Method Article

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

DOI:

10.3791/62735

⸱

July 5th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Abstract

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Der Sinusknoten (SAN), der sich im rechten Vorhof befindet, enthält die Herzschrittmacherzellen des Herzens, und eine Dysfunktion dieser Region kann Tachykardie oder Bradykardie verursachen. Die zuverlässige Identifizierung von Herzschrittmacherfehlern erfordert die Messung der intrinsischen Herzfrequenz, indem der Einfluss des autonomen Nervensystems, der Ratendefizite maskieren kann, weitgehend verhindert wird. Traditionelle Methoden zur Analyse der intrinsischen Herzschrittmacherfunktion umfassen eine medikamenteninduzierte autonome Blockade zur Messung der In-vivo-Herzfrequenz, isolierte Herzaufzeichnungen zur Messung der intrinsischen Herzfrequenz und sinoatriale Streifen- oder Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von sinoatrialen Schrittmacherzellen zur Messung spontaner Aktionspotenzial-Feuerraten. Diese traditionelleren Techniken können jedoch technisch anspruchsvoll und schwierig durchzuführen sein. Hier stellen wir eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate vor, indem wir Mikroelektrodenarray-Aufnahmen (MEA) von Sinusknotenpräparaten von Mäusen durchführen. MEAs bestehen aus mehreren Mikroelektroden, die in einem gitterartigen Muster angeordnet sind, um extrazelluläre In-vitro-Feldpotentiale aufzuzeichnen. Die hier beschriebene Methode hat den kombinierten Vorteil, dass sie relativ schneller, einfacher und präziser ist als frühere Ansätze zur Aufzeichnung intrinsischer Herzfrequenzen und gleichzeitig eine einfache pharmakologische Abfrage ermöglicht.

Introduction

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Das Herz ist ein komplexes Organ, das sowohl von kardiale-intrinsischen als auch von extrinsischen Einflüssen gesteuert wird, wie sie im Gehirn entstehen. Der Sinusknoten (SAN) ist eine definierte Region im Herzen, die die Schrittmacherzellen (auch als Sinuszellen oder SA-Zellen bezeichnet) beherbergt, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung des Herzschlags von Säugetieren verantwortlich sind1,2. Die intrinsische Herzfrequenz ist die Rate, die von den Herzschrittmacherzellen ohne Einfluss anderer kardialer oder neurohumoraler Einflüsse angetrieben wird, aber traditionelle Messungen der Herzfrequenz bei M....

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Protocol

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Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Southern Methodist University genehmigt wurden.

1. Beschichtung des Multielektroden-Arrays (MEA) für die Aufnahme

  1. Machen Sie 25 mM Boratpuffer.
    1. 0,953 gNa2B4O7·10H2O in 80 ml destilliertem Wasser auflösen.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,4 ein und fügen Sie dann destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml hinzu.
  2. Stellen Sie....

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Results

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Nachdem sich das Gewebe 15 Minuten lang in der Schüssel akklimatisieren kann, werden 10 einminige Spuren aufgezeichnet. Unser aktuelles Protokoll zeichnet die Aktivität für über eine Stunde auf, aber wir haben stabile Feuermuster für ≥4 h in unveröffentlichten Daten aufgezeichnet, die hier nicht gezeigt werden. Wenn eine experimentelle Vorbereitung für die Datenerfassung gut ist, sollte jeder Aufzeichnungskanal konsistente und gleichmäßig verteilte wiederkehrende Wellenformen (d. H. Spikes) einheitlicher Form für einen b.......

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Discussion

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Das Üben und Beherrschen des SAN-Dissektionsprozesses ist unerlässlich, da das Gewebe zerbrechlich ist und gesundes Gewebe für eine erfolgreiche Aufnahme notwendig ist. Während der SAN-Dissektion ist eine korrekte Orientierung unerlässlich, um die richtige Geweberegion zu erhalten. Die ursprüngliche Ausrichtung des Herzens kann jedoch während des Dissektionsprozesses leicht verloren gehen, was dieses Unterfangen erschwert. Um die richtige Links-Rechts-Ausrichtung zu gewährleisten, sollten die Vorhöfe daher visuell inspiz.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01NS100954 und R01NS099188 finanziert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopyridinSigmaA78403-25G
22-Gauge-SpritzennadelFisher Scientific14-826-5AWird für die Dissektion
verwendet 23-Gauge-SpritzennadelFisher Scientific14-826-6CWird für die Dissektion
von 60-mm-Petrischalenverwendet Genesee Scientific32-105G
500 ml Pyrex-FlascheFisher Scientific06-414-1CZur Aufbewahrung von Lösungen
1000 mL Pyrex BottleFisher Scientific06-414-1DZur Aufbewahrung von Lösungen
KnochenzangeFine Science Tools16060-11
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Schere, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG7021-1KG
Datenerfassungs-PCCPU: Intel Xeon oder Intel Core i7, Arbeitsspeicher: 8GB, HDD: 1TB, Grafikkarte: NVIDIA oder On-Board, Bildschirm: 1920x1080
PräpariermikroskopJenco
PräparierstifteFine Science Tools26002-20
Dumont #2 Laminektomie-ZangeFine Science Tools11223-20
Dumont #55 PinzetteFine Science Tools11295-51
  Extra feine Graefe PinzetteFine Science Tools11152-10
GlaskammerGrainger49WF30Wird für die Einschläferung von Mäusen
verwendet Harfenanker-KitWarner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4Verwendet für den pH-Ausgleich
Hämostat Fine Science Tools13013-14
HeparinAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Inverses MikroskopMoticAE2000
IsofluranPatterson Veterinärmedizin07-893-1389
LaborbandFisher Scientific15-950
Licht für DissektionsmikroskopDolan-JennerMI150DG 660000391014
Magesiumchlorid (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 KopfverstärkerMED64MED-A64HE1S
MED64 HauptverstärkerMED64MED-A64MD1A
MED64 PerfusionskappeMED64MED-KCAP01
MED64 Perfusionsrohrhalter-KitMED64MED-KPK02
MED64 ThermoConnectorMED64MED-CP04
Mesh  Warner Instruments640246
Mikroelektrodenarray (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Spezifische Software für das MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500Verwendet für den pH-Ausgleich
Normale KochsalzlösungUltigieneNDC 50989-885-17
PinselFisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
SchlauchpumpeGilsonF155009
Schlauch für peristaltische PumpeFisher Scientific14-171-2981/8'' Innendurchmesser
PolyethyleniminSigmaP3143
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Natrium BicarbonatSigmaS6297
Natriumchlorid (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sylgruard Elastomer KitDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5KG
Natriumphosphat MonobasicSigmaS6566
NatriumtetraboratSigmaS9640
Chirurgische SchereFeinwissenschaftliche Werkzeuge14074-09
Transferpipetten (3 mL graduiert)Samco Scientific225

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....

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Microelectrode Array RecordingSinoatrial NodeCardiac PacemakingIntrinsic Heart RateMouse Heart PreparationPacemaker CellsExtracellular Field PotentialsPharmacological InterrogationBeat Frequency AnalysisElectrophysiology Techniques

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