Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Zusammenfassung

Aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Astrozyten (hiPSC-A) und Neuronen (hiPSC-N) bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung der Pathophysiologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) in vitro. Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen (MEA) sind ein Mittel, um elektrische Feldpotentiale von großen Populationen von Neuronen aufzuzeichnen und die Netzwerkaktivität im Laufe der Zeit zu analysieren. Es wurde bereits gezeigt, dass das Vorhandensein von hiPSC-A, das unter Verwendung von Techniken zur Förderung eines Rückenmarks-Astrozyten-Phänotyps differenziert wird, die Reifung und elektrophysiologische Aktivität von regional spezifischen spinalspezifischen hiPSC-Motoneuronen (MN) des Rückenmarks im Vergleich zu denen verbessert, die ohne hiPSC-A oder in Gegenwart von Nagetier-Astrozyten kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um das Rückenmark hiPSC-A mit hiPSC-MN zu kokulturieren und die elektrophysiologische Aktivität mittels MEA-Aufzeichnungen aufzuzeichnen. Während die hier beschriebenen Differenzierungsprotokolle spezifisch für Astrozyten und Neuronen sind, die regional spezifisch für das Rückenmark sind, kann die Co-Cultureing-Plattform auf Astrozyten und Neuronen angewendet werden, die mit Techniken differenziert werden, die für andere Schicksale spezifisch sind, einschließlich kortikaler hiPSC-A und hiPSC-N. Diese Protokolle zielen darauf ab, einen elektrophysiologischen Assay bereitzustellen, um über Glia-Neuronen-Interaktionen zu informieren und eine Plattform für die Erprobung von Medikamenten mit therapeutischem Potenzial bei ALS zu bieten.

Einleitung

Aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Astrozyten (hiPSC-A) und Neuronen (hiPSC-N) sind leistungsfähige Werkzeuge für die Modellierung der Pathophysiologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) in vitro und bieten ein translationales Paradigma für Strategien zur Arzneimittelforschung¹. Forscher haben gezeigt, dass die Co-Kultur von hiPSC-A mit hiPSC-N die morphologische, molekulare, elektrophysiologische und pharmakologische Reifung beider Zelltypen verbessert und komplexe neuronale Netzwerke und Astrozyten-Neuronen-Interaktionen erzeugt, die ihren In-vivo-Gegenstücken ähneln ^2,3

Protokoll

1. Vorbereitung von Zellkulturmedien

1. Die einzelnen Zellkulturmedien werden unter Verwendung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzungen hergestellt.
2. Mischen und sterilisieren Sie die Medien in 500 ml filtrierten Flaschen und lagern Sie sie bis zu 2 Wochen lichtgeschützt bei 4 °C.

2. Aufrechterhaltung und Weitergabe nicht-konfluenter humaninduzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC)

1. Die Basalmembranmatrix (in Aliquots bei -80 °C gelagert) über Nacht in einem 2-8 °C Kühlschrank auftauen.
2. Verdünnen Sie die Basalmembranmatrix bei 1:100 (v/v) in kalter phosphatgepufferter Kochsalzl....

Ergebnisse

Das Protokoll zur Musterung des Rückenmarks für die Erzeugung von hiPSC-MN und hiPSC-A des Rückenmarks ist in Abbildung 1 dargestellt. In diesem Protokoll werden hiPS-Zellen beibehalten und als nicht-konfluente Kolonien durchgelassen (Abbildung 2A). Die Neurogenese wird (neuronale Induktion) durch duale SMAD-Hemmung durch die Zugabe von LDN193189 und SB431542 initiiert, wodurch das knochenmorphogenetische Protein (BMP) bzw. der transformierende Wachstumsfaktor-b.......

