Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen

Membranbasierte Lateral Flow Immunochromatographic Strips (ICSs) sind nützliche Werkzeuge für eine kostengünstige und schnelle Erkennung. Die Nitrocellulosemembran als Träger und kolloidales Gold als Marker für schnelldiagnostische Reagenzien der Immunchromatographie sind die am häufigsten verwendete POCT-Methode (Point of Care Testing), und der Testumfang des Projekts ist breiter. Von ihrer ursprünglichen Anwendung bei der Überwachung während der Schwangerschaft wurde ihre Verwendung erweitert, um Blutgerinnungszustand^1,2, Myokardverletzung³, Veterinärmedizin⁴, Pestizidrückstände⁵, Infektionskrankheiten⁶ und Arzneimittelkonzentrationen zu überwachen. Weitere Arten von Proben können beurteilt werden, einschließlich Urin, Speichel, Vollblut, Serum und andere Körperflüssigkeiten^7,8,9.

In den letzten Jahren wurden zahlreiche neuartige Assays zum Nachweis von Biomarkern bei der Diagnose von Erkrankungen entwickelt, darunter HPLC, UPLC, LC-MS und ELISA, die sensibel und genau, glaubwürdig und spezifisch sind. Diese Methoden erfordern jedoch eine ausgeklügelte Instrumentierung, eine komplexe Vorverarbeitung und zeitaufwändige Behandlungen⁹. Daher ist die Entwicklung einer schnelleren und bequemeren Point-of-Care-Diagnosestrategie für den Selbst- und Echtzeitnachweis von medizinischen Wirkstoffen dringend^10,11.

Die Popularität von ICS, insbesondere für gängige Tests, wird durch ihre Benutzerfreundlichkeit angetrieben, da sie keine Profis oder aufwendige instrumentenaufwändige Setups erfordern¹². Mit anderen Worten, Menschen, die keine spezielle Ausbildung haben, können Streifen oder Selbsttests^{bedienen 13}. Die Ergebnisse des Tests können in 5 Minuten erhalten werden, was bedeutet, dass es für Standortinspektionen verwendet werden kann¹⁴. Darüber hinaus könnten nach unseren Berechnungen die Kosten für Streifen niedriger als 1 RMB¹⁵sein, was bedeutet, dass die Tests kostengünstig sind, um¹⁶zu fördern. Daher ist das ICS ein relativ genaues, einfaches und kostengünstiges Einweggerät. ICSs auf Basis von kolloidalem Gold^17,18 werden auch bei der schnellen COVID-19-Erkennung eingesetzt.

Das Prinzip des ICS kann in Sandwich-ICS und wettbewerbsfähige ICS unterteilt werden. Abbildung 1A ist ein schematisches Diagramm des Sandwich-ICS, das hauptsächlich zum Nachweis makromolekularer Substanzen wie Proteine, einschließlich Tumormarker, Entzündungsfaktoren und humanes Chorion-Gonadotropin (HCG, Early Pregnancy Antigen) verwendet wird. Bei dieser Methode werden gepaarte Antikörper verwendet, die auf verschiedene Epitope des Antigens abzielen, und der Capture-Antikörper wird auf der NC-Membran als Testlinie getrocknet. Markierte Antikörper werden auf dem Konjugatpad getrocknet, und sekundäre Antikörper werden als Kontrolllinie verwendet.

Abbildung 1B ist ein schematisches Diagramm des kompetitiven ICS, das hauptsächlich zum Nachweis niedermolekularer Substanzen verwendet wird (MWCO < 2000 Da). Das Beschichtungsantigen wird als Testlinie auf der NC-Membran fixiert und der markierte Antikörper auf dem Konjugatpad getrocknet. Während des Nachweises fließen die Probe und der markierte Antikörper unter Kapillarwirkung durch die Nachweislinie, und das beschichtete Antigen bindet kompetitiv freies Antigen in der Probe und entwickelt eine rote Farbe auf der Nachweislinie.

Kürzlich haben wir das Verfahren der monoklonalen Antikörperbildung gegen Naturprodukte beschrieben¹⁹. In dieser Arbeit entwickelten wir einen neuartigen Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis des vorbereiteten Anti-SSD mA²⁰ für eine schnelle Vor-Ort-Erkennung. Die Ergebnisse zeigen, dass der Immunchromatographie-Assay ein unverzichtbares und bequemes Werkzeug zum Nachweis von aus Naturprodukten gewonnenen Verbindungen ist.

