Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

Makropinozytose bezieht sich auf die Aufnahme großer Mengen extrazellulärer Flüssigkeit in membrangebundene zytoplasmatische Organellen, die Makropinosomen^1,2genannt werden. Es ist ein hochkonserviertes Verfahren, das von freilebenden einzelligen Organismen wie der Amöbe Dictyostelium sppdurchgeführt wird. ³, sowie Anthozoen⁴ und Metazoen². In den meisten Zellen ist die Makropinozytose ein induziertes Ereignis. Die Ligatur von Zelloberflächenrezeptoren induziert das Hervorkommen von Aktin-getriebenen Plasmamembranverlängerungen, die als Rüschen bezeichnet werden. Ein Bruchteil dieser Rüschen versiegelt sich durch einen schlecht verstandenen Mechanismus an ihren distalen Spitzen, um Makropinosomen zu bilden (obwohl sie den Rahmen dieses Methodenpapiers sprengen, verweisen wir auf detaillierte Übersichten über die Mechanik der Makropinozytose, siehe Referenzen^1,2,5,6,7). Der extrazelluläre Reiz, der die Makropinozytose induziert, ist meistens ein löslicher Wachstumsfaktor^5,8. Dementsprechend ermöglicht das makropinozytäre Ereignis die Einnahme eines Bolus aus extrazellulärem Material, aus dem die Zelle nützliche Metaboliten ableiten kann, um das Wachstum zu erleichtern. Leider kann dieser Weg zur Nährstoffzufuhr auch die Pathologie vorantreiben. Bestimmte Krebszellen beherbergen Mutationen, die zu einer kontinuierlichen oder konstitutiven Makropinozytose führen. Die kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen erleichtert die unkontrollierte Vermehrung von Krebszellen und wurde mit besonders aggressiven Tumoren in Verbindung gebracht^{9,10,11,12,13}. In ähnlicher Weise können Viren Makropinozytose induzieren, um Zugang zu Wirtszellen zu erhalten, wodurch die Viruspathologie vorangetrieben wird¹⁴.

Makropinozytose funktioniert auch bei der Aufrechterhaltung der Immunität gegen Krankheitserreger. Bestimmte angeborene Immunzellen wie Makrophagen und dendritische Zellen beteiligen sich an der konstitutiven und aggressiven Probenahme extrazellulärer Flüssigkeit über Makropinozytose^6,15,16. Dieser Modus der Makropinozytose ist unglaublich aktiv, und eine einzelne dendritische Zelle kann sich jede Stunde mit einem Volumen extrazellulärer Flüssigkeit einfüllen, das ihrem eigengewicht entspricht¹⁷. Trotz dieser konstitutiven Probenahme replizieren sich Makrophagen und dendritische Zellen nicht unkontrolliert wie Tumorzellen, sondern scheinen das extrazelluläre Material so zu verarbeiten, dass Informationen extrahiert werden können, um über das Vorhandensein oder Sogar Fehlen potenzieller Bedrohungen zu informieren. Informationen werden extrahiert als i) pathogen-assoziierte molekulare Muster, die von intrazellulären Pathogenerkennungsrezeptoren gelesen werden können, und ii) kurze Abschnitte von Aminosäuren, die auf wichtige Histokompatibilitätsmoleküle geladen werden können, um von Zellen des adaptiven Immunsystems gescreent zu werden^16,18,19. Ob Krankheitserreger diesen Weg zur Informationsverarbeitung durch Immunzellen untergraben, ist derzeit unklar.

Trotz dieser gut definierten und kritischen Rollen für die Makropinozytose sowohl bei der Aufrechterhaltung der Immunität als auch bei der Homöostase und im Gegensatz zu anderen häufiger untersuchten Modi der Endozytose ist wenig über die innere (luminale) Funktionsweise von Makropinosomen bekannt. Die Entwicklung standardisierter Protokolle und Werkzeuge zur Untersuchung der luminalen Biochemie von Makropinosomen wird uns nicht nur helfen, ihre einzigartige Biologie besser zu verstehen, sondern auch Erkenntnisse liefern, die für neuartige therapeutische Strategien, einschließlich der Medikamentenabgabe, genutzt werden können²⁰. Dieses Methodenmanuskript wird sich auf kürzlich entwickelte Werkzeuge konzentrieren, um auf der Ebene der Einzelnen Organellen verschiedene Aspekte der luminalen Biochemie von Makropinosomen zu sezieren.

