Eine skalierbare Methode zur Untersuchung des neuronalen Überlebens in primären neuronalen Kulturen mit Einzelzell- und Echtzeitauflösung

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine einfache, leistungsfähige und vielseitige Methode vor, um das neuronale Überleben bei zytotoxischem Stress in primären kortikalen Neuronen mit zellulärer Auflösung in Echtzeit oder in fixiertem Material zu untersuchen.

Zusammenfassung

Der Verlust von Neuronen ist der Kern vieler Neuropathologien, darunter Schlaganfall, Alzheimer und Parkinson. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um den Prozess des neuronalen Überlebens bei zytotoxischem Stress zu untersuchen. Die meisten Methoden basieren auf biochemischen Ansätzen, die keine Einzelzellauflösung zulassen oder komplexe und kostspielige Methoden erfordern. Hier wird ein vielseitiges, kostengünstiges und effektives experimentelles Paradigma zur Untersuchung des neuronalen Überlebens vorgestellt. Diese Methode nutzt die Vorteile der spärlichen Fluoreszenzmarkierung der Neuronen, gefolgt von Live-Bildgebung und automatisierter Quantifizierung. Zu diesem Zweck werden die Neuronen elektroporiert, um fluoreszierende Marker zu exprimieren, und mit nicht-elektroporierten Neuronen co-kultiviert, um die Zelldichte leicht zu regulieren und das Überleben zu erhöhen.

Die spärliche Markierung durch Elektroporation ermöglicht eine einfache und robuste automatisierte Quantifizierung. Darüber hinaus kann die Fluoreszenzmarkierung mit der Co-Expression eines Gens von Interesse kombiniert werden, um spezifische molekulare Signalwege zu untersuchen. Hier stellen wir ein Modell des Schlaganfalls als neurotoxisches Modell vor, nämlich den Sauerstoff-Glukose-Deprivations-Assay (OGD), der in einer erschwinglichen und robusten selbstgebauten hypoxischen Kammer durchgeführt wurde. Abschließend werden zwei unterschiedliche Arbeitsabläufe unter Verwendung des IN Cell Analyzer 2200 oder des Open-Source-Tools ImageJ zur Bildanalyse für die halbautomatische Datenverarbeitung beschrieben. Dieser Arbeitsablauf kann leicht an verschiedene experimentelle Toxizitätsmodelle angepasst und für das Hochdurchsatz-Screening hochskaliert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene Protokoll ein zugängliches, erschwingliches und effektives In-vitro-Modell der Neurotoxizität bietet, das geeignet sein kann, die Rolle spezifischer Gene und Signalwege in der Live-Bildgebung und für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening zu testen.

Einleitung

Die Erforschung neuronaler Störungen erfordert experimentelle Modelle, die sich für genetische, molekulare und zelluläre Analysen eignen. Primäre kortikale Neuronen sind ein sehr leistungsfähiges Modell für die Untersuchung des neuronalen Überlebens und der Toxizität 1,2,3,4. Unter den entsprechenden Bedingungen entwickeln primäre Neuronen nach und nach synaptische Kontakte und weisen Merkmale reifer Neuronen auf. Daher ist dieses Modell bei der Modellierung der Physiologie der Neuronen zuverlässiger als immortalisierte Zelllinien und anfälliger für Manipulationen als Tiermodelle. Im Vergleich zu Zelllinien sind primäre kortikale Neuronen jedoch schwer zu transfizieren und relativ fragil. Darüber hinaus kann die komplizierte Morphologie kortikaler Neuronen die Bildgebung und Analyse in Kulturen mit hoher Dichte erschweren. Umgekehrt sind primäre neuronale Kulturen mit geringer Dichte leichter zu analysieren, aber tendenziell fragiler.

Unter Berücksichtigung all dessen stellt diese Arbeit einen erschwinglichen, vielseitigen und skalierbaren In-vitro-Workflow vor, um das neuronale Überleben zu modellieren und zu untersuchen (Abbildung 1). Die wichtigsten Punkte dieses Protokolls sind: i) die Methode der In-vitro-Elektroporation der Neuronen mit einem Fluoreszenzmarker, um eine spärliche Markierung und Bildgebung lebender Zellen zu ermöglichen; ii) seine Vielseitigkeit in verschiedenen Modellen der Zytotoxizität; und iii) die halbautomatische oder automatisierte Analyse.

