Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.
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Methodenartikel
Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Sinusknoten (SAN), der sich im rechten Vorhof befindet, enthält die Herzschrittmacherzellen des Herzens, und eine Dysfunktion dieser Region kann Tachykardie oder Bradykardie verursachen. Die zuverlässige Identifizierung von Herzschrittmacherfehlern erfordert die Messung der intrinsischen Herzfrequenz, indem der Einfluss des autonomen Nervensystems, der Ratendefizite maskieren kann, weitgehend verhindert wird. Traditionelle Methoden zur Analyse der intrinsischen Herzschrittmacherfunktion umfassen eine medikamenteninduzierte autonome Blockade zur Messung der In-vivo-Herzfrequenz, isolierte Herzaufzeichnungen zur Messung der intrinsischen Herzfrequenz und sinoatriale Streifen- oder Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von sinoatrialen Schrittmacherzellen zur Messung spontaner Aktionspotenzial-Feuerraten. Diese traditionelleren Techniken können jedoch technisch anspruchsvoll und schwierig durchzuführen sein. Hier stellen wir eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate vor, indem wir Mikroelektrodenarray-Aufnahmen (MEA) von Sinusknotenpräparaten von Mäusen durchführen. MEAs bestehen aus mehreren Mikroelektroden, die in einem gitterartigen Muster angeordnet sind, um extrazelluläre In-vitro-Feldpotentiale aufzuzeichnen. Die hier beschriebene Methode hat den kombinierten Vorteil, dass sie relativ schneller, einfacher und präziser ist als frühere Ansätze zur Aufzeichnung intrinsischer Herzfrequenzen und gleichzeitig eine einfache pharmakologische Abfrage ermöglicht.
Einleitung
Das Herz ist ein komplexes Organ, das sowohl von kardiale-intrinsischen als auch von extrinsischen Einflüssen gesteuert wird, wie sie im Gehirn entstehen. Der Sinusknoten (SAN) ist eine definierte Region im Herzen, die die Schrittmacherzellen (auch als Sinuszellen oder SA-Zellen bezeichnet) beherbergt, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung des Herzschlags von Säugetieren verantwortlich sind1,2. Die intrinsische Herzfrequenz ist die Rate, die von den Herzschrittmacherzellen ohne Einfluss anderer kardialer oder neurohumoraler Einflüsse angetrieben wird, aber traditionelle Messungen der Herzfrequenz bei M....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Southern Methodist University genehmigt wurden.
1. Beschichtung des Multielektroden-Arrays (MEA) für die Aufnahme
- Machen Sie 25 mM Boratpuffer.
- 0,953 gNa2B4O7·10H2O in 80 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,4 ein und fügen Sie dann destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml hinzu.
- Stellen Sie....
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Ergebnisse
Nachdem sich das Gewebe 15 Minuten lang in der Schüssel akklimatisieren kann, werden 10 einminige Spuren aufgezeichnet. Unser aktuelles Protokoll zeichnet die Aktivität für über eine Stunde auf, aber wir haben stabile Feuermuster für ≥4 h in unveröffentlichten Daten aufgezeichnet, die hier nicht gezeigt werden. Wenn eine experimentelle Vorbereitung für die Datenerfassung gut ist, sollte jeder Aufzeichnungskanal konsistente und gleichmäßig verteilte wiederkehrende Wellenformen (d. H. Spikes) einheitlicher Form für einen b.......
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Diskussion
Das Üben und Beherrschen des SAN-Dissektionsprozesses ist unerlässlich, da das Gewebe zerbrechlich ist und gesundes Gewebe für eine erfolgreiche Aufnahme notwendig ist. Während der SAN-Dissektion ist eine korrekte Orientierung unerlässlich, um die richtige Geweberegion zu erhalten. Die ursprüngliche Ausrichtung des Herzens kann jedoch während des Dissektionsprozesses leicht verloren gehen, was dieses Unterfangen erschwert. Um die richtige Links-Rechts-Ausrichtung zu gewährleisten, sollten die Vorhöfe daher visuell inspiz.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01NS100954 und R01NS099188 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridin | Sigma | A78403-25G | |
| 22-Gauge-Spritzennadel | Fisher Scientific | 14-826-5A | Wird für die Dissektion |
| verwendet 23-Gauge-Spritzennadel | Fisher Scientific | 14-826-6C | Wird für die Dissektion |
| von 60-mm-Petrischalen | verwendet Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500 ml Pyrex-Flasche | Fisher Scientific | 06-414-1C | Zur Aufbewahrung von Lösungen |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Zur Aufbewahrung von Lösungen |
| Knochenzange | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Schere, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Datenerfassungs-PC | CPU: Intel Xeon oder Intel Core i7, Arbeitsspeicher: 8GB, HDD: 1TB, Grafikkarte: NVIDIA oder On-Board, Bildschirm: 1920x1080 | ||
| Präpariermikroskop | Jenco | ||
| Präparierstifte | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminektomie-Zange | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Pinzette | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra feine Graefe Pinzette | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glaskammer | Grainger | 49WF30 | Wird für die Einschläferung von Mäusen |
| verwendet Harfenanker-Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Verwendet für den pH-Ausgleich |
| Hämostat Fine Science Tools | 13013-14 | ||
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverses Mikroskop | Motic | AE2000 | |
| Isofluran | Patterson Veterinärmedizin | 07-893-1389 | |
| Laborband | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Licht für Dissektionsmikroskop | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesiumchlorid (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Kopfverstärker | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Hauptverstärker | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusionskappe | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusionsrohrhalter-Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Mikroelektrodenarray (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Spezifische Software für das MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Verwendet für den pH-Ausgleich |
| Normale Kochsalzlösung | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Pinsel | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Schlauchpumpe | Gilson | F155009 | |
| Schlauch für peristaltische Pumpe | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Innendurchmesser |
| Polyethylenimin | Sigma | P3143 | |
| Kaliumchlorid (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Natrium Bicarbonat | Sigma | S6297 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5KG | |
| Natriumphosphat Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Natriumtetraborat | Sigma | S9640 | |
| Chirurgische Schere | Feinwissenschaftliche Werkzeuge | 14074-09 | |
| Transferpipetten (3 mL graduiert) | Samco Scientific | 225 |
Referenzen
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....
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Nachdrucke und Genehmigungen
