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Methodenartikel

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

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DOI:

10.3791/62744

⸱

20. November 2021

 , 
1DBT-National Brain Research Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Zusammenfassung

In Neuronen war die Mikrotubuliorientierung ein Schlüsselbewerter, um Axone zu identifizieren, die Plus-End-Out-Mikrotubuli und Dendriten haben, die im Allgemeinen eine gemischte Orientierung haben. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern von Mikrotubuli-Spitzen haben wir die axonalen Mikrotubuli abgebildet. Die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonerektomie initiieren, können mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Dieser Assay ist an andere Neuronen und genetische Hintergründe anpassbar, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen zu untersuchen.

Einleitung

Neuronen haben eine ausgeklügelte Architektur mit spezialisierten Kompartimenten wie Dendriten, Zellkörpern, Axonen und Synapsen. Das neuronale Zytoskelett besteht aus den Mikrotubuli, Mikrofilamenten und Neurofilamenten und ihre unterschiedliche Organisation unterstützt die neuronalen Kompartimente strukturell und funktionell1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10 . Im Laufe der Jahre wurde die Organisation von Mikrotubuli als Schlüsseldeterminante für neuronale Polarität und Funktion identifiziert. Da Neuronen während der Entwicklung oder Regeneration einem strukturellen Umbau unterzogen werden, bestimmen die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli die Identität, den polarisierten Transport, das Wachstum und die Entwicklung verschiedener neuronaler Kompartimente7. Es ist daher unerlässlich, die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in vivo zu bewerten, um mit dem neuronalen Umbauprozess zu korrelieren.

Mikrotubuli bestehen aus Protofilamenten α und β Tubulin-Heterodimeren mit dynamischen Plusenden und relativ stabilen Minusenden11,12. Die Entdeckung des Plus-Tip-Komplexes und der damit verbundenen Endbindungsproteine haben es einer Plattform ermöglicht, die Mikrotubuli-Organisation zu bewerten13. Endbindungsproteine (EBP) assoziieren sich vorübergehend mit den wachsenden Plusenden der Mikrotubuli und ihre Assoziationsdynamik korreliert mit dem Wachstum der Mikrotubuli-Protofilamente14,15. Aufgrund der häufigen Assoziation und Dissoziation von Plusspitzenkomplex mit dem Mikrotubuli erscheint die Punktspreizfunktion von GFP-getaggtem EBP als "Komet" in einem Zeitrafferfilm15,16. Seit der bahnbrechenden Beobachtung in Säugetierneuronen16werden Endbindungsproteine, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, verwendet, um die Mikrotubulidynamik über verschiedene Modellsysteme und Neuronentypen17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen.

Aufgrund seines einfachen Nervensystems und seines transparenten Körpers hat sich C. elegans als hervorragendes Modellsystem erwiesen, um den neuronalen Umbau während der Entwicklung und Regeneration in vivo zu untersuchen. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodiertem EBP-2::GFP haben wir die Mikrotubuli im PLM-Neuron abgebildet, wodurch wir die Polarität der Mikrotubuli in zwei verschiedenen Neuriten dieses Neurons24bestimmen konnten. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung der EBP-Kometen als Maß für die Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Kontexten, zum Beispiel können die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonischer Axotomie initiieren, mit unserem Protokoll beurteilt werden. Dieser Assay kann angepasst werden, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen in verschiedenen Zelltypen und genetischen Hintergründen zu untersuchen.

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Protokoll

1. Reporter-Sorte: Kultur und Pflege

HINWEIS: Um die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in den PLM-Neuronen zu messen, verwendeten wir den Wurmstamm, der EBP-2::GFP unter dem Berührungsneuron-spezifischen Promotor mec-4 (juIs338-Allel) 18,25,26exprimiert. Für diesen Stamm verwenden wir Standard-Wurmkultur- und Wartungsmethoden27.

