Methodenartikel

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

DOI:

10.3791/62735

⸱

5. Juli 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Sinusknoten (SAN), der sich im rechten Vorhof befindet, enthält die Herzschrittmacherzellen des Herzens, und eine Dysfunktion dieser Region kann Tachykardie oder Bradykardie verursachen. Die zuverlässige Identifizierung von Herzschrittmacherfehlern erfordert die Messung der intrinsischen Herzfrequenz, indem der Einfluss des autonomen Nervensystems, der Ratendefizite maskieren kann, weitgehend verhindert wird. Traditionelle Methoden zur Analyse der intrinsischen Herzschrittmacherfunktion umfassen eine medikamenteninduzierte autonome Blockade zur Messung der In-vivo-Herzfrequenz, isolierte Herzaufzeichnungen zur Messung der intrinsischen Herzfrequenz und sinoatriale Streifen- oder Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von sinoatrialen Schrittmacherzellen zur Messung spontaner Aktionspotenzial-Feuerraten. Diese traditionelleren Techniken können jedoch technisch anspruchsvoll und schwierig durchzuführen sein. Hier stellen wir eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate vor, indem wir Mikroelektrodenarray-Aufnahmen (MEA) von Sinusknotenpräparaten von Mäusen durchführen. MEAs bestehen aus mehreren Mikroelektroden, die in einem gitterartigen Muster angeordnet sind, um extrazelluläre In-vitro-Feldpotentiale aufzuzeichnen. Die hier beschriebene Methode hat den kombinierten Vorteil, dass sie relativ schneller, einfacher und präziser ist als frühere Ansätze zur Aufzeichnung intrinsischer Herzfrequenzen und gleichzeitig eine einfache pharmakologische Abfrage ermöglicht.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Herz ist ein komplexes Organ, das sowohl von kardiale-intrinsischen als auch von extrinsischen Einflüssen gesteuert wird, wie sie im Gehirn entstehen. Der Sinusknoten (SAN) ist eine definierte Region im Herzen, die die Schrittmacherzellen (auch als Sinuszellen oder SA-Zellen bezeichnet) beherbergt, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung des Herzschlags von Säugetieren verantwortlich sind1,2. Die intrinsische Herzfrequenz ist die Rate, die von den Herzschrittmacherzellen ohne Einfluss anderer kardialer oder neurohumoraler Einflüsse angetrieben wird, aber traditionelle Messungen der Herzfrequenz bei Menschen und lebenden Tieren, wie Elektrokardiogramme, spiegeln sowohl den Herzschrittmacher als auch neuronale Einflüsse auf das Herz wider. Der bemerkenswerteste neuronale Einfluss auf SA-Zellen kommt vom autonomen Nervensystem, das ständig Feuermuster moduliert, um die physiologischen Anforderungen des Körpers zu erfüllen3. Um diese Idee zu unterstützen, finden sich in der Nähe des SAN4sowohl sympathische als auch parasympathische Projektionen. Das intrinsische Herznervensystem (ICNS) ist ein weiterer wichtiger neuronaler Einfluss, bei dem ganglionierte Plexi, insbesondere in den rechten Vorhöfen, die Aktivität des SAN 5innervierenund regulieren5,6.

Das Verständnis von Schrittmacherdefiziten ist klinisch wichtig, da Funktionsstörungen vielen Herzerkrankungen zugrunde liegen und zum Risiko anderer Komplikationen beitragen können. Sick-Sinus-Syndrom (SSS) ist eine Kategorie von Krankheiten, die durch eine Dysfunktion des Sinusknotens gekennzeichnet sind, die die richtige Schrittmacherei behindert7,8. SSS kann mit Sinusbradykardie, Sinuspausen, Sinusstillstand, sinoatrialem Austrittsblock und abwechselnden Bradyarrythmien und Tachyarrhythmien9 auftreten und kann zu Komplikationen führen, einschließlich eines erhöhten Risikos für embolischen Schlaganfall und plötzlichen Tod8,10. Diejenigen mit Brugada-Syndrom, einer Herzerkrankung, die durch Kammerflimmern mit einem erhöhten Risiko für plötzlichen Herztod gekennzeichnet ist, haben ein höheres Risiko für arrhythmogene Ereignisse, wenn sie auch eine komorbide SAN-Dysfunktion haben11,12. Sinoatriale Dysfunktion kann auch physiologische Folgen über das Herz hinaus haben. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass SSS Beifällen bei einem Patienten aufgrund einer zerebralen Hypoperfusion ausgelöst wird13.