Das Elektroporationssystem (siehe Materialtabelle) bietet ein offenes und kostengünstiges Verfahren, das keine Kits und spezifischen Lösungen erfordert ^4,5,6. Darüber hinaus kann diese Methode leicht angepasst werden, um eine optimale Transformationseffizienz und -dichte von transfizierten Neuronen zu erhalten, indem elektroporierte mit nicht-elektroporierten Zellen gemischt werden. Die Co-Kultur mit naiven (nicht-elektroporierten) Neuronen verbessert die Lebensfähigkeit der elektroporierten Zellen im Vergleich zu Kulturen mit niedriger Dichte erheblich. Darüber hinaus ermöglicht es eine spärliche Markierung mit einer einstellbaren Dichte der elektroporierten Neuronen, wodurch ein gleichbleibendes Niveau der Genexpression aufrechterhalten wird. Es ist wichtig, 3-5% der elektroporierten Neuronen in Überlebensassays anzustreben.

Die spärliche Markierung erleichtert im Wesentlichen die Automatisierung der Bildanalyse, da die Zellen gut getrennt und leicht unterscheidbar sind. Insbesondere kann dieses experimentelle Paradigma angepasst werden, um mehrere Gene von Interesse zu testen, indem gleichzeitig Neuronen co-kultiviert werden, die mit verschiedenen zytosolischen Fluoreszenzmarkern (z. B. cyan fluoreszierendes Protein, rot fluoreszierendes Protein (RFP), grün fluoreszierendes Protein (GFP)) in derselben Vertiefung co-elektroporiert sind. Ähnlich wie andere Zytotoxizitätsassays (z. B. Propidiumiodid oder Laktatdehydrogenase) basiert der hierin beschriebene Assay auf der Tatsache, dass der neuronale Tod mit einem Bruch der Zellmembran einhergeht. Dies provoziert die Freisetzung zytosolischer Proteine durch Diffusion und damit den Verlust der GFP-Fluoreszenz.

Als Beispiel für Neurotoxizität wird ein In-vitro-Modell des Schlaganfalls, nämlich das OGD-Modell, vorgestellt ^7,8,9. Bei diesem Protokoll werden die primären Neuronen einem Salzpuffer ausgesetzt, der einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit ähnelt, aber ohne Sauerstoff und Glukose ist. Obwohl dieses Modell als Beispiel für neurotoxischen Stress vorgestellt wurde, können verschiedene zytotoxische Zustände mit demselben Arbeitsablauf getestet werden ^8,9. Schließlich ermöglicht die dünnbesetzte Markierung auf einfache Weise die Entwicklung einer automatisierten bildgebenden Analyse. Hier wurde ein Protokoll etabliert, das auf der Standard-Immunfluoreszenz- und ImageJ-Analyse in einem kleineren Aufbau basiert. Als nächstes wurde dieser Workflow angepasst und mit einem Zellbildgebungssystem skaliert, das eine automatisierte Analyse in der Live-Bildgebung im Mittel- und Hochdurchsatzmodus ermöglicht. Zusammenfassend stellt diese Arbeit eine flexible, erschwingliche und skalierbare Methodik vor, um das Überleben von Neuronen in verschiedenen experimentellen Toxizitätsmodellen unter Verwendung von Live-Bildgebung und automatisierter Quantifizierung zu untersuchen.

Protokoll

Alle Eingriffe mit Tieren sollten von der bioethischen Tierkommission des Instituts überwacht und in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften durchgeführt werden. Die hier vorgestellten Verfahren wurden von der beauftragten Behörde genehmigt und entsprechen den Vorschriften in Spanien und Europa.

1. Primäre neuronale Kultur

HINWEIS: Alle Schritte werden in der Kulturhaube unter Verwendung steriler Materialien und Lösungen durchgeführt, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.