  1. Bereiten Sie das Nematodenwachstumsmedium (3,0 g / L Natriumchlorid, 2,5 g / L Pepton, 20,0 g / L Agar, 10 mg / L Cholesterin (verdünnt aus einer Stammlösung von 10 mg / ml)) in Wasser vor und autoklavieren Sie die Mischung.
  2. Kühlen Sie die Mischung kurz für 10-15 min, bevor Sie sie mit 1 mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumsulfat und 25,0 mM Kaliumphosphat monobasisch pH 6,0 ergänzen.
  3. Gießen Sie etwa 9 ml der Mischung mit einem sterilen Spender in 60 mm Petrischalen, gefolgt von einer Lagerung bei Raumtemperatur und sterilen Bedingungen für einen Tag und anschließender Lagerung bei 4 °C.
  4. 50 ml B-Brühe (5,0 g/L Natriumchlorid, 10,0 g/L Bacto-Trypton), Autoklaven vorbereiten und abkühlen, bevor sie mit einer einzigen Kolonie Escherichia coli (OP50-Stamm) geimpft werden.
  5. Kultur der Bakterien bei 37 °C für 12 Stunden. Bringen Sie die gekühlten NGM-Platten zur Aussaat auf Raumtemperatur und machen Sie mit einem sterilisierten Glasstreuer einen Abstrich von OP50-Bakterien auf die NGM-Platte.
  6. Halten Sie die geimpften NGM-Platten 12 Stunden lang bei 37 °C, wodurch ein Bakterien rasen für die Kultivierung von C. eleganserstellt werden kann. Diese Platten können bis zur Verwendung in einem 20 °C-Inkubator gelagert werden.
  7. Die transgene Belastung wird auf den ausgesäten NGM-Platten aufgezogen.
  8. Sterilisieren Sie einen Platindrahtpick auf Flamme und pflücken Sie 20-25 gravidierte erwachsene Hermaphroditen für den Transfer auf eine frisch gesäte Platte.
  9. Nach dem Transfer die Platte für 1 h in einen 20 °C-Inkubator schalten. Dann extrahieren Sie die Erwachsenen aus diesen Platten. Diese Platten enthalten nun Eier, die altersangepasst sind.
  10. Die Platten werden zur Aufzucht in den 20 °C-Inkubator verschoben, bis sie das interessierende Entwicklungsstadium erreichen, das in diesem Fall das L4-Stadium 43,5 Stunden nach der Eiablage ist. Für mehr Würmer, hintere mehrere Platten, um Eindränge zu vermeiden.
  11. Im gewünschten Entwicklungsstadium können diese Würmer zur Abbildung der EBP-2::GFP-Kometen montiert werden.

2. Probenvorbereitung: Montage von Würmern zur Bildgebung von EBP-2-Kometen

HINWEIS: Um die Live-Beobachtung der EBP-Kometen in den PLM-Neuronen zu ermöglichen, haben wir die Würmer auf Agarose-Pads montiert, um ihre Mobilität zu minimieren und gleichzeitig die Physiologie des Neurons nicht zu beeinträchtigen. Unter den verschiedenen Immobilisierungsmethoden haben wir 0,1 μm Polystyrolperlenlösung ausgewählt, die im Handel erhältlich ist. Wir haben das Montageverfahren beschrieben, das speziell für die EBP-2::GFP-Beobachtung verwendet wird.