Um sinoatriale Schrittmacherdefizite zu identifizieren, müssen die intrinsischen Herzfrequenzen durch Messung der Aktivität des SAN ohne den Einfluss des autonomen Nervensystems oder humoraler Faktoren bestimmt werden. Klinisch kann dies durch pharmakologische autonome Blockade14angenähert werden, aber dieselbe Technik kann auch in Säugetiermodellen angewendet werden, um die intrinsische Herzfunktion15,16zu untersuchen. Während dieser Ansatz einen großen Teil der beitragenden neuronalen Einflüsse blockiert und eine In-vivo-Herzuntersuchung ermöglicht, beseitigt er nicht alle extrinsischen Einflüsse auf das Herz vollständig. Eine weitere Forschungstechnik, die zur Untersuchung der intrinsischen Herzfunktion in Tiermodellen verwendet wird, sind isolierte Herzaufnahmen mit Langendorff-perfundierten Herzen, die typischerweise Messungen mit Elektrogrammen, Pacing oder epikarden Multielektrodenarrays17,18,19,20beinhalten . Während diese Technik spezifischer für die Herzfunktion ist, da sie das Herz aus dem Körper entfernt, können die Messungen immer noch durch mechanoelektrische Autoregulationsmechanismen beeinflusst werden, die die intrinsischen Herzfrequenzmessungen beeinflussen könnten21. Die isolierten Herzaufnahmen können auch noch durch autonome Regulation durch das ICNS 5,6,22,23beeinflusst werden. Darüber hinaus kann die Aufrechterhaltung einer physiologisch relevanten Temperatur des Herzens, die für Herzfunktionsmessungen entscheidend ist, bei isolierten Herzansätzen schwierig sein20. Eine direktere Methode zur Untersuchung der SAN-Funktion besteht darin, SAN-Gewebe spezifisch zu isolieren und seine Aktivität zu messen. Dies kann durch SAN-Streifen (isoliertes SAN-Gewebe) oder isolierte SAN-Schrittmacherzellen24,25erreicht werden. Beide erfordern ein hohes Maß an technischer Ausbildung, da das SAN eine sehr kleine und hoch definierte Region ist und die Zellisolierung eine noch größere Herausforderung darstellt, da die Dissoziation die allgemeine Gesundheit der Zelle schädigen kann, wenn sie nicht richtig durchgeführt wird. Darüber hinaus erfordern diese Techniken elektrophysiologische Fachkenntnisse, um mit einzelnen Aufzeichnungsmikroelektroden erfolgreich aus dem Gewebe oder den Zellen aufzunehmen.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur Aufzeichnung des SAN in vitro mit einem Mikroelektrodenarray (MEA), um intrinsische Herzfrequenzmessungen zu erhalten. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass hochspezifische elektrophysiologische Aufzeichnungen forschern zugänglich gemacht werden, denen es an intensiven elektrophysiologischen Fähigkeiten mangelt. MEAs wurden zuvor verwendet, um die Kardiomyozytenfunktion in primären Kardiomyozytenkulturen26,27,28,29,30,31,32, Herzblättern33,34,35,36,37,38,39und Gewebe ganzen Mounts40zuuntersuchen. 41,42,43,44,45,46,47. Frühere Arbeiten wurden auch durchgeführt, um Feldpotentiale in SAN-Gewebe41,42zu untersuchen. Hier bieten wir eine Methodik zur Verwendung der MEA zur Aufzeichnung und Analyse der intrinsischen SAN-Feuerraten von Murinen. Wir beschreiben auch, wie diese Technik verwendet werden kann, um pharmakologische Wirkungen von Medikamenten auf die intrinsischen Zündraten von SAN zu testen, indem ein Beispielexperiment zur Verfügung gestellt wird, das die Auswirkungen von 4-Aminopyridin (4-AP), einem spannungsgesteuerten K+ Kanalblocker, zeigt. Mithilfe definierter anatomischer Landmarken können wir das SAN genau erfassen, ohne die umfangreichen Gewebedissektionen oder Zellisolierungen durchführen zu müssen, die für andere Methoden erforderlich sind. Während die MEA unerschwinglich sein kann, bieten die Aufzeichnungen hochspezifische und zuverlässige Messungen der Schrittmacherei, die in einer Vielzahl von klinischen und physiologischen Forschungsanwendungen verwendet werden können.

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Southern Methodist University genehmigt wurden.