Fluorophore können zur Messung spezifischer Biochemien von Organellen verwendet werden, wenn sie sich i) bevorzugt in das interessierende Kompartiment aufteilen und/oder ii) als Reaktion auf den interessierenden Parameter spektrale Veränderungen erfahren. Zum Beispiel sammeln sich im Falle des pH-Werts fluoreszierende schwache Basen wie Acridinorange, Cresylviolett und die LysoTracker-Farbstoffe bevorzugt in sauren Organellen an. Daher ist ihre relative Intensität ein grober Hinweis darauf, dass die markierte Organelle sauer ist. Andere pH-responsive Fluorophore wie Fluorescein, pHrodo und cypHer5e unterliegen spektralen Veränderungen bei der Bindung an Protonen (Abbildung 1A-C). Veränderungen der Fluoreszenzemission von pH-sensitiven Fluorophoren können daher eine sinnvolle Annäherung an den pH-Wert liefern. Die Verwendung von einzelnen Fluorophoren birgt jedoch eine Reihe von Nachteilen. Zum Beispiel können Änderungen der Fokusebene, Photobleaching und Änderungen des Volumens einzelner Organellen, ein häufiges Vorkommen in Makropinosomen^21,Änderungen der Fluoreszenzintensität einzelner Fluorophore induzieren, und dies kann nicht leicht für²²korrigiert werden. Einzelwellenlängenbewertungen sind zwar nützlich für die Visualisierung saurer Kompartimente, aber daher rein qualitativ.

Ein quantitativerer Ansatz besteht darin, das parameterempfindliche Fluorophor zusammen mit einem Referenzfluorophor auf die interessierende Organelle auszurichten. Das Referenzfluorophor ist idealerweise unempfindlich gegenüber biochemischen Veränderungen innerhalb der Organelle (Abbildung 1D-F) und kann daher verwendet werden, um Veränderungen der Fokusebene, des Organellarvolumens und bis zu einem gewissen Grad des Photobleachings zu korrigieren²³. Mit diesem Ansatz, der als duale fluorophore ratiometrische Fluoreszenz bezeichnet wird, kann eine Korrektur erreicht werden, indem ein Verhältnis der Fluoreszenzemission des parametersensitiven Fluorophors zum Referenzfluorophor erzeugt wird.

Hier wird das Protokoll das Prinzip der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Bildgebung nutzen, um pH-Wert, oxidative Ereignisse und Proteinabbau in Makropinosomen zu messen. In jedem Fall wird ein Fluorophor ausgewählt, das empfindlich auf den interessierenden Parameter reagiert, und ein Referenzfluorophor. Um die Fluorophore gezielt auf Makropinosomen auszurichten, werden sie kovalent an 70 kDa Dextran gekoppelt, das bevorzugt in Makropinosomen eingebaut wird²⁴. Alle Assays werden in Raw264.7-Zellen durchgeführt, können aber an andere Zelltypen angepasst werden. Wenn möglich, werden die Fluoreszenzverhältnisse gegen eine Referenzkurve kalibriert, um absolute Werte zu erhalten. Wichtig ist, dass alle Messungen in lebenden Zellen zur dynamischen und quantitativen Beurteilung der luminalen Umgebung von Makropinosomen durchgeführt werden.

Bei der Auswahl pH-sensitiver Fluorophore müssen eine Reihe von Überlegungen abgewogen werden. Der erste ist der pK_a des Fluorophors, der den Bereich der pH-Werte angibt, bei dem die Sonde am empfindlichsten ist. Wenn davon ausgegangen wird, dass kurz nach der Bildung der pH-Wert des Makropinosoms nahe an dem des extrazellulären Mediums (~pH 7,2) liegt und dass es durch Wechselwirkungen mit späten Endosomen und Lysosomen (~pH 5,0) progressiv ansäuert, sollte eine Sonde mit einem pK_a gewählt werden, die innerhalb dieses Bereichs empfindlich ist(Abbildung 2C). Das Fluorophor Fluorescein, das einen pK_a von 6,4 aufstellt, ist in diesem Bereich optimal empfindlich. Es wurde ausgiebig verwendet, um andere ähnliche Organellen, wie Phagosomen, zu messen, und wird das Fluorophor der Wahl in diesem Manuskript^22,25sein. Als Referenzfluorophor wird Tetramethylrhodamin verwendet, das unempfindlich gegen pH-Wert ist (Abbildung 1E). Andere Fluorophore wie pHrodo und cypHer5e können Fluorescein ersetzen, wenn die spektralen Eigenschaften von Fluorescein mit anderen experimentellen Variablen übereinstimmen. Einige vorgeschlagene Referenzfluorophore für pHrodo und cypHer5e sind in Abbildung 1 dargestellt.