Abbildung 1 Schematische Darstellung des Immunchromatographie-Assays (A) Sandwich-immunchromatographische Teststreifen. (B) Indirekte kompetitive immunchromatographische Teststreifen. Diese Zahl wurde modifiziert von Zhang et al.,2018²¹. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom Ethics Review Committee der Beijing University of Chinese Medicine genehmigt (Zulassungsnummer 2017BZYYL00120).

1. Herstellung und Charakterisierung von kolloidalem Gold

HINWEIS: Da kolloidales Gold leicht an der Innenwand des Gefäßes adsorbiert wird und anfällig für Ausfällung durch Verunreinigungen ist, sollte das Gefäß für die Synthese und Lagerung von kolloidalem Gold gründlich gereinigt und in Säure getränkt werden (40 ml destilliertes Wasser, 360 ml konzentrierte Schwefelsäure, 20 g Kaliumdichromat) oder einer Oberflächenpassivierungsbehandlung unterzogen werden. Eine Zitronensäurereduktionsmethode wurde verwendet, um kolloidales Gold zu synthetisieren.

1. Schalten Sie den Magnetrührer ein und legen Sie den Kolben (250 ml) auf den Mischer.
2. Bereiten Sie 4% ige Goldchloridsäurelösung bzw. 1% ige Natriumcitratlösung vor.
3. 120 ml destilliertes Wasser in einen runden Bodenkolben geben und auf einem thermostatischen Magnetrührer zum Kochen erhitzen.
4. Kochen Sie weiter und fügen Sie schnell 0,5 ml 4% Chloraurinsäure und 5 ml 1% Natriumcitrat hinzu.
5. Beobachten Sie die Farbe der Lösung. Die blassgelbe Chloraurinsäurelösung färbt Wein innerhalb weniger Minuten rot.
6. 10 Minuten weiter erhitzen, bis die Lösung von farblosem zu transparentem Weinrot wechselt.
7. Schalten Sie den thermostatischen Magnetmischer aus, kühlen Sie ihn auf Raumtemperatur ab und bewegen Sie die Mischung in eine saubere Flasche. Bei 4 °C lagern.
8. Bestimmen Sie die Größe und Morphologie der AuNPs durch Ultraviolettspektroskopie und TEM-Bildgebung.
   HINWEIS: Unterschiedliche Größen von kolloidalen Goldpartikeln für verschiedene Anwendungen können durch Änderung des Anteils von Citratnatrium und Chlorauursäure erhalten werden.

2. Synthese des AuNPs-mAb-Konjugats

HINWEIS: Da Antikörper durch elektrostatische Adsorption an kolloidales Gold binden, beeinflussen Ladungen auf der Oberfläche von Proteinen und kolloidalem Gold direkt die Bindungsintensität; Daher ist der Puffer-pH-Wert ein wichtiger Faktor, der die Stabilität des Antikörper-kolloidalen Goldkonjugats beeinflusst. SSD und Anti-SSD mAbs werden als Beispiele in diesem Protokoll verwendet.