1. Poly-L-Lysin (PLL)-Beschichtung
   1. Waschen Sie die Deckgläser (CVs, 15 mm) in 70%igem Ethanol über Nacht (o/n) in einem Orbitalschüttler.
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit des Orbitalschüttlers sollte ausreichen, um den CV sanft, aber nicht zu schnell zu bewegen, um eine Beschädigung oder Kratzer der CVs zu vermeiden. Die spezifische Drehzahl variiert je nach Modell des Schüttlers. CVs können über lange Zeiträume (Monate) in Ethanol gelagert werden.
   2. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie es zweimal für jeweils 10 Minuten mit entionisiertem Wasser.
   3. Lassen Sie die CVs bei Raumtemperatur (RT) in einer 100-mm-Petrischale (ca. 13 CVs/Platte) trocknen. Stellen Sie sicher, dass die CVs sich nicht gegenseitig oder die Kanten der Platte berühren.
      HINWEIS: Trockene Lebensläufe können über längere Zeiträume (Monate) bei RT gelagert werden.
   4. Bereiten Sie die 5 mg/ml-PLL-Stammlösung in Wasser vor, stellen Sie Aliquote her und lagern Sie sie bei -20 °C. Verdünnen Sie die Stammlösung in 1x PBS auf eine Arbeitskonzentration von 0,1 mg/ml.
      HINWEIS: Höhere Konzentrationen von bis zu 1 mg/ml PLL können getestet werden.
   5. Fügen Sie das minimale PLL-Volumen hinzu, um die Oberfläche der CVs abzudecken (siehe optimale PLL-Volumina in Tabelle 1). Geben Sie die PLL-Lösung tropfenweise hinzu, um die Bildung eines Tröpfchens zu erleichtern.
      HINWEIS: Für die Immunfluoreszenz ist eine Beschichtung von Neuronen auf CVs erforderlich. Bei der Zeitraffer-Bildgebung (z. B. für die IN-Zelle) werden die Zellen ohne CVs direkt über dem Well plattiert, da sich die CVs während des Zeitraffers bewegen können. Fügen Sie in diesem Fall das minimale PLL-Volumen hinzu, um die Oberfläche jeder Vertiefung zu bedecken.

Oberfläche	PLL-Volumen (ml)
Deckgläser 15 mm	0.2
Deckgläser 13 mm	0.18
96-Well-Platte	0.07
24-Well-Platte	0.3
6-Well-Platte	2
60 mm Platte	4.5

Tabelle 1: Optimale Volumina von Poly-L-Lysin in Abhängigkeit von der Oberfläche.

6. Mindestens 1 h bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann bis zu o/n betragen.
7. Entfernen Sie die PLL von den CVs. Waschen Sie die CVs zweimal 10 Minuten lang mit entionisiertem Wasser. Lassen Sie die CVs bei RT trocknen.
   HINWEIS: Die PLL-Lösung kann zur Wiederverwendung bei 4 °C gelagert werden (maximal 3-mal).
8. Lagern Sie die getrockneten CVs in einer Petrischale bei 4 °C (bis zu 7-10 Tage) oder legen Sie sie in die Vertiefungen mit Plattiermedium (siehe Zusammensetzung in Tabelle 2 und Arbeitsvolumen in Tabelle 3). Geben Sie das Beschichtungsmedium direkt in die Vertiefungen der 12-Well-Platten (Tabelle 3).
   HINWEIS: Neuronen reagieren sehr empfindlich auf die Qualität des fötalen Rinderserums (FBS). Es sollten verschiedene Chargen von FBS getestet werden, um die Charge zu identifizieren, in der die Zellen gesünder aussehen. Sobald eine gute Charge FBS identifiziert ist, wird empfohlen, eine große Menge zu besorgen und bei -80 °C zu lagern. Dieses Protokoll könnte für andere Arten von CVs und Platten angepasst werden (siehe die verschiedenen Arbeitsvolumina in Tabelle 3).

Beschichtung Mittel
MEM		42.5	Ml
10% Pferdeserum oder FBS*		5	Ml
30% Glukose (0,6% Endkonzentration)		1	Ml
PS (Penicillin, 10000 U/ml; Streptomycin, 10 mg/ml);		0.5	Ml
Elektroporationsmedium
Opti-MEM
Neuronales Medium
Neurobasales Medium		48.5	Ml
B-27		1	Ml
Glutamax 200 mM		0.125	Ml
PS (Penicillin, 10000 U/ml; Streptomycin, 10 mg/ml);		0.5	Ml
OGD Medium (Tasca, et al. 2014)
CaCl2		1	Mm
Kcl		5	Mm
NaCl		137	Mm
KH2PO4		0.4	Mm
Na2HPO4		0.3	Mm
MgCl2		0.5	Mm
MgSO4		0.4	Mm
HEPES		25	Mm
NaHCO3		4	Mm

Tabelle 2: Zusammensetzung der verschiedenen verwendeten Medien.

