sie eine Pipette auf 10 μL und pipettieren Sie die neue Lösung nach oben und unten, um sie vorsichtig zu mischen. Nicht wirbeln.
5. Inkubieren Sie die RNA-Proben bei 37 °C für 30 minuten, um die verbleibende DNA zu verdauen.
6. Inaktivieren Sie die DNase, indem Sie die Proben auf dem Wärmeblock bei 65 °C für 10 min inkubieren.
   HINWEIS: Es ist sicher, bei diesem Schritt aufzuhören und die RNA bei -80 ° C zu lagern, um später eine umgekehrte Transkription durchzuführen.

9. Umgekehrte Transkription

1. Fügen Sie bei der Programmierung des Thermocyclers vor der Inkubation einen zusätzlichen Schritt von 1 h, 37 °C hinzu, um den Thermocycler vorzuwärmen. Führen Sie das Programm mit dem "Vorwärmschritt" während der Probenvorbereitung aus und lassen Sie den Thermocycler 37 °C erreichen. Wenn die Proben für die umgekehrte Transkription fertig sind, überspringen Sie den 37 °C-Vorwärmschritt und fahren Sie mit dem eigentlichen Inkubationsschritt fort (Tabelle 6). Wenn der Thermocycler nicht über eine Skip-Funktion verfügt, fügen Sie vor der Inkubation einen Schritt von 1 min 37 °C hinzu. Lassen Sie den Thermocycler auf die richtige Temperatur erhitzen, bevor Sie das System pausieren und die vorbereiteten Proben hinzufügen.
2. Bereiten Sie eine 10 μM-Arbeitslösung des Transkriptions-Reverse-Primers in RNase-freiem _H2O vor und lagern Sie sie auf Eis.
3. Tauwetter auf Eis, 10x Puffer aus dem Reverse Transcription Kit, dNTP-Mix (je 5 mM dNTP), RNase-Inhibitor und die Reverse-Transkriptase.
4. Bereiten Sie einen Mastermix (pro Reaktion) vor, indem Sie die in Tabelle 7 genannten Bestandteile in ein sauberes 0,2 ml PCR-Röhrchen geben.
5. Aliquot 18 μL des Mastermixes in neue 0,2 ml PCR-Röhrchen für jede Probe.
6. Fügen Sie 2 μL der mit DNase behandelten RNA für jede Probe in ihre jeweils markierten Röhrchen hinzu.
7. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 1 h in einem vorgewärmten Thermocycler.
8. Verschieben Sie die Proben nach der umgekehrten Transkription zur Lagerung auf -20 °C oder fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort.
   HINWEIS: Es ist sicher, bei diesem Schritt aufzuhören; Lagern Sie die cDNA bei -20 °C für den späteren Gebrauch.

10. Spezifische Produktverstärkung

1. Tauwetter auf Eis: cDNA, 10 μM Transkription Forward und 10 μM Transkription Reverse Primer, und die PCR 2x Premix A.
   HINWEIS: Aliquotieren Sie die PCR 2x Premix A in kleinere Volumina, um die Tauzeit zu verkürzen.
2. Erstellen Sie einen Mastermix (pro Reaktion), indem Sie die in Tabelle 8 genannten Bestandteile in ein sauberes 0,2 ml PCR-Röhrchen geben.
3. Aliquot 24 μL Mastermix für jede Probe in sauber markierte 0,2 ml PCR-Röhrchen.
4. 1 μL cDNA jeder Probe in die jeweiligen Röhrchen geben.
5. Inkubieren Sie die Proben im Thermocycler unter den in Tabelle 9 genannten Programmbedingungen.
6. Lagern Sie die PCR-Produkte nach der Inkubation bei 4 °C oder -20 °C für eine längerfristige Lagerung.

11. Gelanalyse

1. Verwenden Sie 1x TAE-Puffer, um ein Gel herzustellen, das 2% w/ v Agarose und 1x Gelfleck enthält.
2. Führen Sie die PCR-Produkte bei 50 V und 300 mA für 1 h oder bis eine klare Bandtrennung vorliegt.
3. Bilden Sie das Gel mit dem automatisierten Belichtungsprogramm ab, das im Gel-Imager vorinstalliert ist.

Ergebnisse

Die Einhaltung der skizzierten Schritte sollte funktionellen Kernextrakt ergeben (Abbildung 1), Abweichungen in den Mahl- oder Waschschritten können zu schlechter Aktivität oder geringen Ausbeuten führen. Wenn funktioneller C. elegans-Kernextrakt erhalten wird, transkribiert er die Region stromabwärts des CMV-Promotors auf der DNA-Vorlage, wenn er dem zuvor beschriebenen In-vitro-Assay hinzugefügt wird. Das resultierende RNA-Transkript kann...