  1. Eine Lösung von 10% Agarose wird durch Schmelzen von 0,2 g Agarose in 2 mL 1x M9-Puffer (0,02 M KH2PO4,0,02 MNa2HPO4,0,008 M NaCl, 0,02 MNH4Cl) in einem 5 mL Glasreagenzglas über einer Flamme zubereitet. Dieses Reagenzglas kann leicht in einen Heizblock passen, der die Agarose bis zur Verwendung im geschmolzenen Zustand hält.
  2. Mit einem Breitmaul-Tropfer einen Tropfen (ca. 100 μL) dieser geschmolzenen Agarose über einen sauberen Glasträger von 35 mm x 25 mm Abmessungen dosieren.
  3. Während es sich im geschmolzenen Zustand befindet, drücken Sie den Tropfen mit einem anderen Glasobjektträger, um einen dünnen Film der Agarose zwischen den Glasobjektträgern zu erzeugen. Die Agarose erstarrt als Film von etwa 0,5 - 1,0 mm Dicke in etwa 30 Sekunden.
  4. Sobald die Agarose erstarrt ist, halten Sie den unteren Schlitten in der nicht dominanten Hand und den oberen Schlitten in der dominanten Hand. Klappen Sie die obere Folie nach oben, während Sie die untere Rutsche stabil halten, wodurch das Agarose-Pad an einem der beiden Dias haftet.
  5. Wenn das geformte Agarose-Pad größer als die Coverlip-Größe (18 mm x 18 mm) ist, schneiden Sie die Kanten des Pads ab, um die erforderlichen Abmessungen zu erhalten, um eine ordnungsgemäße Platzierung des Coverslips zu gewährleisten. Diese Agarose-Pads sind für den sofortigen Gebrauch und nicht für die Lagerung.
  6. Untersuchen Sie das Agarose-Pad visuell auf eine glatte Oberfläche, die feucht und für die Montage geeignet ist. Wenn das Agarose-Pad der Luft ausgesetzt wird und getrocknet wird, erscheint die Oberfläche des Agarose-Pads faltig. Bereiten Sie in einem solchen Szenario ein frisches Agarose-Pad vor, wie in den Schritten 2-6 dieses Abschnitts erwähnt.
  7. Auf das Agarosepad werden 2 μL 0,1 μm Polystyrolperlenlösung als Montagemedium gelegt.
  8. Wählen Sie 3-4 Würmer mit einem Platindrahtpickel und verschieben Sie sie auf eine ungesäte NGM-Platte. Dieser Prozess gewährleistet die Entfernung von Oberflächenbakterien, die die Immobilisierung während der Montage behindern.
  9. Sobald die Würmer aus ihren Oberflächenbakterien kriechen, nehmen Sie sie zur Montage mit einem Platindrahtpickel auf und reanimieren Sie sie im Tropfen von Polystyrolperlen auf dem Agarose-Pad.
  10. Legen Sie vorsichtig einen 18 mm x 18 mm abdeckungsartigen Schlupf auf die Würmer. Um das Ausweiden der montierten Würmer zu verhindern, bewegen Sie den Abdeckungsschlupf nach dem Platzieren nicht.
  11. Montieren Sie den vorbereiteten Objektträger zur Bildgebung auf dem Mikroskop.

3. Imaging-Einrichtung und -Erfassung

HINWEIS: EBP-Kometen bewegen sich mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 0,22 μm/s, wie sie in den Säugetier- und PLM-Neuronen von C. elegans16,18beobachtet wurde. Um die Ereignisse in einer Zeitraffererfassung nach Nyquist-Kriterium28optimal abtasten zu können, sind räumliche und zeitliche Skalen von 0,09 μm bzw. 0,43 s erforderlich. Zur Vorbeugung von Phototoxizität oder Photobleaching haben wir die Spinning Disk-Erfassung verwendet. Im Folgenden haben wir unsere Imaging-Einrichtung und Erfassungseinstellungen beschrieben.