Oberfläche von Vertiefungen und Platten			Arbeitsvolumen
96-Well-Platte	0.32	cm2	0.1	Ml
24-Well-Platte	1.9	cm2	0.5	Ml
12-Well-Platte	3.8	cm2	1	Ml
6-Well-Platte	9.5	cm2	2.5	Ml
60 mm Platte	21.5	cm2	6	Ml

Tabelle 3: Oberfläche der verschiedenen Plattentypen und Arbeitsvolumen.

2. Vorbereitung der neuronalen Kultur
   1. Das Beschichtungsmedium, das neuronale Medium und das Elektroporationsmedium (siehe Zusammensetzung in Tabelle 2) in einer teilweise geöffneten Flasche im Zellinkubator für mindestens 2 Stunden vorwärmen (37 °C) und äquilibrieren (in einer 5 % CO₂ -Atmosphäre). Lassen Sie das Trypsin bei RT erwärmen und erwärmen Sie die 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) bei 37 °C im Wasserbad.
   2. Stellen Sie die Elektroporationsparameter vor (Tabelle 4).

ELEKTROPORATIONSBEDINGUNGEN: Porenimpuls
Länge	V	Intervall	N	D. Bewerten	Polarität
2 ms	175	50	2	10	plus
ELEKTROPORATIONSBEDINGUNGEN: Impuls übertragen
Länge	V	Intervall	N	D. Bewerten	Polarität
50	20	50	5	40	Plus/Minus

Tabelle 4: Elektroporationseinstellungen für NEPA21.