Eine zweite Überlegung ist die Methode, mit der die beiden Fluorophore spezifisch auf Makropinosomen ausgerichtet werden. Dextran der Größe 70 kDa, das einen hydrodynamischen Radius von etwa 7 nm aufweist, haftet nicht unspezifisch an Zellen und wird in Makropinosomen, aber nicht in Clathrin-beschichtete Gruben oder Caveolae eingebaut und markiert daher Makropinosomen (Abbildung 2A und Abbildung 3A, B)^16,24,26. In diesem Protokoll werden Fluorescein-markierte 70 kDa-Dextran und Tetramethylrhodamin (TMR)-markierte 70 kDa-Dextran als pH-sensitive bzw. Referenzsonden verwendet.

In angeborenen Immunzellen stellen Makropinozytose und Phagozytose die beiden Hauptwege für die Internalisierung von exogenem Material zur Verarbeitung und anschließenden Präsentation der adaptiven Immunantwort an Zellen dar²⁷. Die sorgfältige und koordinierte Kontrolle der Redoxchemie des Lumens von Phagosomen und Makropinosomen ist entscheidend für die kontextspezifische Verarbeitung von exogenem Material. Der vielleicht am besten untersuchte Regulator oxidativer Ereignisse in Phagosomen ist die NADPH-Oxidase, ein großer Multi-Subunit-Komplex, der große Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im Lumen von Phagosomen produziert²⁸. In der Tat ist seine Aktivität von zentraler Bedeutung für eine angemessene Antigenverarbeitung innerhalb von Phagosomen^29,30. Die Aktivität der NADPH-Oxidase auf makropinosomalen Membranen wurde jedoch nicht untersucht.

In diesem Protokoll wird der H2DCFDA-Succinimidylester zur Messung oxidativer Ereignisse innerhalb des Makropinosoms verwendet. Dies ist eine modifizierte Form von Fluorescein (2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat), das in seiner reduzierten Form minimal fluoreszierend ist. Bei der Oxidation nimmt seine Fluoreszenzemission deutlich zu. Es ist jedoch erwähnenswert, dass H2DCFDA einen signifikanten Vorbehalt hat - da es auf dem Fluorophor Fluorescein basiert, wird seine Fluoreszenz auch in sauren Kompartimenten abgeschreckt, und bei der Gestaltung von Experimenten muss darauf geachtet werden, diese Variable zu kontrollieren²⁸. Ähnlich wie bei der Messung des pH-Werts wird der H2DCFDA-Succinimidylester kovalent an 70 kDa Dextran gebunden und TMR-markiertes 70 kDa Dextran wird als Referenzfluorophor verwendet (Abbildung 3A).

Fluoreszierendes Ovalbumin wird verwendet, um den Proteinabbau in Makropinosomen zu messen. Das hier verwendete Ovalbumin ist dicht mit einem 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL-Farbstoff markiert, der selbst abgeschreckt wird. Bei der Verdauung werden stark fluoreszierende farbstoffmarkierte Peptide freigesetzt. Da Ovalbumin nicht einfach zu 70 kDa Dextran konjugiert werden kann, werden Zellen mit TMR-markiertem 70 kDa Dextran und Fluidphasen-Ovalbumin koinkubiert. Das TMR-Signal wird verwendet, um während der Analyse nach der Bildgebung eine Makropinosom-Maske zu erzeugen, und das vom verdauten Ovalbumin freigesetzte Signal wird innerhalb der Maske gemessen (Abbildung 3B).