  1. Nehmen Sie die Bilder mit einem invertierten Mikroskop auf, das mit einer rotierenden Scheibeneinheit und einer Kamera ausgestattet ist. Schalten Sie das Setup gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
  2. Schalten Sie die Software ein, die das Setup steuert.
  3. Da es sich um ein invertiertes Mikroskop handelt, legen Sie den Objektträger mit den montierten Würmern auf die Bühne mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (5x oder 10x) mit dem Abdeckrlip nach unten.
  4. Richten Sie den Lichtweg zum Auge oder den sichtbaren Modus ein, der die Beleuchtung von Halogenlampen für Durchlicht und Quecksilberbogenlampen für reflektiertes Licht verwendet.
  5. Fokussieren und zentrieren Sie einen Wurm im Sichtfeld unter dem Hellfeld.
  6. Setzen Sie das Tauchöl ein und ändern Sie die Vergrößerung auf 63x (1,4NA / Öl) und fokussieren Sie den Wurmschwanz im Hellfeld für die PLM-Neuronen neu.
  7. Schalten Sie die Fluoreszenz der Quecksilberbogenlampe für eine kurze Neufokussierung der PLM-Neuronen ein. Platzieren Sie den richtigen Satz Reflektor (AF488) in den Lichtpfad für die Visualisierung von GFP.
  8. Stellen Sie das Mikroskop auf die Kameraaufnahme ein, indem Sie den Lichtweg zur Kamera lenken.
    HINWEIS: Die Steuerung der oben genannten Schritte 4-7 über den Dünnschichttransistor (TFT) -Bildschirm des Mikroskops ist schnell und verhindert unnötige Belichtung der Beleuchtung. Alternativ können Sie die Beleuchtung, den Reflektor über die Software steuern.
  9. Nach der Fokussierung des PLM-Neurons im Sichtfeld wählen Sie in der Softwareschnittstelle die Beleuchtung des 488 nm Lasers mit 30% Leistung und 300 ms Belichtung für die Kamera mit Electron Multiplying (EM) Gain-Wert 70. Variieren Sie diese Parameter je nach Ausdruck des Reporters nach Bedarf. Speichern Sie die Einstellungen als Konfiguration für nachfolgende Imaging-Sitzungen.
  10. Auf der Registerkarte Kanäle werden die Tracks mit jeweils einer bestimmten Beleuchtungs- und Kameraeinstellung gespeichert. Die hervorgehobene Spur ermöglicht eine Live-Visualisierung, während für die Aufnahme eines Bildes die Spur angekreuzt werden muss. Markieren Sie einen Kanal mit Hellfeld (DIC) für die Live-Visualisierung des Schwanzes des Wurms im Arbeitsbereich. Das Beispiel wird fokussiert und im Live-Imaging-Fenster des Arbeitsbereichs zentriert.
  11. Markieren Sie den Kanal mit 488 nm Laseranregung für eine schnelle Fokussierung des PLM-Neurons im Live-Imaging-Fenster. Beginnen Sie die Zeitraffererfassung, indem Sie die Zeitreihenparameter wie im nächsten Schritt erwähnt einstellen.
  12. Richten Sie mit 488 nm Laserbeleuchtung ein Experiment mit Zeitreihen für 2 Minuten und ohne Zeitintervall zwischen den Frames ein. Um die zeitlichen Skalen der Bildaufnahme beizubehalten, haben wir nur GFP-Fluoreszenz erfasst.
  13. Beginnen Sie mit der Erfassung auf der Registerkarte Experiment starten. Bei verwendung einer 63-fachen Vergrößerung wird die räumliche Auflösung auf 0,21 μm beschränkt, die von der Kamera mit der Pixelgröße von 0,09 μm abgetastet wird. Erfassen Sie einen Zeitraffer mit 3,3 Frames/s, um das Ereignis optimal zu erfassen. Das Zeitrafferbild hatte 396 Zeitrahmen, die über eine Dauer von 2 Minuten aufgenommen wurden. Speichern Sie das Bild nach der Aufnahme im Standardformat, auf das später mit der Standardsoftware oder ImageJ zugegriffen werden kann.

