Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden traditionell auf ihre regenerativen Eigenschaften untersucht, aber in jüngster Zeit standen ihre immunregulatorischen Eigenschaften im Vordergrund. Sie interagieren mit und regulieren die Aktivität von Immunzellen. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der MSC-Regulation der phagozytären Aktivität von Makrophagen. Makrophagen (MΦ) Phagozytose ist ein wichtiger Teil der angeborenen Reaktion des Immunsystems auf infektionen, und die Mechanismen, durch die MSC diese Reaktion modulieren, werden aktiv untersucht. Hier wird eine Methode zur Untersuchung der MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Zymosanpartikeln vorgestellt, die in Kokultur mit MSC zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind. Wenn die phagozytische Aktivität zunimmt und die markierten Zymosanpartikel in der sauren Umgebung des Phagolysosoms eingeschlossen sind, erhöht sich die Fluoreszenzintensität des pH-empfindlichen Moleküls. Mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen wird die phagozytische Aktivität mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen und kinetische Daten werden als Änderungen der relativen Fluoreszenzeinheiten über einen Zeitraum von 70 Minuten dargestellt. Um diese quantitativen Daten zu unterstützen, wird die Veränderung der phagozytischen Aktivität mittels dynamischer Bildgebung visualisiert. Die Ergebnisse dieser Methode zeigen, dass MSC in Kokultur die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisiertem Zymosan sowohl von naivem als auch von IFN-γ MΦ verbessert. Diese Daten ergänzen das aktuelle Wissen über die MSC-Regulation des angeborenen Immunsystems. Diese Methode kann in zukünftigen Untersuchungen angewendet werden, um die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen vollständig abzugrenzen.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind Vorläuferzellen, aus denen Bindegewebszellen entstehen. MSC sind in adulten Säugetiergeweben vorhanden und können aus dem Knochenmark isoliert werden¹. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften werden diese Zellen umfassend untersucht². Frühe Studien konzentrierten sich auf die MSC-Regulation von T-Zellen^3,4,5,^6, aber in jüngerer Zeit hat ihre Regulation von Makrophagenzellen (MΦ), einer wichtigen zellulären Komponente der angeborenen Immunität, erhöhte Aufmerks....

Protokoll

HINWEIS: Alle Mediumsvorbereitungs- und Zellkulturtechniken werden unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung einer Biosicherheitswerkbank mit laminarer Strömung durchgeführt. Alle beschriebenen Kulturinkubationsschritte werden mit einem Inkubator durchgeführt, der eine Atmosphäre von 37 °C, 5%_CO2und 95% Luftfeuchtigkeit aufrechterhält.

1. Zellkultur

1. Vorbereitung des Wachstumsmediums
   1. Für MSC und LADMAC fügen Sie 50 ml FBS und 5 ml 100x Antibiotikum / Antimykotikum-Mischung zu 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt hinzu.
   2. Für den MΦ werden 50 ml FBS, 100 ml LADMAC-Zustandsmedium (hergestellt nach den ....

Ergebnisse

Nach der Berechnung der mittleren ± REM für jede Gruppe zu allen Zeitpunkten werden die Daten im Liniendiagrammformat mit der Y-Achse als relative Fluoreszenzintensität und der X-Achse als Zeit dargestellt. Ergänzende Datei 1 enthält ein Beispiel für Rohdaten aus einem kinetischen Lesen der 96-Well-Platte in einem Tabellenkalkulationsformat.

In dieser Studie zeigen die in Abbildung 3Aund Tabelle 3 dargestellten optimalen Ergebniss.......

Diskussion

Die Analyse der Phagozytose unter Verwendung von Biopartikeln, die an einen pH-empfindlichen Farbstoff konjugiert sind, ist ein relativ neues Werkzeug, das sich gegenüber herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln als vorteilhaft erwiesen hat^12,19,20. Bei herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln ist nur eine Endpunktanalyse möglich. Der Nachweis erfolgt mit Fluoreszenzmikroskopie und/oder Spektrofluorometrie nach dem Was.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-Mikrotiterplatte aus schwarzem Polystyrol	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
0,4 % Trypanblau-Lösung	MilliporeSigma	T8154-20ML
15 ml und 50 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	ThermoFisher	339653
4-Well-Deckglas mit nicht abnehmbaren Wells	ThermoFisher	155382PK
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)  Gibco	ThermoFisher	15240096
Axiobserver 7 Bildgebungssystem	Zeiss
Rinderserumalbumin (BSA)	MilliporeSigma	A8806-1G
Zelllifter	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
Kulturflaschen, Gewebekultur behandelt, Oberfläche 75  cm2, schräger Hals, mit Kappe, gefiltert	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	Maus MSC Zelllinie
DMEM,	ThermoFisher	11965092
fötales Rinderserum mit hohem Glukosegehalt, qualifiziert, hitzeinaktiviertes	ThermoFisher	16140071
Hämozytometer	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	Maus MΦ Zelllinie
LADMAC Zelllinie	ATCC	CRL-2420	LADMAC-Zellen sezernieren den Wachstumsfaktor Kolonie-stimulierender Faktor 1 (CSF-1).
Lebendzell-Imaging-Lösung	ThermoFisher	A14291DJ
PBS, pH 7,4	ThermoFisher	10010031
pHrodo Green Zymosan Biopartikel Konjugat	ThermoFisher	P35365
Rekombinante Maus IFN-& gamma;	Preprotech	315-05
Spectramax i3X	Molecular Devices
Sterile Einweg-Vakuumfiltereinheiten, 250 mL, 0,2 & Mikro; m	ThermoFisher	568-0020
Sterile Spritzenvorsatzfilter, 0,2 Mikrometer	ThermoFisher	723-2520
Mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen, 100 mm x 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	ThermoFisher	25300054