1. Vorbereitung der Zellen

1. Züchten Sie Raw264,7-Zellen bei 37 °C und 5% CO₂ bis 70% Konfluenz in RPMI, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem Serum.
2. Einen Tag vor dem Assay werden Raw264,7-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte ausgesät. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung 100 μL Wachstumsmedium enthält. Stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte schwarze Seiten und einen Glasboden für die Bildgebung hat.
   HINWEIS: Hier wurden 96-Well-Platten für die Bildgebung verwendet. Die 96-Well-Platten ermöglichen die Verwendung kleinerer Mengen von Zellen und Reagenzien im Vergleich zu größeren Bildgebungskammern. Es kann jedoch jede Kammer verwendet werden, die für die Bildgebung lebender Zellen entwickelt wurde, und Reagenzien können entsprechend skaliert werden.
3. Überprüfen Sie am Tag des Assays, ob die Bohrungen zu mindestens 70% konfluent sind.

2. Messung des Makropinosom-pH-Werts

1. Bereiten Sie die Zellen wie in Abschnitt 1 vor.
2. Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μL HBSS bei 37 °C.
3. Füllen Sie jede Vertiefung mit 100 μL HBSS, die 0,025 mg/ml TMR-markiertes 70 kDa Dextran und 0,025 mg/ml Fluorescein-markiertes 70 kDa Dextran enthalten.
4. Legen Sie die Zellen für 15 min in einen Aufsatz auf 37 °C eingestellten Inkubator.
5. Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie die Zellen 6x mit 100 μL HBSS.
6. Füllen Sie jede Vertiefung mit 100 μL HBSS bei 37 °C.
7. Legen Sie die Platte mit einem beheizten Tisch und einer Kammer auf das Mikroskop.
8. Passen Sie die Anregungs-/Emissionsparameter für jedes Fluorophor nach Bedarf an.
   HINWEIS: Die idealen Bedingungen für die Bildaufnahme variieren je nach verwendeten Fluorophoren und individuellen Mikroskopaufsetzungen. Hier wurden Bilder mit einem leica SP5 Laserscanning konfokalen Mikroskop aufgenommen. TMR wurde mit einer 543-Laserlinie angeregt und die Emission wurde von 610 nm bis 650 nm gesammelt. Fluorescein wurde mit einer 488-Laserlinie angeregt und die Emission von 500 nm bis 550 nm gesammelt. Es wurde ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv verwendet und ein 10 μm Z-Volumen in 0,5 μm Intervallen erfasst.
9. Erfassen Sie ein Bild von jeder Vertiefung, abwechselnd zwischen Fluorophoren zwischen jeder Vertiefung.
10. Überprüfen Sie nach der ersten Akquisition, ob alle Bohrbrunnen über die gesamte Platte im Fokus blieben.
11. Erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von 1-15 Minuten für die gewünschte Zeitspanndauer.

3. In-situ-Kalibrierung des Makropinosom-pH-Werts

1. Bereiten Sie während der Bildaufnahme 1 L kaliumreiche (K⁺-reiche) Lösung mit 140 mM KCl, 1 mM_MgCl2,1 mM_CaCl2und 5 mM Glukose vor. Ergänzen Sie ein 400 ml Volumen der K^+-reichenLösung mit 25 mM HEPES (aus einer 1 M, pH 7,2 Stammlösung) und einem separaten 400 ml Volumen mit 25 mM MES (aus einer 0,5 M, pH 6,0 Stammlösung).
2. Stellen Sie ein 50 mL Aliquot der K⁺-reichen Lösung, gepuffert mit 25mM HEPES, auf pH 7,5 mit 10 M HCl oder 10 M KOH nach Bedarf ein.
3. Stellen Sie drei separate 50-ml-Aliquoten der K⁺-reichen Lösung, die mit 25 mM MES gepuffert sind, nach Bedarf auf pH 6,5, pH 5,5 und pH 5,0 mit 10 M HCl oder 10 M KOH ein.
   HINWEIS: Ein Acetat-Essigsäure-Puffer kann für Lösungen mit niedrigerem pH-Wert vorzuziehen sein.
4. Entfernen Sie nach Abschluss der Bildaufnahme das HBSS von der 96-Well-Platte, die die Zellen enthält, und ersetzen Sie es durch die K⁺-reiche Lösung, die bei pH 7,5 liegt.
5. Nigericin zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzufügen.
   HINWEIS: Nigericin ist ein Ionophor, das K^{+ gegen} H^{+ austauscht.} Durch die Einstellung der K⁺ -Konzentration der K⁺-reichen Lösung auf einen Wert, der sich der K⁺ -Konzentration des Zytosols annähert, kann sichergestellt werden, dass Nigericin den pH-Wert des Makropinosoms an den des Zytosols klemmt, was wiederum den pH-Wert des Kalibrierpuffers widerspiegelt.
6. Legen Sie die Platte wieder auf das Mikroskop und erfassen Sie Bilder von jedem Bohrplatz mit den gleichen Aufnahmeeinstellungen wie oben.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für jeden Kalibrierungspuffer.