4. Beobachtung und Analyse

  1. Zeigen Sie eine Vorschau der Zeitraffererfassung in der Standardsoftware an oder öffnen Sie sie in Image J über das Bioformats-Plug-In.
    HINWEIS: Wir haben den Prozess der Bildanalyse in Bild J beschrieben.
  2. Installieren Sie das Bioformats-Plug-In in ImageJ.
    1. Alternativ können Sie die Standardformatdatei in .tif exportieren, um die Dateikompatibilität in ImageJ zu gewährleisten. Exportfunktion in ZEN2 führt zu einzelnen Frames des Bildes als diskrete .tif Dateien. Wir vermeiden diese Methode, um die Bildung einer großen Anzahl von Dateien zu verhindern.
  3. Öffnen Sie das Bild im Format '.czi' direkt in Image J über das Plugin 'Bioformats'. Das Bild wird als Multi-Image-Stack geöffnet. Wenn Sie die Exportfunktion der Standardsoftware verwenden, stellen Sie die Bilder mit dem folgenden Workflow in ImageJ als Multi-Image-Stack wieder dar: ImageJ-Programm > Image-Menü >-Stacks-Untermenü > Images To Stack.
  4. Zeigen Sie eine Vorschau des Bildes als Film an, indem Sie das Wiedergabesymbol in der linken unteren Ecke des Bildfensters verwenden. Die Kometen können als helle mobile Punkten im Zellkörper und in prozessen des PLM-Neurons gesehen werden. Wenn die Kometen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit Schritt 8 fort, andernfalls führen Sie die Schritte 5-7 dieses Abschnitts aus.
  5. Konvertieren Sie das Farbprofil des Bildes mit der Nachschlagetabelle (LUT) in ein Graustufenbild: Programm ImageJ > Menü Bild > Untermenü Nachschlagetabellen > Grautöne auswählen.
  6. LuT-Profil des Bildes zur einfachen Visualisierung umkehren: Programm ImageJ > Menü Bild > Untermenü Nachschlagetabellen > LUT umkehren.
  7. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an, um die Kometen zu sehen: ImageJ-Programm > Menü Bild > Untermenü anpassen > Helligkeit/Kontrast.
    1. Bewegen Sie die Schieberegler Minimum, Maximum, Helligkeit und Kontrast, um die gewünschte Skalierung der Intensitäten im gesamten Bild zu erhalten. Wir quantifizierten die Bilder mit deutlich sichtbaren Kometen.
  8. In der Basisversion von ImageJ werden Startwerkzeuge als Symbole dargestellt. Suchen Sie das Symbol mit einer Linie, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf, um ein Dropdown-Menü zu öffnen, und wählen Sie die Segmentierte Zeileaus. Zeichnen Sie die segmentierte Linie auf die Regionen von Interesse (ROI) mit ihrem Ursprung auf oder in der Nähe des Zellkörpers des Neurons.
    1. Für spätere Überlegungen speichern Sie den roi der segmentierten Linie über den ROI-Manager mit dem folgenden Workflow: ImageJ > Analyze > Tools > ROI Manager > Wählen Sie die gezeichnete Ablaufverfolgung im Bild aus und klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf Hinzufügen > Mehr im ROI-Manager-Fenster > Speichern.
  9. Entfernen Sie vor dem Generieren des Kymographen, da die räumlichen und zeitlichen Skalen unterschiedlich sind, die Skalierung, um die Messungen in Pixeln mit folgenden Mitteln zu erhalten:
    ImageJ > Analysieren > Skalieren > festlegen Klicken Sie hier, um die Skalierung zu entfernen, > OK.
  10. Generieren Sie mit der Funktion Reslice im Dropdown-Menü Image > Stacks einen Kymographen. Der Kymograph ist eine Darstellung des segmentierten ROI in der Zeit. Die horizontale Achse stellt den Abstand und die vertikale Achse die Zeit dar. Die diagonalen Spuren stellen die sich bewegenden Kometen dar. Im Allgemeinen nimmt der Kymograph das Farbprofil des Bildes und weist ansonsten ein Farbprofil zu, wie in den vorherigen Schritten 5-6 für die Visualisierung der diagonalen Spuren beschrieben.
  11. Zeichnen Sie mit der Funktion Gerade Linie im Dropdown-Menü des Linienwerkzeugs (siehe Schritt 9 dieses Abschnitts) gerade Linien über jede der diagonalen Leiterbahnen und hängen Sie sie im ROI-Manager an.
  12. Wechseln Sie auf der Registerkarte Analysieren zu Messungen festlegen und wählen Sie Die Parameter Mittlere Intensität und Grenzendes Rechteck zum Messen der Leiterbahnen aus.
  13. Klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf Messen, um ein Ergebnisfenster zu öffnen, das die mittlere Intensität des ROI, die X- und Y-Koordinaten der Linienspuren, Breite, Höhe, Winkel und Länge der Linienspuren liefert. Dieses Fenster kann als .csv Format gespeichert und später in ein Datenanalyseprogramm importiert werden.
  14. Im Tabellenkalkulationsprogramm öffnet sich das Ergebnisfenster mit den in Zeilen und Spalten verteilten Werten. Die relevanten Werte sind die Breite, Höhe und der Winkel der Leiterbahnen. Die Breite gibt die Verschiebung der Spur an, die Höhe die Dauer und der Winkel den Vektor. Da die Werte für Breite und Höhe in Pixeln vorliegen, multiplizieren Sie sie mit den räumlichen bzw. zeitlichen Skalen, um die messbaren Standardparameter zu erhalten.
  15. Da die linke Seite des Kymographen je nach Winkel proximal zum Zellkörper ist, klassifizieren Sie Kometen in Plus-End-Out oder Minus-End-Out (d.h. weg vom Zellkörper bzw. in Richtung Zellkörper). Klassifizieren Sie Winkel zwischen 1° bis -89° und -91° bis -179° als Plus-End-Out bzw. Minus-End-Out. Sammeln Sie Daten aus mehreren Kymographen in einer Tabelle für eine Studie und stellen Sie sie statistisch dar.