Diskussion

C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung des eukaryotischen Transkriptionssystems wegen seiner kostengünstigen Wartung und der Einfachkeit der genetischen Manipulation. Hier wird ein Protokoll zur konsistenten Isolierung von funktionell aktivem Kernextrakt aus L4 C. elegans beschrieben. Obwohl sich dieses Protokoll auf die Visualisierung der Transkriptionsaktivität konzentrierte, kann die posttranskriptionell produzierte cDNA mit RT-qPCR quantifiziert werden, um eine genauere Mes...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verbrauchsmaterialien und Reagenzien0,2
mL 8-Streifen-Röhrchen & Flache Streifenkappen, klar	Genesee Scientsp	; 24-706
0,2 mL Einzelne PCR-Röhrchen	Genesee Scientific	24-153G
1,7 mL sterile Mikroröhrchen	Genesee Scientific	24-282S
100% absolutes Ethanol in molekularer Qualität	Fisher Scientific	BP2818
100% Ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serologische Pipette	VWR international	89130-898
150 mm Petriplatten	Tritech Research	T3325
15 mL konische Zentrifugenröhrchen	Genesee Scientific	28-103
20 mL Kunststoffspritzen	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject Spritzen	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL Vakuumfilterbecher 0,22 µ m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
konische Zentrifugenröhrchen 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
serologische Pipette 50 mL	VWR international	89130-902
5 mL serologische Pipette	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Wissenschaftlich	CA3510-6
Alkohol-Marker	VWR International	52877-310
Bacto Pepton	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calciumdichlorid	Millipore Sigma	C4901
Cholesterin	Millipore Sigma	C8667
Kontrolle DNA-Tempel-Klonierungsprimer, Vorwärts 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Kontrolle der DNA-Tempelklonierung von Primern, Vorwärts 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg tcg cca tga t -3'
Deionisiertes Wasser
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA-Gel-Färbung, SYBR-sicheres	Invitrogen	S33102
DNA-Leiter-Mix, O' Gen-Herrscher	Fisher Scient	SM1173
DNA-Ladefarbstoff, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNase, Baseline-ZERO	Luigen
Trockeneis
Escherichia coli OP50 Stamm	CGC	OP50
Eisessig	Fisher Scientific	A38
Glycerin	Millipore Sigma	G6279
In-vitro-Transkriptionssystem für HeLa-Kernextrakt, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Lösung, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Salzsäure 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochloritbleiche	Clorox
LB Bouillon	Millipore Sigma	L3022
Magnesiumdichlorid	Millipore Sigma	M8266
Magnesiumsulfat	Millipore Sigma	M7506
Mittelschwere Schalen	Fisher Scientific	02-202-101
Objektträger, Vista Vision	VWR International	16004-368
Wasser in molekularer Qualität, Hypure	Hyclone Laboratories
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR-System, FailSafe mit Premix A	Lucigen
Kaliumchlorid	Millipore Sigma	P39111
Kaliumphosphat zweibasisch	Millipore Sigma	P3786
Kaliumphosphat monobasisch	Millipore Sigma	P0662
Protease-Inhibitor, Halt Einmal-Cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
Protein-Assay-Kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
Reverse Transkriptionskit, Sensiscript	Qiagen	205211 RNA-Extraktionskit
RNeasy Microkit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Angewandte Biosysteme
Natriumchlorid	VWR International	BDH9286-12KG
Natriumhydroxid	Millipore Sigma	1-09137
Steriler Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 & Mikro; m Polyethersulfon-Membran	VWR international	28145-501
Saccharose	VWR International	200-334-9
Transkriptionsprimer, Vorwärts 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
Transkriptionsprimer, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Ausrüstung
-20 ° C Inkubator	ThermoFisher Scientific
20 ° C Inkubator	ThermoFisher Scientific
37 ° C Inkubator	Forma Scientific
4 ° C Kühlschrank	ThermoFisher Scientific-80
° C Gefrierschrank	Eppendorf
Autoklav	Sanyo
Balch Homogenisator, isobiotec Zellhomogenisator	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Zentrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Zentrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissektionsmikroskop, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel-Bildgebungssystem, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gelsystem	ThermoFisher Scientific
Heizblock	VWR International	12621-048
Mikrozentrifugen, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Schaukelplattform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010