4. Datenanalyse für Makropinosom pH

1. Subtrahieren Sie mit der FIJI-Software den Hintergrund sowohl vom TMR- als auch vom Fluoresceinkanal.
2. Generieren Sie eine Maske auf dem TMR-Kanal. Um eine Maske zu generieren, konvertieren Sie das Bild in ein Binärbild, indem Sie > Schwellenwert anpassen > Anwenden auswählen. Markieren Sie als Nächstes das Binärbild und wählen Sie > Auswahl bearbeiten > Maske erstellen.
3. Wenden Sie es sowohl auf die TMR- als auch auf die Fluorescein-Bilder an. Markieren Sie dazu die Maske und wählen Sie > Auswahl bearbeiten > Auswahl erstellen. Klicken Sie auf das TMR-Bild und drücken Sie Umschalt + E, um die Maske auf den TMR-Kanal anzuwenden. Klicken Sie ebenfalls auf das Fluoreszeinbild und drücken Sie Umschalt + E, um die Maske auf den OB-Kanal anzuwenden.
4. Zeichnen Sie die TMR- und Fluoresceinintensität für jedes Makropinosom in den Masken auf.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 für jeden Zeitpunkt des Zeitverlaufs.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 für die bei der In-situ-Kalibrierung aufgenommenen Bilder.
7. Teilen Sie die Fluoreszeinintensität durch die TMR-Intensität, um das Fluoreszein:TMR-Verhältnis zu erzeugen.
8. Zeichnen Sie den pH-Wert gegen die Fluorescein:TMR-Verhältnisse für die Kalibrierbilder auf.
9. Passen Sie eine Kurve an die Kalibrierdaten an.
10. Interpolieren Sie die Daten für jeden Zeitpunkt aus dem Zeitverlauf, um absolute pH-Werte zu erhalten.

5. Messung oxidativer Ereignisse in Makropinosomen

1. Bereiten Sie die Zellen wie in Abschnitt 1 vor.
2. Einen Tag vor dem Assay wird der H2DCFDA-Succinimidylester mit der Markierung 70 kDa Dextran durch Resusinus von 10 mg 70 kDa Dextran-Amino in 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonatlösung (pH 8,3) vorbereitet. 1 mg des H2DCFDA-Succinimidylesters in die Dextran-Amino-Lösung geben und 1 h lang inkubieren. Dialysieren Sie das H2DCFDA-markierte 70 kDa Dextran gegen PBS. Nicht mehr als 1 Tag lagern, da H2DCFDA-markiertes 70 kDa Dextran bei der Lagerung oxidiert.
3. Am Tag des Assays waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μL HBSS bei 37 °C.
4. Füllen Sie jede Vertiefung mit 100 μL HBSS, die 0,025 mg/ml TMR-markiertes 70 kDa Dextran und 0,025 mg/ml H2DCFDA-markiertes 70 kDa Dextran enthalten.
5. Legen Sie die Zellen für 15 min in einen Auf 37 °C eingestellten Inkubator.
6. Zellen aus dem Inkubator entnehmen und die Zellen 6x mit 100 μL HBSS waschen.
7. Füllen Sie jede Vertiefung mit 100 μL HBSS bei 37 °C.
8. Legen Sie die Platte mit einem beheizten Tisch und einer beheizten Kammer auf das Mikroskop und passen Sie die Anregungs- / Emissionsparameter für jedes Fluorophor nach Bedarf an.
   HINWEIS: Die idealen Bedingungen für die Bildaufnahme variieren je nach verwendeten Fluorophoren und individuellen Mikroskopaufsetzungen. Hier wurden Bilder mit einem Leica SP5 Laserscanning Konfokalmikroskop aufgenommen. TMR wurde mit einer 543-Laserlinie angeregt und die Emission wurde von 610 nm bis 650 nm gesammelt. H2DCFDA wurde mit einer 488-Laserlinie angeregt und die Emission wurde von 500 nm bis 550 nm gesammelt. Es wurde ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv verwendet, und ein 10 μm Z-Volumen wurde in Intervallen von 0,5 μm erfasst.
9. Erfassen Sie ein Bild von jeder Vertiefung, abwechselnd zwischen Fluorophoren zwischen jeder Vertiefung.
10. Überprüfen Sie nach der ersten Akquisition, ob alle Bohrbrunnen über die gesamte Platte im Fokus bleiben.
11. Erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von 1-15 Minuten für die gewünschte Zeitspanndauer.