1. Beschichtung des Multielektroden-Arrays (MEA) für die Aufnahme

  1. Machen Sie 25 mM Boratpuffer.
    1. 0,953 gNa2B4O7·10H2O in 80 ml destilliertem Wasser auflösen.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,4 ein und fügen Sie dann destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml hinzu.
  2. Stellen Sie eine 0,1% ige Stammlösung aus Polyethylenimin (PEI) her.
    1. Fügen Sie 100 μL 50% (w/v) PEI zu 4,9 ml destilliertem Wasser hinzu, um eine 1% ige PEI-Lösung herzustellen.
    2. Verdünnen Sie die 1% ige PEI-Lösung auf 0,1% im Boratpuffer, indem Sie 1 ml der 1% igen PEI-Lösung zu 9 ml des 25 mM Boratpuffers hinzufügen.
  3. Pipette ~1 ml der 0,1% igen PEI-Lösung in die MEA-Schüssel (Microelectrode Array), so dass die Elektroden vollständig abgedeckt sind (Abbildung 1A und 1B).
    HINWEIS: Die Mikroelektroden der MEA bestehen typischerweise aus Platinschwarz oder Kohlenstoffnanoröhre und sind mit Polyimid (oder Acryl) isoliert; beide Materialien sind hydrophob. Durch die Beschichtung der MEA mit einem kationischen Polymer wie PEI wird die hydrophobe MEA-Oberfläche hydrophiler, so dass Gewebeproben besser mit der MEA-Oberfläche in Kontakt kommen können (Abbildung 1A1).
  4. Decken Sie die MEA-Schale mit thermoplastischer Folie ab, um die Verdunstung zu reduzieren, und lassen Sie die MEA über Nacht bei Raumtemperatur belassen (Abbildung 1C).
  5. Saugen Sie die PEI-Lösung mit einer Pipette aus der MEA-Schüssel ab, achten Sie darauf, das Elektrodengitter nicht zu berühren, das die Elektroden beschädigen kann, und spülen Sie dann ≥4 Mal mit destilliertem Wasser ab(Abbildung 1D).
  6. Lagern Sie das PEI-beschichtete MEA unter 1-2 mL Reinstwasser und versiegeln Sie es mit thermoplastischer Folie bei 4 °C, bis es benötigt wird. Alternativ können Sie das beschichtete MEA lagern, indem Sie es in ein mit Reinstwasser gefülltes Becherglas tauchen (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Der PEI-Beschichtungsprozess muss für den MEA vor seiner ersten Verwendung nur einmal durchgeführt werden, und nach jeder Aufnahmesitzung sollte der MEA in Reinstwasser getaunken gelagert werden.

2. Herstellung der vollständigen Tyrode-Lösung für die Gewebedissektion

  1. Machen Sie 1.000 ml vollständige Tyrode-Lösung zum Dissektionieren; Zuerst 8,1816 g NaCl zu 800 ml Reinstwasser hinzufügen.
  2. Fügen Sie der Lösung die folgende Menge an Chemikalien hinzu: 0,4025 g KCl; 0,1633 gKH2PO4; 1,1915 g HEPES; 0,9999 g Glukose; 0,0952 gMgCl2; 0,2646 g CaCl2·2H2 O.
  3. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein und fügen Sie dann Reinstwasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 1.000 ml beträgt.
    HINWEIS: Die endgültige Zusammensetzung der vollständigen Tyrode-Lösung ist die folgende (in mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 Glucose, 1 MgCl2, 1,8CaCl2.

3. Vorbereitung der sauerstoffhaltigen Tyrode-Lösung für die Aufnahme

  1. Machen Sie 500 ml Tyrodes Lösung; 4,003 g NaCl zu 400 ml Reinstwasser hinzufügen.
  2. Fügen Sie der Lösung die folgenden Mengen an Chemikalien hinzu: 0,651 g NaHCO3; 0,042 gNaH2PO4; 0,132 g CaCl2·2H2 O; 0,149 g KCl; 0,0476 gMgCl2; 0,999 g Glukose.
  3. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein und fügen Sie dann Reinstwasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 500 ml beträgt.
  4. Sauerstoffanhalten Sie die Lösung mit Carbogen für mindestens 30 min bei Raumtemperatur, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
    HINWEIS: Die endgültige Zusammensetzung der Tyrode-Lösung ist die folgende (in mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3,0,7 NaH2PO4,1,8 CaCl2,4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 Glucose. Diese Tyrode-Lösung hat eine etwas andere Zusammensetzung als die Complete Tyrode-Lösung, die zum Dissektionieren verwendet wird.

4. Herstellung von 4-Aminopyridin (4-AP)-Lösung zur pharmakologischen Modulation

  1. Machen Sie eine 1 mM Arbeitslösung von 4-AP; Fügen Sie 18,82 mg 4-AP zu 200 ml der Tyrode-Lösung aus Schritt 3 hinzu.
  2. Sauerstoff die 4-AP-Lösung für mindestens 30 Minuten vor dem Experiment.

5. Vorbereitung der Petrischale für die Sezierung

  1. Mischen Sie Siliconelastomerkomponenten im Verhältnis 10:1 (nach Gewicht) der Basis zum Härter.
  2. Gießen Sie ~15 ml Silikonelastomermischung in eine Petrischale mit 60 mm Durchmesser.
  3. Lassen Sie das Elastomer vor Gebrauch 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten.
    HINWEIS: Die silikonisierte Petrischale kann für zukünftige Dissektionen wiederverwendet werden.