1. Bewertung des Kopplungs-pH-Werts
   1. 100 μL NaCl-Lösung (10% m/v) werden in acht Röhrchen geben.
   2. Stellen Sie die AuNP-Lösungen bei pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 mit 0,1 M_K2CO₃ein.
   3. 100 μL kolloidale Goldlösung (pH-eingestellt 5-12) werden in acht Röhrchen mit NaCl gegeben.
   4. Lassen Sie die Lösungen nach dem Mischen einige Minuten stehen. Beobachten Sie die Farbänderung jeder Röhrchenlösung und notieren Sie die Röhrchen, die rot bleibt.
   5. Wählen Sie den pH-Wert mit der geringsten Zugabe von_K2CO₃ und stabiler Lösungsfarbe als optimalen pH-Wert für die Herstellung von AuNP-mAb-Konjugaten.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein pH-Messgerät, da die Sonde durch AuNPs zerstört werden kann.
2. Bewertung der Antikörpermenge
   1. 100 μL NaCl-Lösung (10% m/v) in acht Röhrchen geben.
   2. Fügen Sie 100 μL kolloidale Goldlösung mit optimalem pH-Wert in jedes Röhrchen hinzu.
   3. Die monoklonalen Antikörperlösungen (Proteinkonzentration 0,1 mg/ml-3,2 mg/ml) werden in die oben genannten acht Röhrchen geben.
   4. Lassen Sie die Lösungen nach dem Mischen einige Minuten stehen. Beobachten Sie die Farbänderung jeder Röhrchenlösung und notieren Sie die Röhrchen, die rot bleibt.
   5. Wählen Sie die Antikörpermenge mit der niedrigsten Konzentration an mAb und stabiler Lösungsfarbe als optimale mAb-Menge für die Herstellung von AuNP-mAb-Konjugaten.
3. Bereiten Sie den Resuspensionspuffer vor: Fügen Sie 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 und 1% (v/v) PEG 20000 hinzu und mischen Sie gut.
4. Synthese des AuNP-mAb-Konjugats
   1. Nehmen Sie 10 ml kolloidale Goldlösung und verwenden Sie 0,1 M_K2CO_3, um die Lösung auf den optimalen pH-Wert einzustellen.
   2. Fügen Sie ssd mAbs langsam in geeigneten Konzentrationen hinzu und schütteln Sie sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
   3. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 83 x g (1.000 U/min) für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Niederschlag, der Verunreinigungen oder gefälltes kolloidales Gold enthält.
   4. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 8.330 x g (10.000 U/min) für 30 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand, und der Niederschlag ist das kolloidale Gold-mAb-Konjugat.
   5. Fügen Sie den Resuspensionspuffer hinzu, um den Niederschlag zu dissoziieren.

3. Montage des Streifens

HINWEIS: Bei späteren Flow-Immunoassays wirkt sich die Auswahl und Vorbehandlung des Membranmaterials direkt auf den Test aus, der untersucht werden sollte. Der immunchromatographische Streifen besteht aus einem Probenpad, einem Konjugatpad, einer Nitrocellulosemembran (NC), einem absorbierenden Pad und einer PVC-Platte (Abbildung 1). Das Membranmaterial sollte durch Stereomikroskopie überprüft und bewertet werden, um Inhomogenität zu beseitigen.

1. Fügen Sie die NC-Membran auf eine PVC-Platte ein, die 2 cm vom Rand des Saugendes der Platte entfernt ist.
2. SSD-BSA (2 mg/ml) tropfenweise auf die NC-Membran (2 cm vom oberen Rand entfernt) als Testlinie (1 mm breit) geben und Ziegen-Anti-Maus-IgG (1,5 mg/ml) tropfenweise auf der NC-Membran (2 cm vom unteren Rand entfernt) als Steuerleitung (1 mm breit) hinzufügen. Kontrollieren Sie die Menge des hinzugefügten Proteins.
3. Befestigen Sie das saugfähige Pad an der PVC-Platte über der NC-Membran und überlappen Sie es mit der NC-Membran um 2 mm.
4. Tauchen Sie die Glasfasermembran in die AuNPs-mAb-Konjugatlösung. Trocknen Sie die nasse Membran in einem Inkubator bei 37 °C.
5. Schneiden Sie die Glasfasermembran auf 5 cm lang und 2 cm breit und verwenden Sie sie als Konjugatpad.
6. Fügen Sie das vorbehandelte Konjugatpad unter die NC-Membran ein. Die Länge der Überlappung mit der NC-Membran sollte 0,1 cm beträgen.
   HINWEIS: Die Glasfasermembran hat eine starke Fähigkeit, Proteine zu binden und freizusetzen.
7. Schneiden Sie die Fusion 3-Membran auf 1,8 cm Länge und 3,5 cm Breite und verwenden Sie sie als Probenpad.
8. Fügen Sie das Probenpad auf die PVC-Platte ein und überlappen Sie es mit dem konjugierten Pad um 2 mm.
9. Schneiden Sie den bestückten Karton mit einer Schneidemaschine in 3,5 mm breite Streifen und verdichten Sie ihn mit einem Chargenkaschierungssystem.
10. Legen Sie die Teststreifen schließlich in die Schale, verschließen Sie sie in einem Aluminiumfolienbeutel, der Trockenmittel enthält, und lagern Sie sie lichtgefäss. Die IKS sind nun montiert.
    HINWEIS: Das obige ist das Laborverfahren. In der Produktion werden Goldsprühgeräte und Kreuzmembraninstrumente verwendet, um Gold zu versprühen und die T- und C-Linien herzustellen.