6. Datenanalyse für oxidative Ereignisse in Makropinosomen

1. Subtrahieren Sie mit der FIJI-Software den Hintergrund sowohl vom TMR- als auch vom H2DCFDA-Kanal.
2. Generieren Sie eine Maske auf dem TMR-Kanal. Um eine Maske zu generieren, konvertieren Sie das Bild in ein Binärbild, indem Sie > Schwellenwert anpassen > Anwenden auswählen. Markieren Sie als Nächstes das Binärbild und wählen Sie > Auswahl bearbeiten > Maske erstellen.
3. Wenden Sie die Maske sowohl auf das TMR- als auch auf das H2DCFDA-Bild an. Markieren Sie dazu die Maske und wählen Sie > Auswahl bearbeiten > Auswahl erstellen. Klicken Sie auf das TMR-Bild und drücken Sie Umschalt + E, um die Maske auf den TMR-Kanal anzuwenden. Klicken Sie ebenfalls auf das H2DCFDA-Bild und drücken Sie Umschalt + E, um die Maske auf den H2DCFDA-Kanal anzuwenden.
4. Zeichnen Sie die TMR- und H2DCFDA-Intensität für jedes Makropinosom in den Masken auf.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 für jeden Zeitpunkt des Zeitverlaufs.
6. Teilen Sie die H2DCFDA-Intensität durch die TMR-Intensität, um ein H2DCFDA:TMR-Verhältnis zu erzeugen.
7. Zeichnen Sie das H2DCFDA: TMR-Verhältnis gegen die Zeit auf.

7. Messung der Proteinaufschluss in Makropinosomen

1. Bereiten Sie die Zellen wie in Abschnitt 1 vor.
2. Am Tag des Assays alle Vertiefungen mit 100 μL HBSS bei 37 °C waschen.
3. BODIPY-markiertes Ovalbumin in einer Konzentration von 4 mg/ml in HBSS auflösen.
4. Füllen Sie jede Vertiefung mit 100 μL HBSS, die 0,025 mg/ml TMR-markiertes 70 kDa Dextran und 0,2 mg/ml BODIPY-markiertes Ovalbumin enthalten.
5. Legen Sie die Zellen für 15 min in einen Aufsatz auf 37 °C eingestellten Inkubator.
6. Zellen aus dem Inkubator entnehmen und die Zellen 6x mit 100 μL HBSS waschen.
7. Füllen Sie jede Vertiefung mit 100 μL HBSS bei 37 °C.
8. Legen Sie die Platte mit einem beheizten Tisch und einer beheizten Kammer auf das Mikroskop und passen Sie die Anregungs- / Emissionsparameter für jedes Fluorophor nach Bedarf an.
   HINWEIS: Die idealen Bedingungen für die Bildaufnahme variieren je nach verwendeten Fluorophoren und individuellen Mikroskopaufsetzungen. Hier wurden Bilder mit einem leica SP5 Laserscanning konfokalen Mikroskop aufgenommen. TMR wurde mit einer 543-Laserlinie angeregt und die Emission wurde von 610 nm bis 650 nm gesammelt. BODIPY wurde mit einer 488-Laserlinie angeregt und die Emission wurde von 500 nm bis 550 nm gesammelt. Es wurde ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv verwendet und ein 10 μm Z-Volumen in 0,5 μm Intervallen erfasst.
9. Erfassen Sie ein Bild von jeder Vertiefung, abwechselnd zwischen Fluorophoren zwischen jeder Vertiefung.
10. Überprüfen Sie nach der ersten Akquisition, ob alle Bohrbrunnen über die gesamte Platte im Fokus bleiben.
11. Erfassen Sie Bilder von jeder Bohrung in Abständen von 1-15 Minuten für die gewünschte Zeitspanndauer.

