Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.
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Methodenartikel
Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In Neuronen war die Mikrotubuliorientierung ein Schlüsselbewerter, um Axone zu identifizieren, die Plus-End-Out-Mikrotubuli und Dendriten haben, die im Allgemeinen eine gemischte Orientierung haben. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern von Mikrotubuli-Spitzen haben wir die axonalen Mikrotubuli abgebildet. Die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonerektomie initiieren, können mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Dieser Assay ist an andere Neuronen und genetische Hintergründe anpassbar, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen zu untersuchen.
Einleitung
Neuronen haben eine ausgeklügelte Architektur mit spezialisierten Kompartimenten wie Dendriten, Zellkörpern, Axonen und Synapsen. Das neuronale Zytoskelett besteht aus den Mikrotubuli, Mikrofilamenten und Neurofilamenten und ihre unterschiedliche Organisation unterstützt die neuronalen Kompartimente strukturell und funktionell1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10
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Protokoll
1. Reporter-Sorte: Kultur und Pflege
HINWEIS: Um die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in den PLM-Neuronen zu messen, verwendeten wir den Wurmstamm, der EBP-2::GFP unter dem Berührungsneuron-spezifischen Promotor mec-4 (juIs338-Allel) 18,25,26exprimiert. Für diesen Stamm verwenden wir Standard-Wurmkultur- und Wartungsmethoden27.
- Bereiten Sie das Nematodenwachstumsmedium (3,0 g / L Natriumchlorid, 2,5 g / L Pepton, 20,0 g / L Agar, 10 mg / L Chol....
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Ergebnisse
Als repräsentatives Beispiel haben wir die in vivo Beobachtung der EBP-Kometen in den stationären und regenerierenden Axonen der PLM-Neuronen beschrieben. PLM-Neuronen befinden sich im Schwanzbereich des Wurms mit einem langen vorderen Prozess, der eine Synapse und einen kurzen hinteren Prozess bildet. PLM-Neuronen wachsen in vorderer und hinterer Richtung nahe der Epidermis und sind für das sanfte Berührungsgefühl bei den Würmern verantwortlich. Aufgrund ihrer vereinfachten Struktur und ihrer Zugänglichkeit für Bildgebu.......
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Diskussion
Das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik war im Laufe der Jahre ein Schwerpunkt auf dem Gebiet der Zytoskelettforschung. Mikrotubuli durchlaufen Keimbildung und Katastrophe zusammen mit einem kontinuierlichen Prozess dynamischer Instabilität44,45,46,47. Viele dieser Informationen wurden durch In-vitro-Assays wie Lichtstreuanzeigen von freiem vs. polymerisiertem Tubul.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Yishi Jin und Andrew Chisholm für die anfängliche Unterstützung und die in der Studie verwendete Sorte. Der Bakterienstamm OP50 wurde kommerziell vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) in Anspruch genommen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde. Wir danken auch Dharmendra Puri für die Standardisierung der experimentellen Verfahren. Die Studie wird durch den Kernzuschuss des National Brain Research Centre (unterstützt vom Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18 / 1 / 504331) an S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermedia....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CZ18975 Wurmstamm | Yishi Jin lab | CZ18975 | Erzeugt von Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | Eindeckschnecken |
| Deckglas (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Einhängeschnecken |
| Trockenbad mit Heizblock | Neolab | Eindeckschnecken | |
| Glasobjektträger (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Einbettschnecken | |
| Polystyrol-Raupenlösung (4,55 x 10^13 Partikel/ml in wässrigem Medium mit minimalem Tensid) | Polysciences Inc. | 00876 | Eindeckwürmer |
| Reagenzgläser | Einbettwürmer | ||
| OP50 Bakterienstamm | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Wurmhandhabung |
| 60mm Petriplatten | Praveen Scientific | 20440 | Wurmhandhabung |
| Aspirator/Kapillare | VWR | 53432-921 | Wurmhandhabung |
| Inkubator | Panasonic | MIR554E | Umgang mit Schnecken |
| Platindraht | Umgang mit Schnecken | ||
| Stereomikroskop mit Fluoreszenzaufsatz | Leica | M165FC | Wurmbehandlung |
| 0,3 % Natriumchlorid | Sigma | 71376 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 0,25 % Pepton | TM Media | 1506 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 10 mg/ml Cholesterin | Sigma | C8667 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 1 mM Calciumchlorid-Dihydrat | Sigma | 223506 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 1 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat | Sigma | M2773 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 2% Agar | TM Medien | 1202 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 25 mM Monobasisches Kaliumdihydrogenphosphat | Sigma | P9791 | Nematoden-Wachstumsmedium |
| 0,1 M Monobasisches Kaliumdihydrogenphosphat | Sigma | P9791 | 1X M9 Puffer |
| 0,04 M Natriumchlorid | Sigma | 71376 | 1X M9 Puffer |
| 0,1 M Ammoniumchlorid | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 Puffer |
| 0,2 M Dibasisches Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydrat | Sigma | S9390 | 1X M9 Puffer |
| Glasflaschen | Borosil | Pufferspeicher | |
| 488 nm Laser | Zeiss | Imaging | |
| 5X Objektiv | Zeiss | Imaging | |
| 63X Objektiv | Zeiss | Imaging | |
| Kamera | Photometrie | Evolve 512 Delta | Imaging |
| Computersystem für Spinning Disk Unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imaging |
| Epifluoreszenzmikroskop | Zeiss | Observer.Z1 | Imaging |
| Halogenlampe | Zeiss | Imaging | |
| Quecksilberbogenlampe | Zeiss | Imaging | |
| Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
| ZEN2 Software | Zeiss | Imaging | |
| Image J (Fidschi) Version) | Bildanalyse und -verarbeitung | ||
| Adobe Creative Cloud | Adobe | Bildanalyse und -verarbeitung | |
| Computersystem für Bildanalyse | Dell | Intel & reg; Kern & Handel; i7-9700 CPU 3,00 GHz | Bildverarbeitung/-darstellung |
Referenzen
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