6. Sezieren des Sinusknotens (SAN)

  1. Bereiten Sie die heparinisierte Komplettlösung von Tyrode für die SAN-Dissektion vor.
    1. 400 μL Heparin (1.000 USP/ml) zu 40 ml Komplettlösung von Tyrode geben und in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
  2. Injizieren Sie die Maus intraperitoneal mit 200-300 μL Heparin (1000 USP/ ml) und lassen Sie das Tier 10 Minuten sitzen.
  3. Euthanisieren Sie die heparinisierte Maus durch Isofluran-Überdosierung.
    1. Legen Sie die Maus in eine kleine Glaskammer, die Isoflurandämpfe enthält, die durch Zugabe von 200-300 μL flüssigem Isofluran zu einem Filterpapier in einem perforierten Kunststoffrohr erzeugt werden.
      HINWEIS: Da Isofluran Hautreizungen verursachen kann und auch über die Haut aufgenommen werden kann, sollte die Flüssigkeit die Maus nicht direkt kontaktieren. Daher wird das isoflurangetränkte Tuch zur Verabreichung in ein perforiertes Röhrchen gegeben.
    2. Überprüfen Sie den Tod durch Einstellung der Bewegung und Atmungsbemühung und durch das Fehlen eines Zehenquemmreflexes. Der Tod dauert normalerweise etwa 1-2 Minuten nach dem Einsetzen in die Kammer.
      HINWEIS: Der Tod wird normalerweise vom Wasserlassen begleitet.
  4. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Sezierbrett mit ausgestreckten Pfoten und befestigen Sie die Pfoten mit 1 Zoll langen, 23-Gauge-Spritzennadeln am Brett. Dann entfernen Sie das Fell in der Nähe des Bodens des Brustkorbs, indem Sie eine chirurgische Schere verwenden und das Fell an den Wurzeln schneiden.
    HINWEIS: Für eine Sezierplatte können Polystyrol-Kühlerdeckel verwendet werden.
  5. Während Sie die Haut mit einem Hämostat halten, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Querschnitt in die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs vom linken Rippenbogen zum rechten Rippenbogen zu machen (Abbildung 3A).
  6. Schneiden Sie das Peritoneum mit einer chirurgischen Schere auf und trennen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell, wobei Sie darauf achten, die Leber nicht zu verneinen, was zu übermäßigen Blutungen führt (Abbildung 3B). Schneiden Sie die Membran entlang des Thorax ein, um die Brusthöhle freizulegen (Abbildung 3C-D).
  7. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Seitenwände des Brustkorbs von den Rändern der Rippenbögen bis zu den Klappen, um das Herz freizulegen, wobei Sie darauf achten, das Herz nicht zu beschädigen (Abbildung 3D). Verwenden Sie dann eine 23-Gauge-Spritzennadel, um den Brustkorb über die Schulter zu stecken, ihn an Ort und Stelle und aus dem Weg des Operationsfeldes zu halten.
  8. Verwenden Sie eine Transferpipette, um warme (37 °C) heparinisierte Complete Tyrode-Lösung auf das Herz zu tropfen, um es feucht zu halten.
    HINWEIS: Lassen Sie das Herz nicht austrocknen.
  9. Entfernen Sie die Lunge, indem Sie sie mit einer extra feinen Graefe-Zette halten und die Luftröhre mit einer chirurgischen Schere durchtrennen (Abbildung 3E).
  10. Halten Sie die Herzspitze mit einer extra feinen Graefe-Zette und entfernen Sie sie, indem Sie die Aorta und die Hohlvene mit einer chirurgischen Schere schneiden. Übertragen Sie das Herz in eine Petrischale mit ausgehärtetem Silikonelastomer (Abbildung 4A) und verwenden Sie eine Transferpipette, um das Herz mit 2-3 ml warmer (37 °C) heparinisierter Komplettlösung von Tyrode zu baden.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die empfindliche Hinterwand der rechten Vorhöfe, die das SAN enthält, und die angeschlossenen rechten Vorhöfe nicht zu beschädigen. Das Baden des Herzens mit der Lösung von Complete Tyrode verhindert, dass das Herz austrocknet, aber tauchen Sie das Herz nicht vollständig in Lösung, da es die Sichtbarkeit während der Dissektion beeinträchtigt.
  11. Richten Sie das Herz mit dem rechten Vorhof auf der rechten Seite des Experimentatores und dem linken Vorhof auf der linken Seite des Experimentatores aus.
    HINWEIS: Die Dissektion des SAN-Gewebes sollte schnell durchgeführt werden, um ischämiebedingte Verletzungen zu vermeiden.
  12. Befestigen Sie die Spitze des Herzens mit einem Sezierstift an der Schüssel. Dann, während Sie die untere Hohlvene mit Dumont #2 Laminektomie-Heerzette halten, führen Sie eine 22 G Spritzennadel durch die untere und obere Hohlvene ein, um ihre Position im rechten Vorhof zu lokalisieren, die auch die ungefähre Position des SAN identifiziert (im Gewebefleck zwischen der unteren und oberen Hohlvene (Abbildung 4B).
  13. Mit kleinen Sezierstiften die linken und rechten Vorhoffnsel an die Schüssel heften.
    1. Während Sie das linke Vorhoffnungsteil mit Dumont #2 Laminektomie-Pinge halten, legen Sie einen Sezierstift durch das linke Vorhoffliedsteil, um es an Ort und Stelle zu halten.
    2. Während Sie das rechte Vorhoffnungsteil mit Dumont #55 Zange halten, stecken Sie einen Sezierstift durch das rechte Vorhoffnungsteil, um es an Ort und Stelle zu halten.
      HINWEIS: Die gleiche Art von Zette kann verwendet werden, um die linken und rechten Vorhoffnungsstücke zu halten, wenn gewünscht.
  14. Entfernen Sie die Spritzennadel, die die Venae Cavae überspannt.
  15. Um Blut aus dem Herzen freizusetzen, verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um die Spitze des Herzens (dh die untere Hälfte) zu entfernen, indem Sie einen Querschnitt über die Ventrikel machen (Abbildung 4C). Waschen Sie dann das Herz, indem Sie warme (37 °C) heparinisierte Complete Tyrode-Lösung mit einer Transferpipette hinzufügen.
  16. Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um entlang des atrioventrikulären Septums zu schneiden, wobei der Schnitt näher am Ventrikel als an den Vorhöfen bleibt. Schneiden Sie weiter entlang des atrioventrikulären Septums, bis die Vorhöfe von den Ventrikeln getrennt sind.
  17. Schneiden Sie entlang des interatrialen Septums, um den linken Vorhof zu entfernen.
  18. Platzieren Sie Dissektionsstifte in der Peripherie des rechten Vorhofs, damit es flach liegt (Abbildung 4D). Entfernen Sie mit der Castroviejo-Schere verbleibendes Fett, Gefäße oder Gewebe aus dem Vorhof.
  19. Suchen Sie das SAN im rechten Vorhof, der in dieser Ausrichtung ungefähr von der oberen Hohlvene (oben), der unteren Hohlvene (unten) und der Cristae terminalis (links) umgeben ist (Abbildung 4D).
    HINWEIS: Die Crista terminalis erscheint als dunkler Muskelkamm zwischen dem rechten Vorhoffnungsglied und dem SAN. Oft ist auch die SAN-Arterie durch das SAN zu sehen (Abbildung 4D).