8. Datenanalyse zur Proteinverdauung in Makropinosomen

1. Subtrahieren Sie mit der FIJI-Software den Hintergrund sowohl vom TMR- als auch vom BODIPY-Kanal.
2. Generieren Sie eine Maske auf dem TMR-Kanal und wenden Sie sie wie in den Schritten 6.2 und 6.3 oben auf die TMR- und BODIPY-Bilder an (Abbildung 3B).
3. Zeichnen Sie die TMR- und BODIPY-Intensität für jedes Makropinosom innerhalb der Masken auf.
4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3 für jeden Zeitpunkt des Zeitverlaufs.
5. Teilen Sie die BODIPY-Intensität durch die TMR-Intensität, um das BODIPY:TMR-Verhältnis zu erzeugen.
6. Zeichnen Sie das BodiPY:TMR-Verhältnis gegen die Zeit auf.

Bei der Messung des pH-Werts von Makropinosomen gibt es einen Zeitraum, für den die Dynamik der Versauerung nicht gemessen werden kann. Dieser Zeitraum entspricht der Dextran-Ladephase (graues Feld in Abbildung 2C und Abbildung 3C,D)und variiert je nach verwendetem Zelltyp. Die Länge der Ladephase variiert mit (i) der makropinozyten Aktivität der Zellen und (ii) der Empfindlichkeit des verwendeten Instruments. Es wird empfohlen, diesen Zeitraum zu Beginn jedes Experiments so einzustellen, dass sowohl für den Fluorescein- als auch für den TMR-Kanal ein Signal:Rausch-Verhältnis von mehr als 4:1 erreicht wird. In unbehandelten Zellen sollte die Fluoreszeinemission mit der Ansäuerung der Makropinosomen zunehmend schwächer werden, und das TMR-Signal sollte entweder konstant bleiben oder heller werden. Das TMR-Signal kann heller werden, wenn die Makropinosomen in Größe16,21schrumpfen. Dies hat keinen Einfluss auf das Verhältnis, da das Fluoreszeinsignal den gleichen Variationen in der organellaren Größe22unterliegt. Das Fluoreszein:TMR-Verhältnis wird zunehmend kleiner und wird innerhalb der ersten 15 Minuten nach der Erfassung ein Plateau erreichen (Abbildung 2C). Dieses Plateau entspricht einem pH-Wert von ~5, der in etwa dem pH-Wert der Lysosomen25entspricht. Am Ende jeder Erfassung wird eine In-situ-Kalibrierung durchgeführt. Das Fluorescein:TMR-Verhältnis sollte mit dem Kalibrierpuffer bei pH 7,5 am größten sein und mit zunehmender Säure der Kalibrierpuffer zunehmend kleiner werden. Dies ermöglicht die Erstellung einer Kalibrierkurve (Abbildung 2B). Die Fluorescein:TMR-Verhältnisse können dann für den makropinosomalen pH-Wert interpoliert werden (Abbildung 2C).

Oxidative Ereignisse in Makropinosomen variieren wahrscheinlich auch mit dem verwendeten Zelltyp. Es wird empfohlen, die Zellen mit H2DCFDA-Dextran zu beladen und die NADPH-Oxidase mit Phorbol 12-Myristat-13-Acetat (PMA) als Positivkontrolle zu stimulieren (Abbildung 3C). Dies gibt eine bessere Vorstellung vom Dynamikumfang des Assays und ermöglicht die Anpassung der Mikroskopeinstellungen. Da oxidative Ereignisse innerhalb der Makropinosomen auftreten, wird das H2DCFDA-Signal zunehmend heller. Das TMR-Signal kann konstant bleiben oder mit der Größe des Makropinosoms variieren, wie oben beschrieben. Das Verhältnis von H2DCFDA:TMR wird zunehmend größer und wird wahrscheinlich innerhalb der ersten 20-30 Minuten in inaktivierten Raw264.7-Zellen ein Plateau erreichen (Abbildung 3A,C).

Bei der Messung der makropinosomalen Proteinverdauung wird ein progressiv starkes fluoreszierendes Signal freigesetzt, wenn das Ovalbumin verdaut wird. In Raw264.7-Zellen wird der Anstieg der Fluoreszenz, die aus dem verdauten BODIPY-markierten Ovalbumin freigesetzt wird, innerhalb der ersten 30 Minuten ein Plateau erreichen (Abbildung 3B, D). Wie zuvor kann das TMR-Signal konstant bleiben oder mit der Größe des Makropinosoms variieren. Da der Abbau von Ovalbumin unmittelbar nach dem Makropinosomverschluss beginnt, kann eine Negativkontrolle nützlich sein, um den dynamiken Bereich des Assays zu bestimmen. Zu diesem Zweck können saure Hydrolasen innerhalb des Makropinosoms mit einem Inhibitor der V-ATPase, wie Concanamycin A (CcA) (Abbildung 3D) oder Bafilomycin A gehemmt werden.