3. Dissektion des Gehirns und Entnahme von CD-1-Mausen und-Mbryos bei E15 nach dem Koitum
   1. Opfern Sie das schwangere Weibchen durch Zervixluxation ohne Sedierung. Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol; Schneiden und öffnen Sie den Bauch mit einer scharfen Schere.
   2. Entnehmen Sie die Gebärmutter und legen Sie sie in eine Petrischale mit kaltem 1x HBSS. Lassen Sie es auf Eis in der Zellkulturhaube mit einer gewöhnlichen Pinzette.
   3. Entnehmen Sie mit Hilfe von Pinzette und Schere einen Embryo aus der Gebärmutter und enthaupten Sie ihn mit einem einzigen Schnitt mit einer Schere.
   4. Halten Sie den Kopf fest und führen Sie eine Pinzette (z. B. Dumont-Feinzange) in die Augenhöhle ein.
   5. Schneiden Sie mit der Nadel (30 G Nadelspritze) als Klinge das Bregma ab und durchbrechen Sie den hinteren Teil des Kopfes.
   6. Führen Sie eine scharfe Pinzette durch den Schnitt senkrecht in das Bregma ein und brechen Sie die dünne Hautschicht des Frontzahnbereichs auf. Ziehen Sie an der Pinzette, um der Längsspalte zwischen den beiden Hemisphären zu folgen, ohne die Hirnrinde zu beschädigen.
   7. Verwenden Sie die kleine Pinzette in einem Winkel von 45° vom vorderen zum hinteren Teil, um das Gehirn vom Kopf zu entfernen.
   8. Bewegen Sie das Gehirn in eine 3,5 cm große Petrischale mit eiskaltem 1x HBSS unter einem Stereomikroskop.
4. Dissektion der Rinde
   HINWEIS: Das Protokoll für die neuronale Kultur ist eine Anlehnung an das von Dotti und Banker¹⁰ beschriebene Verfahren.
   1. Verwenden Sie die Dumont-Pinzette (11 cm), um den Thalamus zu halten, und eine Nadel, die in einem 45°-Winkel geneigt ist, um die Rinde jeder Hemisphäre vom Mittelhirn zu trennen. Stellen Sie sicher, dass der Kortex keine Spuren von anderen Geweben aufweist. Verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um die Hirnhäute zu entfernen.
      HINWEIS: Die Hirnhäute bilden eine dünne elastische Membran, die das Gehirn umhüllt und an ihrer roten Farbe leicht zu erkennen ist. Sanfte Bewegungen im Zickzack helfen, die Hirnhäute zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass alle Hirnhäute entfernt wurden, da sie für die Kultur giftig sind.
   2. Bewegen Sie den sauberen Kortex in eine saubere 3,5 cm Petrischale mit eiskaltem 1x HBSS und legen Sie ihn auf Eis.
5. Disaggregation
   1. Schneiden Sie jede Rinde in zwei Hälften und verwenden Sie eine Pinzette oder eine scharfe Nadel (30 G), um die Wirkung von Trypsin im nächsten Schritt zu erleichtern.
   2. Übertragen Sie die Stücke mit einer P1000-Pipette in 7 mL Trypsin-EDTA-Puffer bei Raumtemperatur in ein 15-ml-Röhrchen (schneiden Sie 3-4 mm der Spitze ab). Warten Sie, bis sie auf die Unterseite der Spitze gesunken sind, bevor Sie sie von der Pipettenspitze lösen. Mischen durch Kippen.
   3. Bei 37 °C 12 min im Wasserbad inkubieren. Mischen, indem Sie alle 4-5 Minuten kippen.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit kann zwischen 12 und 15 Minuten variieren.
   4. Lassen Sie das Gewebe durch die Schwerkraft absinken und entfernen Sie vorsichtig das Trypsin. Waschen Sie das Tuch zweimal mit 8 mL 1x HBSS und rühren Sie es vorsichtig durch Kippen an. Entfernen Sie das 1x HBSS vorsichtig mit einer P1000-Pipette, aber mit einer ungeschnittenen Pipettenspitze.
   5. Waschen Sie das Tuch einmal mit 5 ml Plattationsmedium. Rühren durch Kippen. Entfernen Sie das Beschichtungsmedium vorsichtig mit einer P1000-Pipette.
   6. Fügen Sie 1,5 ml Beschichtungsmedium hinzu. Disaggregieren Sie die Mischung mechanisch mit einer P1000-Pipette, indem Sie das Medium vom Boden des Röhrchens ansaugen und maximal 8-12 Mal sanft über die Wände ablassen.
   7. Filtrieren Sie durch ein steriles Zellsieb (70 μm), das auf ein 50-ml-Röhrchen aufgesetzt wird. Geben Sie 10 ml oder ein anderes gewünschtes Volumen des Beschichtungsmediums in das Röhrchen.
   8. Geben Sie 5 μl der Zellsuspension in die Zellzählkammer, fügen Sie 5 μl Trypanblau (0,4 % w/v) hinzu und zählen Sie die Zellen.
   9. Plattieren Sie die Zellen (siehe Abschnitt 1.6), indem Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen, um die gewünschte Anzahl von Zellen für die Elektroporation (z. B. 10⁶ Zellen) zu erhalten. Die Zellen bei 250 × g 5 min zentrifugieren. Fahren Sie mit Abschnitt 1.6 fort.
6. Zellen plattieren