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Ergebnisse

Als repräsentatives Beispiel haben wir die in vivo Beobachtung der EBP-Kometen in den stationären und regenerierenden Axonen der PLM-Neuronen beschrieben. PLM-Neuronen befinden sich im Schwanzbereich des Wurms mit einem langen vorderen Prozess, der eine Synapse und einen kurzen hinteren Prozess bildet. PLM-Neuronen wachsen in vorderer und hinterer Richtung nahe der Epidermis und sind für das sanfte Berührungsgefühl bei den Würmern verantwortlich. Aufgrund ihrer vereinfachten Struktur und ihrer Zugänglichkeit für Bildgebu...

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Diskussion

Das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik war im Laufe der Jahre ein Schwerpunkt auf dem Gebiet der Zytoskelettforschung. Mikrotubuli durchlaufen Keimbildung und Katastrophe zusammen mit einem kontinuierlichen Prozess dynamischer Instabilität44,45,46,47. Viele dieser Informationen wurden durch In-vitro-Assays wie Lichtstreuanzeigen von freiem vs. polymerisiertem Tubul...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Yishi Jin und Andrew Chisholm für die anfängliche Unterstützung und die in der Studie verwendete Sorte. Der Bakterienstamm OP50 wurde kommerziell vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) in Anspruch genommen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde. Wir danken auch Dharmendra Puri für die Standardisierung der experimentellen Verfahren. Die Studie wird durch den Kernzuschuss des National Brain Research Centre (unterstützt vom Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18 / 1 / 504331) an S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13 / 1 / 1 / 500874) an A.G.-R und einen Zuschuss des Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) an A.G.-R.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CZ18975 WurmstammYishi Jin labCZ18975Erzeugt von Anindya Ghosh-Roy
AgaroseSigmaA9539Eindeckschnecken
Deckglas (18 mm x 18 mm)Zeiss474030-9010-000Einhängeschnecken
Trockenbad mit HeizblockNeolabEindeckschnecken
Glasobjektträger (35 mm x 25 mm)Blue StarEinbettschnecken
Polystyrol-Raupenlösung (4,55 x 10^13 Partikel/ml in wässrigem Medium mit minimalem Tensid)Polysciences Inc.00876Eindeckwürmer
ReagenzgläserEinbettwürmer
OP50 BakterienstammCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Wurmhandhabung
60mm PetriplattenPraveen Scientific20440Wurmhandhabung
Aspirator/KapillareVWR53432-921Wurmhandhabung
InkubatorPanasonicMIR554EUmgang mit Schnecken
PlatindrahtUmgang mit Schnecken
Stereomikroskop mit FluoreszenzaufsatzLeicaM165FCWurmbehandlung
0,3 % NatriumchloridSigma71376Nematoden-Wachstumsmedium
0,25 % PeptonTM Media1506Nematoden-Wachstumsmedium
10 mg/ml CholesterinSigmaC8667Nematoden-Wachstumsmedium
1 mM Calciumchlorid-DihydratSigma223506Nematoden-Wachstumsmedium
1 mM Magnesiumsulfat-HeptahydratSigmaM2773Nematoden-Wachstumsmedium
2% AgarTM Medien1202Nematoden-Wachstumsmedium
25 mM Monobasisches KaliumdihydrogenphosphatSigmaP9791Nematoden-Wachstumsmedium
0,1 M Monobasisches KaliumdihydrogenphosphatSigmaP97911X M9 Puffer
0,04 M NatriumchloridSigma713761X M9 Puffer
0,1 M AmmoniumchloridFisher Scientific214051X M9 Puffer
0,2 M Dibasisches Dinatriumhydrogenphosphat-HeptahydratSigmaS93901X M9 Puffer
GlasflaschenBorosilPufferspeicher
488 nm LaserZeissImaging
5X ObjektivZeissImaging
63X ObjektivZeissImaging
KameraPhotometrieEvolve 512 DeltaImaging
Computersystem für Spinning Disk UnitHPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHzImaging
EpifluoreszenzmikroskopZeissObserver.Z1Imaging
HalogenlampeZeissImaging
QuecksilberbogenlampeZeissImaging
Spinning Disk UnitYokogawaCSU-X1Imaging
ZEN2 SoftwareZeissImaging
Image J (Fidschi) Version)Bildanalyse und -verarbeitung
Adobe Creative CloudAdobeBildanalyse und -verarbeitung
Computersystem für BildanalyseDellIntel & reg; Kern & Handel; i7-9700 CPU 3,00 GHzBildverarbeitung/-darstellung