7. Vorbereitung des MEA-Systems für die Aufzeichnung

  1. Fügen Sie tyrodes Lösung (aus Schritt 3) in die Eingangslösungsflasche(Abbildung 5C)hinzu und versorgen Sie sie mit Sauerstoff, indem Sie den Durchfluss von Carbogengas (Abbildung 5A) zum System einschalten.
    HINWEIS: Die für die Aufnahme verwendete Tyrode-Lösung unterscheidet sich in ihrer Zusammensetzung geringfügig von der Lösung des Complete Tyrode, die für die Dissektion verwendet wird.
  2. Überprüfen Sie den Durchfluss des Carbogens, indem Sie Blasen im konischen Kolben beobachten, der zur Befeuchtung des Gases(Abbildung 5B)verwendet wird, und in der Eingangslösungsflasche(Abbildung 5C).
  3. Führen Sie den Zulaufschlauch der Peristaltikpumpe (Abbildung 5D) in die Aufzeichnungslösung des Tyrode ein (Abbildung 5C). Führen Sie dann den Ausflussschlauch der Schlauchflasche der Schlauchpumpe in die Auffangflasche ein (Abbildung 5I).
  4. Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 25 U / min ein, was eine Durchflussrate von 2 ml / min ergibt, und starten Sie die Pumpe. Überprüfen Sie das System auf Pufferleckagen oder Überläufe.
  5. Stellen Sie den Temperaturregler auf 37 °C ein, die physiologische Temperatur von Mäusen (Abbildung 5E).

8. Platzieren des Herzgewebes auf dem MEA-Gitter

  1. Übertragen Sie das sezierte SAN-Gewebe mit Hilfe eines Pinsels (Abbildung 6A) von der sezierenden Petrischale auf das MEA-Gitter (Abbildung 1A1).
    1. Positionieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einem weichen Pinsel, während Sie unter ein umgekehrtes Mikroskop schauen, so dass der SAN-Bereich das Elektrodengitter überlagert.
    2. Positionieren Sie das Gewebe nach Bedarf neu, um sicherzustellen, dass es flach auf dem Elektrodengitter liegt und einen guten Kontakt mit den Elektroden herstellt.
      HINWEIS: Ein weicher Pinsel ist erforderlich, um das Gewebe zu bewegen, um eine Beschädigung des Elektrodengitters zu vermeiden.
  2. Sobald das Gewebe richtig positioniert ist, verwenden Sie eine Knochenzette (oder eine gekrümmte Zange), um das Netz über das Gewebe zu legen (Abbildung 6A). Verwenden Sie dann die Knochenzette, um den Harfenanker (Abbildung 6A) auf dem Netz zu platzieren, um alles an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 6B).
  3. Machen Sie ein Bild von der Positionierung des Gewebes auf der MEA, so dass die Aktivität einzelner Elektroden während der Aufnahme mit ihrer anatomischen Position korreliert werden kann. Dies kann durch Halten eines Smartphones an das invertierte Mikroskopobjektiv oder durch Die Verwendung einer angeschlossenen Mikroskopkamera erfolgen.
    HINWEIS: Wenn die Ausrichtung des MEA nach der Aufnahme des Bildes nicht geändert wird, wird die obere linke Elektrode während der Aufnahme als erster Kanal (Ch1) angezeigt.
  4. Legen Sie die MEA-Schüssel auf die Anschlussplatte (Abbildung 5F und 6C) und legen Sie die Perfusionskappe (Abbildung 6C) vorsichtig auf die MEA-Schüssel, ohne den Harfenscheibenanker zu stören. Die Perfusionskappe kann mit einem Stück Laborband weiter gesichert werden (Abbildung 6C).
    HINWEIS: Neben einstellbaren Lösungszu- und -ausströmrohren verfügt die Kappe auch über einen Anschluss für die Gaslieferung (Abbildung 6C). Zusätzlich verläuft der Referenzelektrodenring durch die Kappe (Abbildung 6C).
  5. Lassen Sie das Gewebe sich von der Handhabung erholen und sich vor der Aufnahme 15-20 Minuten lang an die Kammer gewöhnen.