4. Quantitative Detektion

1. Geben Sie 50 μL Probenlösung auf das Probenloch, um den Chromatographieprozess zu beobachten.
   HINWEIS: Infolge der Kapillarwirkung, die vom absorbierenden Pad angetrieben wird, wandert die Probenlösung zum anderen Ende des Streifens. Wenn die Probenlösung das konjugierte Pad erreicht, reagiert die SSD (Antigen) in der Probe mit dem auf dem Pad vorinstallierten AuNPs-mAb. Wenn die Lösung migriert und die T-Linie erreicht, kann der AuNPs-mAb ohne SSD selektiv von SSD-BSA (Antigen-Carrier-Protein-Konjugat) erfasst werden, was sich als rote Farbe auf der T-Linie zeigt. Dann wandert die Lösung zur C-Linie, wo die AuNPs-mAb von Ziegen-Anti-Maus-IgG in der Region erfasst werden und so als rote Farbe auf der C-Linie angezeigt werden.
2. Analysieren Sie die Streifen mit einem tragbaren Streifenleser. Die Maschine kann das Verhältnis der Prüflinie zur Steuerleitung (T/C) bereitstellen.
3. Bewerten Sie die Spezifität, Sensitivität, Wiederholbarkeit und Stabilität des ICS-Tests.
   HINWEIS: Bei qualitativer Erkennung zeigt eine rote Linie ein positives Ergebnis an (Kontrolllinie). Zwei rote Linien zeigen ein negatives Ergebnis an (Test- und Kontrolllinien). Wenn die Steuerleitung nicht vorhanden ist, wird der Test als ungültig betrachtet.

Charakterisierung von kolloidalem Gold
Die vorbereiteten kolloidalen Goldlösungen waren claretrot. TEM-Analysen wurden verwendet, um die Morphologie und Form von AuNPs zu bestimmen (Abbildung 2A-D). Abbildung 2A und Abbildung 2B zeigen, dass die Partikel polyedrisch geformt und gleichmäßig verteilt sind. Der durchschnittliche Durchmesser von AuNPs betrug etwa 14 nm (Abbildung 2C). Ein hochauflösendes TEM-Bild (HRTEM) von AuNPs ist in Abbildung 2D und Abbildung 2E dargestellt. Das HRTEM-Bild eines einzelnen AuNP zeigt ein durchgehendes Streifenmuster mit einem Abstand von 0,117 nm. Die UV-Vis-Absorptionsspitzen der fünf kolloidalen Goldlösungen lagen bei 518 nm, 521 nm, 524 nm, 534 nm und 540 nm, was zeigte, dass die Partikelgröße mit abnehmendem Natriumcitrat leicht zunahm (Abbildung 2F).

Abbildung 2 Charakterisierung von kolloidalem Gold. (A) TEM-Bild von AuNPs (100.000× Vergrößerung). (B) TEM-Bild von AuNPs (500.000× Vergrößerung). (C) Die Größenverteilung der AuNPs. Wie im TEM-Bild zu sehen ist, lagen die Durchmesser der AuNPs zwischen 10 nm und 18 nm, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 14 nm. (D, E) Hochauflösendes TEM (HRTEM) Bild von AuNPs. Das HRTEM-Bild eines einzelnen AuNP zeigt ein durchgehendes Streifenmuster mit einem Abstand von 0,117 nm. (F) UV-vis Absorptionsspektren verschiedener AuNPs im Bereich von 10 nm bis 18 nm. Diese Zahl wurde modifiziert von Zhang et al.,201821. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bewertung der Messstäbe
Empfindlichkeit des IKS
Um die Empfindlichkeit von ICS zu bestimmen, wurden immunchromatographische Streifen verwendet, um eine Vielzahl verschiedener Konzentrationen von SSD-Standardproben (150.000, 60.000, 12.000, 2400, 480 und 96 ng/ml) zu detektieren(Abbildung 3A). Als Kontrolle wurde doppelt destilliertes Wasser verwendet. Im quantitativen Experiment wurden die Streifen von einem tragbaren ICS-Lesegerät JY1502GS gescannt (Abbildung 3B-C). Die lineare Regressionsgleichung war y = −0,113ln(x) + 1,5451, mit einem Korrelationskoeffizienten (R2) von 0,983 (Abbildung 3D). Es zeigte eine gute Linearität bei 96 ng/ml bis 150 μg/ml. Der IC50-Wert betrug 10,39 μg/ml. Im quantitativen Experiment wurde die optimale Testzeit auf 10 min vorgeschlagen.

