Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

Jody  Fromm Longo; Stephanie N. Brosius; Steven L. Carroll

doi:10.3791/62740

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Methodenartikel

Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

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DOI:

10.3791/62740

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25. August 2021

Jody Fromm Longo¹ , Stephanie N. Brosius²^,³ , Steven L. Carroll¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, ²Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, ³Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung von Gen-Knockouts vor, die in vivo in gentechnisch veränderten Mausmodell-abgeleiteten Tumoren embryonal tödlich sind, und bewerten dann die Wirkung, die der Knockout auf Tumorwachstum, Proliferation, Überleben, Migration, Invasion und das Transkriptom in vitro und in vivo hat.

Zusammenfassung

Die Entwicklung neuer Medikamente, die genau auf Schlüsselproteine bei menschlichen Krebserkrankungen abzielen, verändert die Krebstherapeutika grundlegend. Bevor diese Medikamente jedoch eingesetzt werden können, müssen ihre Zielproteine als therapeutische Ziele bei bestimmten Krebsarten validiert werden. Diese Validierung wird häufig durchgeführt, indem das Gen, das für das therapeutische Ziel in einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEM) von Krebs kodiert, ausgeschaltet und bestimmt wird, welche Auswirkungen dies auf das Tumorwachstum hat. Leider schränken technische Probleme wie die embryonale Letalität bei konventionellen Knockouts und der Mosaikismus bei bedingten Knockouts diesen Ansatz oft ein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Ansatz zur Ablation eines abgeloxierten embryonalen tödlichen Gens entwickelt, das in Kurzzeitkulturen von bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs) von Interesse ist, die in einem GEM-Modell erzeugt wurden.

Dieses Papier beschreibt, wie man ein Mausmodell mit dem entsprechenden Genotyp etabliert, kurzfristige Tumorkulturen von diesen Tieren ableitet und dann das floxierte embryonale tödliche Gen mit einem adenoviralen Vektor abträgt, der Cre-Rekombinase und verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert. Die Reinigung von Zellen, die mit Adenovirus transduziert wurden, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und die Quantifizierung der Auswirkungen, die die Genablation auf die Zellproliferation, Lebensfähigkeit, das Transkriptom und das orthotope Allotransplantatwachstum ausübt, wird dann detailliert beschrieben. Diese Methoden bieten einen effektiven und generalisierbaren Ansatz zur Identifizierung und Validierung therapeutischer Ziele in vitro und in vivo. Diese Ansätze bieten auch eine erneuerbare Quelle für von Tumoren abgeleitete Zellen mit niedriger Passage mit reduzierten In-vitro-Wachstumsartefakten. Auf diese Weise kann die biologische Rolle des Zielgens in verschiedenen biologischen Prozessen wie Migration, Invasion, Metastasierung und interzellulärer Kommunikation, die durch das Sekretom vermittelt werden, untersucht werden.

Einleitung

Vor den letzten zwei Jahrzehnten stützte sich die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen stark auf Strahlentherapie und Chemotherapeutika, die im Großen und Ganzen auf sich schnell vermehrende Zellpopulationen abzielten, indem sie die DNA schädigten oder die DNA-Synthese hemmten. Obwohl diese Ansätze das Wachstum von Krebszellen hemmten, hatten sie auch schädliche Nebenwirkungen auf normale, sich schnell vermehrende Zelltypen wie Darmepithelzellen und Haarfollikelzellen. In jüngerer Zeit hat die Krebstherapie begonnen, Chemotherapeutika zu verwenden, die genau auf Proteine innerhalb von Signalwegen abzielen, die für das Wachstum des Neoplasmas eines einzelnen P....