9. Einstellen des Datenerfassungsprotokolls für die Aufzeichnung

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben das Öffnen des Softwareprotokolls für spontane Beataufnahmen und das Definieren der Aufnahmebedingungen. Die Besonderheiten dieser Schritte können je nach verwendeter Software variieren, aber die allgemeine Gliederung sollte gleich bleiben.

  1. Schalten Sie den Verstärker ein (Abbildung 5G), und richten Sie einen Workflow für die Aufzeichnung in der Software auf dem Computer ein (Abbildung 5H).
    1. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf den Workflow.
    2. Wählen Sie Neuen Ordner öffnen.
    3. Öffnen Sie den Ordner Aus Vorlagen.
    4. Wählen Sie 64MD1-1920X1080 (abhängig von der Auflösung Ihres Desktops).
    5. Öffnen Sie den QT-Ordner.
    6. Öffnen Sie den Ordner Spontane Aufzeichnung.
    7. Wählen Sie Beat_recording.moflo-Vorlage aus, und öffnen Sie sie (Abbildung 7A).
  2. Stellen Sie die Aufzeichnungsparameter ein, um die Anzahl der Leiterbahnen, die Leiterbahndauer, das Leiterbahnintervall, die Eingangsspannung, die Abtastrate usw. entsprechend den gewünschten Aufzeichnungsbedingungen anzugeben (Abbildung 7B).
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Beatfrequenz- und Interspike-Datenerfassung in der Regel eine Eingangsspannung von 2,9 mV, einen 1-Hz-Hochpassfilter, einen 1000-Hz-Tiefpassfilter und eine Abtastrate von 20 kHz.
  3. Um verschiedene Phasen oder Bedingungen des Experiments zu markieren, z. B. vor und nach der Verabreichung des Arzneimittels, klicken Sie auf die Registerkarte Anmerkungen, um die gewünschten Notationen hinzuzufügen (Abbildung 7C).
  4. Um das Dateiziel für die zu erfassenden Daten anzugeben, aktivieren Sie das Feld Speicher aktivieren und geben Sie den gewünschten Dateinamen in das Feld Dateinamenmodifizierer ein.

10. Durchführung der Aufzeichnung und Erhebung von Daten

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme und Wiedergabe in der obersten Menüleiste der Erfassungssoftware, um die Aufnahme zu starten. Erfassen Sie Daten für 10 Spuren von 1 Min. Dauer mit Intervallen von 2 min zwischen den Traces.
  2. Überprüfen Sie anhand dieser ersten Spuren, ob die aufgezeichneten Wellenformen mit einer gesunden und hochwertigen Gewebevorbereitung übereinstimmen, indem Sie bestätigen, dass die Mehrheit der Aufzeichnungskanäle Signalamplituden von ≥ 0,5 mV und identische Interspike-Intervalle aufweisen (Abbildung 8).
    HINWEIS: Eine erste Beurteilung der Aktivität und der Wellenformen der einzelnen Mikroelektroden entsprechend ihrer anatomischen Position kann durchgeführt werden, indem auf das Bild verwiesen wird, das nach der Positionierung des Gewebes auf der MEA aufgenommen wurde.
  3. Um die Auswirkungen von Medikamenten auf das Gewebe zu messen, pausieren Sie die Aufzeichnung nach der Erfassung der ersten Baseline-Daten, indem Sie auf die Pause-Schaltfläche in der obersten Menüleiste klicken.
    HINWEIS: Die Drug-Response-Phase des Experiments kann in der Aufzeichnung notiert werden, indem Sie auf die Registerkarte Annotations klicken und die gewünschte Notation wie oben beschrieben hinzufügen (Abbildung 7C).
  4. Pausieren Sie die Pumpe und schalten Sie den Pumpenzuflussschlauch von der normalen Aufzeichnungslösung auf Tyrodes Lösung um, die das gewünschte Medikament der Wahl enthält.
    HINWEIS: Im Beispielexperiment wurde Tyrodes Lösung mit 1 mM 4-Aminopyridin (4-AP) verwendet.
  5. Starten Sie die Pumpe neu und beenden Sie die Unterbrechung der Aufzeichnung, um erneut mit der Datenerfassung zu beginnen.
  6. Sobald die mit dem Medikament angereicherte Tyrode-Lösung das Gewebe erreicht hat, zeichnen Sie 10 Spuren auf die gleiche Weise auf, wie dies zuvor für die Baseline-Aufnahmen der Standardwertaufnahmen der Standard war.
    HINWEIS: Die Spuren werden einige Zeit brauchen, um sich zu stabilisieren, wenn das Medikament in die Aufnahmekammer eindringt. Der Wirkungsmechanismus des Arzneimittels kann auch die Aufzeichnungsstabilität beeinflussen. Bei Arzneimitteln mit reversiblen Wirkmechanismen sollte auch eine Auswaschperiode aufgezeichnet werden, um die Wiederherstellung der Aktivität auf das Ausgangsniveau zu bestätigen, was ein Indikator für gesundes Gewebe ist.
  7. Klicken Sie auf Beenden, um die Aufzeichnungen abzuschließen.
  8. Machen Sie ein abschließendes Bild der Positionierung des Gewebes auf dem MEA unter dem Mikroskop, falls sich das Gewebe nach dem ersten Aufnahmeaufbau verschoben hat.