Diskussion

Bisher haben hiPSC- und MEA-basierte Methoden zur elektrophysiologischen Aufzeichnung von Astrozyten-Neuronen-Kokulturen im Bereich der ALS⁶ nur begrenzte Anwendung gefunden und sind im Gegensatz zu ihrer weiter verbreiteten Verwendung für die In-vitro-Modellierung von Epilepsie⁹ noch nicht vollständig auf humanen Plattformen anwendbar. Diese Plattform hat jedoch das Potenzial, pathophysiologisch relevante Fragen in der ALS-Forschung zu beantworten, wie z.B. die Me.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm sterile Kulturplatten	Falcon	353003
25 cm2 sterile Kulturflaschen	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Arbeitskonzentration 110 µ M
500 mL 0,2 &Mikro; m CA Filtersystem	Corning	430769
5 mL Pipette	Falcon	357543
6 Well sterile Kulturplatten	Falcon	3046
Amphotericin B	Gibco	15290018	Arbeitskonzentration 2,0 μ g/mL
Anionisches Detergens mit Protease-Enzym - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Arbeitskonzentration 1% m/v
Ascorbinsäure (ASAC)	Sigma	A4403	100 mg in 250 mL dH2O auflösen, um 0,4 mg/ml Stamm zu erhalten. Sterilfilter durch einen 0,22 &μ; m filtrieren, aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung bei 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 0,4 &Mikro; g/mL).
Axion CytoView MEA 24 Platten (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA Plattform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane Matrix - Matrigel	Corning	354277	Details im Protokoll
Tischmikroskop (steril unter der Zellkulturhaube)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Arbeitskonzentration10 μ M
Ziliärer neurotropher Faktor (CNTF)	Peprotech	450-13	Auflösen 100 &Mikro; g in 1 ml sterilem PBS und fügen Sie dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 & micro; g/ml. Aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
CO2 Tanks und Regler für Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µ g in 2,0387 mL DMSO, um eine 250 µ M Lagerbestände. Aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung 1:2000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 125 nM).
Cyanquixalin  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Arbeitsschwerpunkt 50 μ M
Dihydrokainsäure (DHK)	Tocris	111	Arbeitskonzentration 50 μ M und 300 μ M
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Arbeitskonzentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Kombinieren Sie 10 mL Essential 8 (10x)  Supplement mit 500 mL Essential 8 Wachstumsmedium (1x
)Fötales Rinderserum (FBS)	Thermofisher	16140071	Arbeitskonzentration 1x
Neurotroph aus Gliazelllinien (GDNF)	Peprotech	450-10	Auflösen 100 & Mikro; g in 1 ml PBS bis 100 & Mikro; g/ml, und fügen Sie dann 9 mL steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 & micro; g/ml. Aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Hämozytometer	Wahlmikroskopie	Sciences 63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Lösen Sie 200 mg in 100 mL PBS auf, um 2 mg/mL Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Stamm in 15 mL und 500 &; micro; L-Röhren. Für den Gebrauch 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 2 & Mikro; g/mL).
Feuchtigkeitskontrollierter Zellkultur-Inkubator	ThermoFisher	370	auf 37 º C, 5 % CO2
Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1)	R& D-Systeme	291-G1-200	Auflösen 200 &Mikro; g in 2 mL PBS bis 100 & Mikro; g/ml, fügen Sie dann 18 mL 0,1 % BSA-PBS hinzu, um 10 & Mikro herzustellen; g/mL lagern und bei -80 μC lagern. Aliquotieren und bei -80 μC einfrieren. 10 μm verdünnen; g/ml-Vorrat bei 1: 1000 für den Gebrauch. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Kainksäure	Abcam	ab144490	Arbeitskonzentration 5 μ M
Knockout-Serumersatz (KSR)	Thermofisher	10828	Arbeitskonzentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stammlösung 1 mg/ml, Arbeitskonzentration 10 & Mikro; g/mL (Beschichtung), 1 & Mikro; g/ml (Zellmedien)
LDN193189	Stemgent	04-0074	2 mg LDN in 500 µ L Chloroform, um 10 mM Vorrat zu erhalten. Aliquotieren Sie dies und frieren Sie bei -80 °C ein. Verdünnen Sie zur Verwendung zuerst das Material 1 bis 10 in DMSO [bis 1 mM], dann verdünnen Sie 1:5000 von 1 mM in das gewünschte Medium, um 0,2 & Mikro zu erhalten; M Arbeitslösung
L-Glutamin	Thermofisher	25030	Arbeitskonzentration 100x
MEA Glasplatten	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Mehrkanalpipette P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Arbeitskonzentration 1x
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	Thermofisher	11140050	Arbeitskonzentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher 15140122		Arbeitskonzentration 100x
Polyornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	100 mg in 1 mL ddW auflösen, um 100 mg/ml Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Bestand in 100 & micro; L-Röhren. (Arbeitskonzentration 100 &Mikro; g/mL)
Kaliumchlorid (KCl)	NA		NA Arbeitskonzentration100 mM
Purmorphamin (PMN)	Millipore-Sigma	540223	5 mg in 9,6 mL DMSO auflösen, um 1 mM Lösung zu erhalten. Aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung 1:1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 1 &Mikro; M).
Rekombinanter human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Zentrifuge kurz vor der Rekonstitution. Auflösen 100 & Mikro; g in 1 mL PBS bis 100 & Mikro; g/ml, und fügen Sie dann 9 mL steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 & micro; g/ml. Aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Retinsäure (RA)	Sigma	R2625	100 mg in 3,3 mL DMSO auflösen, um 100 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Bestand 100 µ L/Tube und frieren bei -80 °C ein. Nehmen Sie 200 &Mikro; L 100 mM Material und 10x verdünnen (1,8 mL DMSO hinzufügen), um 10 mM Material zu erhalten. Aliquot 50 &Mikro; L/Rohr  und bei -80 °C lagern. Zur Verwendung bei 1:10000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 2 & Mikro; M).
ROCK-I Hibitor	Peprotech	1293823	5 mg auflösen in 1480 & Mikro; L dH2O, um 10 mM Vorrat zu erhalten, aliquotiert und bei -80 μC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 500 verdünnen. (Arbeitskonzentration 20 & Mikro; M).
SB431542	Sigma	S4317	5 mg in 1,3 mL DMSO auflösen, um 10 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren und bei -80 °C einfrieren. Zur Verwendung bei 1:1000 verdünnen. (working con 10 & micro; M)
Sterile Zellkulturhauben	Baker Company	SG-600
Ergänzung B - B27 Ergänzung	Thermofisher	21985023	Arbeitskonzentration 50x
Ergänzung N - N2 Ergänzung	Thermofisher	17502048	Arbeitskonzentration 100x
Tisch-Zellkulturzentrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplaste  Film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Dissoziationsprotease im Gewebe - Dispase	StemCell Technologies	7923	Arbeitskonzentration 1x
Trypsin-Inhibitor	Sigma	T6522-1G	1 g in 100 ml ddH2O auflösen, um 10 mg/ml-Stamm zu erhalten. Aliquotieren und bei 4 μC lagern. Zur Verwendung wird das Trypsinvolumen 1:10 verdünnt. (Arbeitskonzentration 1 mg/ml).
Trypsin-EDTA (0,05%)	Thermofisher	2530054	Arbeitskonzentration 1x
Wasserbad	ThermoFisher	2332	Isotemp