Referenzen

  1. Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
  2. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  3. Tas, R. P., Kapitein, L. C. Exploring cytoskeletal diversity in neurons. Science. 361 (6399), 231-232 (2018).
  4. Kirkpatrick, L. L., Brady, S. T. Molecular Components of the Neuronal Cytoskeleton. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6th edition. , (1999).
  5. Muñoz-Lasso, D. C., Romá-Mateo, C., Pallardó, F. V., Gonzalez-Cabo, P. Much More Than a Scaffold: Cytoskeletal Proteins in Neurological Disorders. Cells. 9 (2), 358(2020).
  6. Menon, S., Gupton, S. L. Building Blocks of Functioning Brain: Cytoskeletal Dynamics in Neuronal Development. International Review of Cell and Molecular Biology. 322, 183-245 (2016).
  7. Lasser, M., Tiber, J., Lowery, L. A. The role of the microtubule cytoskeleton in neurodevelopmental disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 165(2018).
  8. Konietzny, A., Bär, J., Mikhaylova, M. Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 147(2017).
  9. Helfand, B. T., Mendez, M. G., Pugh, J., Delsert, C., Goldman, R. D. A Role for Intermediate Filaments in Determining and Maintaining the Shape of Nerve Cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (12), 5069-5081 (2003).
  10. Lariviere, R. C., Julien, J. P. Functions of Intermediate Filaments in Neuronal Development and Disease. Journal of Neurobiology. 58 (1), 131-148 (2004).
  11. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13, 83-117 (1997).
  12. Nogales, E., Wolf, S. G., Downing, K. H. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391 (6663), 199-203 (1998).
  13. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. Journal of Cell Science. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  14. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R., Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96 (4), 517-527 (1999).
  16. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  17. Rolls, M. M., Satoh, D., Clyne, P. J., Henner, A. L., Uemura, T., Doe, C. Q. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2 (1), 7(2007).
  18. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and Tubulin Posttranslational Modifications Regulate Microtubule Growth in Axon Regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  19. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  20. Tran, L. D., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development (Cambridge). 139 (19), 3644-3652 (2012).
  21. Tirnauer, J. S., Grego, S., Salmon, E. D., Mitchison, T. J. EB1-Microtubule Interactions in Xenopus Egg Extracts: Role of EB1 in Microtubule Stabilization and Mechanisms of Targeting to Microtubules. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3614-3626 (2002).
  22. Maniar, T. A., et al. UNC-33 (CRMP) and ankyrin organize microtubules and localize kinesin to polarize axon-dendrite sorting. Nature Neuroscience. 15 (1), 48-56 (2012).
  23. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global Up-Regulation of Microtubule Dynamics and Polarity Reversal during Regeneration of an Axon from a Dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  24. Puri, D., Ponniah, K., Biswas, K., Basu, A., Lundquist, E. A., Ghosh-Roy, A. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13 Family Microtubule Depolymerizing Factor. SSRN Electronic Journal. , (2019).
  25. CZ18975 (strain). WormBase Nematode Information Resource. , Available from: https://wormbase.org/species/c_elegans/stran/WBStrain00005443#03–10 (2021).
  26. Ghosh-Roy, A., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. Kinesin-13 and tubular post translational modifications regulate microtubule growth in axon regeneration. Developmental Cell. 23 (4), 716-728 (2012).
  27. Chuang, M., Goncharov, A., Wang, S., Oegema, K., Jin, Y., Chisholm, A. D. The microtubule minus-end-binding protein patronin/PTRN-1 is required for axon regeneration in C. elegans. Cell Reports. 9 (3), 874-883 (2014).
  28. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  29. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , Springer. (2006).
  30. Chalfie, M., Thomson, J. N. Organization of neuronal microtubules in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 82 (1), 278-289 (1979).
  31. Murthy, K., Bhat, J. M., Koushika, S. P. In vivo imaging of retrogradely transported synaptic vesicle proteins in Caenorhabditis elegans neurons. Traffic. 12 (1), 89-101 (2011).
  32. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884(2008).
  33. Chen, L., et al. Axon Regeneration Pathways Identified by Systematic Genetic Screening in C. Elegant. Neuron. 71 (6), 1043-1057 (2011).
  34. Ghosh-Roy, A., Chisholm, A. D. Caenorhabditis elegant: A new model organism for studies of axon regeneration. Developmental Dynamics. 239 (5), 1464(2010).