11. Reinigen des Setups nach der Aufnahme

  1. Reinigen Sie den MEA.
    1. Nach Abschluss der Aufnahme die Aufnahmelösung vorsichtig mit einer 1 ml Mikropipette aus der MEA-Schüssel entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die MEA-Elektroden nicht zu kontaktieren, die sie beschädigen können.
    2. Entfernen Sie das Netz und den Harfenanker mit einer Knochenzette (oder einer gekrümmten Zange). Verwenden Sie dann einen Pinsel, um das Gewebe von der MEA-Oberfläche zu vertreiben, wobei Sie immer darauf achten, die einzelnen Mikroelektroden nicht zu berühren.
    3. Spülen Sie die MEA-Schale mit einer Waschflasche etwa 3 bis 4 Mal vorsichtig mit Reinstwasser ab.
    4. Lagern Sie das gereinigte MEA in Reinstwasser bei 4 °C.
  2. Spülen Sie den Systemschlauch ab, indem Sie mindestens 5 Minuten lang Reinstwasser mit der maximalen Drehzahleinstellung an der Peristaltikpumpe durch ihn laufen lassen.
    HINWEIS: Um Pilzwachstum zu verhindern, sollte nach der Reinigung kein Wasser oder Pufferlösung im Schlauch verbleiben.