Abbildung 1: Prinzipien der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Bildgebung. (A-C). Spektrale Scans (Anregungsfixiert, emissionsmensiert) von pH-sensitiven Fluorophoren, die in Puffern des angegebenen pH-Werts suspendiert sind. Fluorescein, pHrodo und cypHer5e werden häufig als Sensoren des pH-Werts in zellulären Assays verwendet. (D-F). Spektrale Scans (Anregungsfixiert, emissionsmensiert) von pH-unempfindlichen Fluorophoren, die in Puffern des angegebenen pH-Werts suspendiert sind. Farbstoffe, die nicht mit dem pH-Wert variieren, sind nützliche Referenzfluorophore. Fluoreszeine sind bei den saureren pH-Werten, die in Endosomen auftreten, nicht optimal empfindlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Dynamische Messungen des makropinosomalen pH-Werts. (A) Raw264.7-Zellen wurden mit Fluorescein-markierten 70 kDa-Dextran und TMR-markierten 70 kDa-Dextran bei 37 °C in Gegenwart oder Abwesenheit von 500 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) für 15 min beladen. Sie wurden auch mit Fluorescein-markierten 70 kDa-Dextran und TMR-markierten 70 kDa-Dextran bei 4 °C als Kontrolle für die unspezifische Bindung von Dextran inkubiert. Insets zeigen einzelne Zellen (Skalenbalken = 20 μm). (B) In-situ-Kalibrierung von Raw264.7-Zellen, die mit Fluorescein-markierten 70 kDa-Dextran und TMR-markierten 70 kDa-Dextran beladen sind, unter Verwendung von K+-reichenPuffern bei dem angegebenen pH-Wert und Nigericin. (C) Macropinosom pH-Wert in Raw264,7 Zellen. Einsätze stellen das Fluorescein:TMR-Verhältnis in einzelnen Makropinosomen dar. Graue Felder zeigen die Zeiten an, zu denen Zellen mit Dextran geladen wurden. Daten aus zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils ≥ 80 Zellen. Daten, die als Mittelwert dargestellt werden ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Dynamische Messungen oxidativer Ereignisse und Proteinverdauung im Lumen von Makropinosomen. (A) Raw264.7-Zellen wurden 15 min lang mit H2DCFDA-markierten 70 kDa-Dextran und TMR-markierten 70 kDa-Dextran bei 37 °C beladen, gefolgt von einer 45-minütigen Verfolgungsjagd bei 37 °C. Insets zeigen verhältnissente Bilder (H2DCFDA/TMR) einzelner Makropinosomen. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Raw264.7-Zellen wurden 15 minuten lang mit BODIPY-markiertem Ovalbumin und TMR-markiertem 70 kDa-Dextran bei 37 °C beladen, gefolgt von einer 45-minütigen Verfolgungsjagd bei 37 °C. Der TMR-Kanal wurde verwendet, um eine Maske zu erzeugen, die auf den BODIPY-Kanal aufgebracht wurde. Insets zeigen einzelne Zellen. Maßstabsbalken = 20 μm. (C) H2DCFDA-Oxidation im Lumen von Makropinosomen. Die Zellen wurden auch mit PMA als Positivkontrolle stimuliert. Graue Felder zeigen die Zeiten an, zu denen Zellen mit Dextran geladen wurden. Daten aus zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils ≥ 80 Zellen enthielten. Daten, die als Mittelwert ± SEM dargestellt werden. Jeder Zeitpunkt wurde mit der PMA-Steuerung verglichen. Für die statistische Analyse wurde der t-Testeines Schülers verwendet. (D) BODIPY-markierter Ovalbuminabbau in Makropinosomen. Concanamycin A (CcA) wurde als Negativkontrolle verwendet, da es die Aktivierung von Luminalsäurehydrolasen verhindert. Daten aus zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils ≥ 80 Zellen enthielten. Daten, die als Mittelwert ± SEM dargestellt werden. Jeder Zeitpunkt wurde mit der CcA-Kontrolle verglichen. Für die statistische Analyse wurde der t-Testeines Schülers verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.