Abbildung 3 Charakterisierung des Lateral-Flow-Immunoassays für SSD. (A) Fotos der Ergebnisse für Standardlösungen, die unterschiedliche Konzentrationen von SSD enthalten, die mit dem ICS untersucht wurden. (B) Foto des übereinstimmenden kolloidalen Goldscans. (C) Die Intensitätsmuster der Test- und Kontrolllinien, die vom kolloidalen Gold-Quantitative-Instrument gescannt wurden. (D) Standardkurve von icELISA zur SSD-Bestimmung mit dem ICS. Die Regressionsgleichung ist y = −0,113ln(x) + 1,5451, mit einem Korrelationskoeffizienten(R2)von 0,983. Diese Zahl wurde modifiziert von Zhang et al.,201821. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Spezifität des IKS
Die Spezifität des ICS wurde durch die Bewertung der Kreuzreaktivität mit SSD-ähnlichen Verbindungen getestet. Tabelle 1 zeigt die Kreuzreaktivität von ICS mit SSD-bezogenen Verbindungen. Es ist deutlich zu erkennen, dass das ICS nur eine geringe Kreuzreaktivität mit SSa und keine Kreuzreaktion mit anderen Verbindungen, einschließlich SSc, SSb1 oder SSb2, aufwies(Tabelle 1),was darauf hindeutet, dass das hergestellte ICS eine hohe Spezifität aufwies.

Tabelle 1. Kreuzreaktivität von Verbindungen, gemessen mit ICS und icELISA.  Die Spezifität des IKS wurde von ICS (a) und icELISA (b) bewertet. Diese Tabelle wurde modifiziert von Zhang et al.,201821.

Rückgewinnungsrate
Wie aus Tabelle 2geht, betrug die durchschnittliche Wiederfindungsrate 102,05 % (mittlerer ± SD, n = 3). Aufgrund seiner Genauigkeit und Konsistenz war dieser Assay ausreichend zuverlässig für die Bestimmung von SSD in biologischen Proben.

Tabelle 2. Wiederherstellungsrate von SSD.   Daten sind die mittlere ± SD aus dreifachen Proben bei jeder Spitzenkonzentration von SSD. Der Prozentsatz der Rückgewinnung wurde wie folgt berechnet: Rückgewinnung (%) = gemessener Betrag/Betrag × 100%. Diese Tabelle wurde modifiziert von Zhang et al.,201821.

Stabilitätsanalyse des ICS-Assays
Um die Stabilität des ICS zu bewerten, wurden die für 8 und 16 Wochen gelagerten Teststreifen getestet und mit den neu präparierten Streifen verglichen. Tabelle 3 zeigt, dass die Ergebnisse der gelagerten und neu vorbereiteten Streifen für die negativen und positiven Proben im Wesentlichen unverändert blieben, was darauf hindeutet, dass das ICS mindestens mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden kann und dass es für die großflächige Förderung und Anwendung geeignet ist.

Tabelle 3. Variationen zwischen ICS, die für die Analyse von SSD verwendet werden.   aDie Werte geben Abweichungskoeffizienten für dreifache Proben auf 3 verschiedenen Streifen an, die 1 Tag nach der Herstellung verwendet werden. b Die Werte geben Varianzkoeffizienten für dreifache Proben auf 3 verschiedenen Streifen an, die nach 4-wöchiger Lagerung verwendet werden. c Die Werte geben Varianzkoeffizienten für dreifache Proben auf 3 verschiedenen Streifen an, die nach 8-wöchiger Lagerung verwendet werden. Diese Tabelle wurde modifiziert von Zhang et al.,201821.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.