12. Analyse der MEA-Aufnahmen zur Messung der SAN-Beat-Frequenz

  1. Öffnen Sie die gespeicherte aufgezeichnete Datendatei in der Vorlage "Beat_frequency_analysis" der Analysesoftware (Abbildung 9) .
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Play und lassen Sie die gesamte Aufzeichnung laufen, um den Datensatz zu visualisieren und entsprechende Analyseparameter zuzuweisen.
    1. Wählen Sie das Binning-Fenster für das gewünschte Anzeigeformat der Daten aus, unabhängig davon, ob es als Durchschnitt pro Trace oder als Durchschnitt pro Zeit angezeigt wird (Abbildung 10A).
    2. Wählen Sie die Kanäle aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen, und legen Sie die gewünschten Amplitudenmaxima oder Amplitudenminima-Schwellenwerte für die automatisierte Wellenform-Peak-Identifizierung fest (Abbildung 10B).
      HINWEIS: In diesem Schritt können ein einzelner Kanal, eine Kombination von Kanälen oder alle 64 Kanäle zur Analyse ausgewählt werden (Abbildung 9). Wenn die ausgewählten Schwellenwerte zu nahe an den Maxima- und Minimawerten der Wellenform liegen, werden einige Wellenformspitzen von der Analysesoftware möglicherweise nicht identifiziert.
    3. Legen Sie die Zeit vor und nach der Spitze fest, die in die Analyse einbezogen werden soll.
      HINWEIS: Einstellungen von 50 ms vor dem Spike und 100 ms nach dem Spike funktionieren normalerweise gut (Abbildung 10B).
  3. Nachdem Sie die Analysebedingungen festgelegt haben, klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Wiedergabe, um den Datensatz erneut auslaufen zu lassen und zu bestätigen, dass die Analyseparameter für die Spike-Extraktion geeignet sind.
  4. Für die Analyse identifizieren Sie die drei stabilsten aufeinanderfolgenden Spuren, die eine stabile Prügelrate für jede Spur über die Mehrheit der Kanäle sowohl während des Ausgangszeitraums des Experiments als auch weitere drei aufeinanderfolgende stabile Spuren während des Arzneimittelexpositionszeitraums aufweisen (Abbildung 10A).
  5. Geben Sie die Start- und Endablaufverfolgungen für die Analyse an und geben Sie die Zeitdauer jedes zu analysierenden Ablaufverfolgungs ein (Abbildung 9).
  6. Bevor Sie mit der Analyse beginnen, aktivieren Sie die Aktivierungsfelder für Takt pro Minute speichern und Interspike-Intervall speichern ( Abbildung10B).
  7. Geben Sie den gewünschten Dateinamen in das Feld Dateinamenmodifizierer ein (Abbildung 10B). Die analysierten Daten für Beatfrequenz und Interspike-Intervall werden in Form von ASCII (Text) gespeichert.
    HINWEIS: Um verschiedene Bedingungen (z. B. Ausgangswert und Arzneimittelreaktion) zu analysieren, muss die Analyse für jede Bedingung separat durchgeführt werden.
  8. Klicken Sie in der oberen Registerkartenleiste auf die Schaltfläche Wiedergabe und Aufzeichnung, um die Analyse zu starten.
  9. Um die Daten für andere Anwendungen zu exportieren, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Beat pro Minute speichern und Interspike-Intervall speichern ( Abbildung10B). Geben Sie den gewünschten Dateinamen in das Feld Dateinamenmodifizierer ein (Abbildung 10B) und klicken Sie auf Speichern, um die analysierten Daten im ASCII-Textformat im ausgewählten Ordner zu speichern.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nachdem sich das Gewebe 15 Minuten lang in der Schüssel akklimatisieren kann, werden 10 einminige Spuren aufgezeichnet. Unser aktuelles Protokoll zeichnet die Aktivität für über eine Stunde auf, aber wir haben stabile Feuermuster für ≥4 h in unveröffentlichten Daten aufgezeichnet, die hier nicht gezeigt werden. Wenn eine experimentelle Vorbereitung für die Datenerfassung gut ist, sollte jeder Aufzeichnungskanal konsistente und gleichmäßig verteilte wiederkehrende Wellenformen (d. H. Spikes) einheitlicher Form für einen b...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Üben und Beherrschen des SAN-Dissektionsprozesses ist unerlässlich, da das Gewebe zerbrechlich ist und gesundes Gewebe für eine erfolgreiche Aufnahme notwendig ist. Während der SAN-Dissektion ist eine korrekte Orientierung unerlässlich, um die richtige Geweberegion zu erhalten. Die ursprüngliche Ausrichtung des Herzens kann jedoch während des Dissektionsprozesses leicht verloren gehen, was dieses Unterfangen erschwert. Um die richtige Links-Rechts-Ausrichtung zu gewährleisten, sollten die Vorhöfe daher visuell inspiz...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01NS100954 und R01NS099188 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-AminopyridinSigmaA78403-25G
22-Gauge-SpritzennadelFisher Scientific14-826-5AWird für die Dissektion
verwendet 23-Gauge-SpritzennadelFisher Scientific14-826-6CWird für die Dissektion
von 60-mm-Petrischalenverwendet Genesee Scientific32-105G
500 ml Pyrex-FlascheFisher Scientific06-414-1CZur Aufbewahrung von Lösungen
1000 mL Pyrex BottleFisher Scientific06-414-1DZur Aufbewahrung von Lösungen
KnochenzangeFine Science Tools16060-11
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Schere, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG7021-1KG
Datenerfassungs-PCCPU: Intel Xeon oder Intel Core i7, Arbeitsspeicher: 8GB, HDD: 1TB, Grafikkarte: NVIDIA oder On-Board, Bildschirm: 1920x1080
PräpariermikroskopJenco
PräparierstifteFine Science Tools26002-20
Dumont #2 Laminektomie-ZangeFine Science Tools11223-20
Dumont #55 PinzetteFine Science Tools11295-51
  Extra feine Graefe PinzetteFine Science Tools11152-10
GlaskammerGrainger49WF30Wird für die Einschläferung von Mäusen
verwendet Harfenanker-KitWarner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4Verwendet für den pH-Ausgleich
Hämostat Fine Science Tools13013-14
HeparinAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Inverses MikroskopMoticAE2000
IsofluranPatterson Veterinärmedizin07-893-1389
LaborbandFisher Scientific15-950
Licht für DissektionsmikroskopDolan-JennerMI150DG 660000391014
Magesiumchlorid (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 KopfverstärkerMED64MED-A64HE1S
MED64 HauptverstärkerMED64MED-A64MD1A
MED64 PerfusionskappeMED64MED-KCAP01
MED64 Perfusionsrohrhalter-KitMED64MED-KPK02
MED64 ThermoConnectorMED64MED-CP04
Mesh  Warner Instruments640246
Mikroelektrodenarray (MEA)Alpha Med ScientificMED-R515A
Mobius SoftwareWitWerx Inc.Spezifische Software für das MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500Verwendet für den pH-Ausgleich
Normale KochsalzlösungUltigieneNDC 50989-885-17
PinselFisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
SchlauchpumpeGilsonF155009
Schlauch für peristaltische PumpeFisher Scientific14-171-2981/8'' Innendurchmesser
PolyethyleniminSigmaP3143
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP9333-500G
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655-500G
Natrium BicarbonatSigmaS6297
Natriumchlorid (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Sylgruard Elastomer KitDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5KG
Natriumphosphat MonobasicSigmaS6566
NatriumtetraboratSigmaS9640
Chirurgische SchereFeinwissenschaftliche Werkzeuge14074-09
Transferpipetten (3 mL graduiert)Samco Scientific225

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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