  35. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I. Wnt signals and Frizzled activity orient anterior-posterior axon outgrowth in C. elegans. Developmental Cell. 10 (3), 379-390 (2006).
  36. Prasad, B. C., Clark, S. G. Wnt signaling establishes anteroposterior neuronal polarity and requires retromer in C. Elegant. Development. 133 (9), 1757-1766 (2006).
  37. Puri, D., et al. Wnt signaling establishes the microtubule polarity in neurons through regulation of Kinesin-13. Journal of Cell Biology. 220 (9), (2021).
  38. Chen, C. H., Chen, Y. C., Jiang, H. C., Chen, C. K., Pan, C. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (0), (2013).
  39. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  40. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. Elegant. Optics Express. 15 (14), 8521-8531 (2007).
  41. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., ToliĆ-NØrrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. Journal of Microscopy. 234 (1), 1-8 (2009).
  42. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical Review Letters. 99 (15), (2007).
  43. Steinmeyer, J. D., et al. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature Protocols. 5 (3), 395-407 (2010).
  44. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (57), e3331(2011).
  45. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo laser axotomy in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (51), e2707(2011).
  46. Basu, A., et al. let-7 miRNA controls CED-7 homotypic adhesion and EFF-1-mediated axonal self-fusion to restore touch sensation following injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 10206-10215 (2017).
  47. Horio, T., Murata, T., Murata, T. The role of dynamic instability in microtubule organization. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
  48. Michaels, T. C. T., Feng, S., Liang, H., Mahadevan, L. Mechanics and kinetics of dynamic instability. eLife. 9, 1-29 (2020).
  49. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  50. Aher, A., Akhmanova, A. Tipping microtubule dynamics, one protofilament at a time. Current Opinion in Cell Biology. 50, 86-93 (2018).
  51. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  52. Harterink, M., et al. Local microtubule organization promotes cargo transport in C. elegans dendrites. Journal of Cell Science. 131 (20), 223107(2018).
  53. Yogev, S., Maeder, C. I., Cooper, R., Horowitz, M., Hendricks, A. G., Shen, K. Local inhibition of microtubule dynamics by dynein is required for neuronal cargo distribution. Nature Communications. 8, (2017).
  54. Liang, X., et al. Growth cone-localized microtubule organizing center establishes microtubule orientation in dendrites. eLife. 9, 1-28 (2020).
  55. Yan, J., et al. Kinesin-1 regulates dendrite microtubule polarity in Caenorhabditis elegans. eLife. 2013 (2), 133(2013).
  56. Wang, S., et al. NOCA-1 functions with γ-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans. eLife. 4, (2015).
  57. Castigiioni, V. G., Pires, H. R., Bertolini, R. R., Riga, A., Kerver, J., Boxem, M. Epidermal par-6 and pkc-3 are essential for larval development of C. elegans and organize non-centrosomal microtubules. eLife. 9, 1-37 (2020).
  58. Taffoni, C., et al. Microtubule plus-end dynamics link wound repair to the innate immune response. eLife. 9, (2020).
  59. Motegi, F., Velarde, N. V., Piano, F., Sugimoto, A. Two phases of astral microtubule activity during cytokinesis in C. elegans embryos. Developmental Cell. 10 (4), 509-520 (2006).
  60. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 53419(2013).
  61. Agarose immobilization of C. elegans. , Available from: http://wbg.wormbook.org/2009/12/01/agarose-immobilization-of-c-elegans/ (2021).
  62. Breton, S., Brown, D. Cold-induced microtubule disruption and relocalization of membrane proteins in kidney epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (2), 155-166 (1998).
  63. Weber, K., Pollack, R., Bibring, T. Antibody against tubulin: the specific visualization of cytoplasmic microtubules in tissue culture cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (2), 459-463 (1975).
  64. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  65. Tilney, L. G., Porter, K. R. Studies on the microtubules in heliozoa. II. The effect of low temperature on these structures in the formation and maintenance of the axopodia. The Journal of Cell Biology. 34 (1), 327-343 (1967).
  66. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: Evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  67. Wang, X., et al. In vivo imaging of a PVD neuron in Caenorhabditis elegans. STAR Protocols. 2 (1), 100309(2021).
  68. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  69. Portman, D. S. Profiling C. elegans gene expression with DNA microarrays. WormBook. , 1-11 (2006).

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