   1. Die gewünschte Dichte der unzentrifugierten Küvettensuspension aus Schritt 1.5.7 wird in jede Vertiefung mit dem Beschichtungsmedium plattiert.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 100.000 bis 200.000 Zellen/Well in eine 12-Well-Platte ausgesät. Als Referenz ist mindestens 3 CVs pro Versuchsbedingung zu erfassen, um die experimentelle Variabilität zu berücksichtigen. Eine typische experimentelle Umgebung kann die Abbildung von 4-5 Feldern pro CV beinhalten (z. B. würde bei Verwendung eines 20-fachen Objektivs erwartet werden, dass jedes Feld ~1,3 mm² breit ist).
   2. Bewegen Sie die Platte in der Zellkulturhaube in alle Himmelsrichtungen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
7. Elektroporation
   HINWEIS: Es können auch andere Transfektionssysteme verwendet werden. Das in diesem Protokoll verwendete NEPA21-System hat den Vorteil, dass es sich um ein "offenes System" handelt. Das Protokoll kann vom Benutzer geändert werden und erfordert keine speziellen Reagenzien für die Transfektion spezieller Küvetten, die für die Elektroporation verwendet werden. Dieses Protokoll wurde von ⁵.
   1. Fahren Sie mit Schritt 1.5.9 fort. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 5 mL Elektroporationsmedium in einem 15 mL Röhrchen. Das Röhrchen bei 250 × g 5 min zentrifugieren.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.7.1. Mit Elektroporationsmedium resuspendieren, um eine Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in jeder der Elektroporationsküvetten zu erhalten. Mischen Sie die Zellen mit der gewünschten Menge an DNA in der Küvette.
      HINWEIS: Für die GFP-Expression wurden 3 μg Plasmid pro Million Zellen verwendet. Aufgrund der hohen Variabilität empfiehlt es sich, für jedes Plasmid die optimale Konzentration zu testen. Getestet wurden zwischen 2 und 24 μg Plasmid pro Million Zellen. Verschiedene Plasmide können in derselben Küvette kombiniert werden, um eine Doppeltransfektion durchzuführen. Im Falle der Co-Transfektion transfizieren Sie das interessierende Gen im Vergleich zu GFP überschüssig (z. B. ist 3:1 ein optimales Verhältnis, das getestet werden sollte), um sicherzustellen, dass die meisten GFP-exprimierenden Zellen das interessierende Gen mitexprimieren.
   3. Setzen Sie die Küvette in die Küvettenkammer ein (Abbildung 2). Drücken Sie die Start-Taste, um das voreingestellte Programm auszuführen (siehe Elektroporationsbedingungen in Tabelle 4). Notieren Sie die Werte von Strömen und Joule, die im Rahmen Messungen angezeigt werden.
      HINWEIS: Der Benutzer kann bestimmte Bedingungen ändern. Zum Beispiel kann eine Verringerung der Spannung die Effizienz der Transfektion verringern, aber das Überleben der Neuronen erhöhen.
   4. Nehmen Sie die Küvette aus der Kammer. Geben Sie unmittelbar nach der Elektroporation 500 μl des Plattiermediums in die Küvette und überführen Sie die Probe aus der Küvette mit einer Pipette in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Je schneller die Zugabe von Medium erfolgt, desto besser ist das Überleben nach der Elektroporation, da sie hilft, Zellschäden zu vermeiden.
   5. Plattieren Sie die gewünschte Anzahl elektroporierter Zellen in jeder Vertiefung.
      HINWEIS: Platten von 20.000 bis 100.000 Zellen in einer 12-Well-Platte. Abhängig von den Bedingungen können nur 5-10% der elektroporierten Zellen überleben. Die genaue Anzahl sollte vom Nutzer getestet und angepasst werden.
   6. 2-4 h unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂, gesättigte Luftfeuchtigkeit) inkubieren.
      HINWEIS: Beobachten Sie die Zellen nach der Inkubationszeit unter dem Mikroskop. Wenn die Kultur gesund ist, hätten die meisten Zellen an der Oberfläche haften bleiben und begonnen, sichtbare Neuritenfortsätze zu sprießen.
   7. Ändern Sie das Beschichtungsmedium in ein neuronales Medium (Volumen und Zusammensetzung in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2).
8. Zellen erhalten
   1. Um das Medium aufzufrischen, entfernen Sie die Hälfte des Mediums und fügen Sie nach 7 Tagen Kultur ein gleiches Volumen frischen, vorausgeglichenen Mediums hinzu.
   2. Ersetzen Sie am 10. Tag der Kultur die Hälfte des Volumens durch frisches neuronales Medium ohne das Glutamin-Präparat (siehe Materialtabelle). Wiederholen Sie diesen Schritt jeden zweiten Tag nach Tag 10.
      HINWEIS: Nach 10 Tagen Kultur produzieren die Zellen selbst Glutamat.

2. Aufbau der hypoxischen Kammer

1. Verwenden Sie zu diesem Zweck einen hermetischen Behälter mit einem Schraubdeckel oder einem gleichwertigen Dichtungssystem (Abbildung 3A). Bohren Sie zwei Löcher in die Wand des Plastikbehälters und führen Sie jeweils ein Plastikrohr ein. Verschließen Sie sie mit Silikon, so dass der Behälter hermetisch verschlossen ist (Abbildung 3).
   HINWEIS: Hier wurde für den Bau der Kammer ein zylindrischer Kunststoffbehälter (Größe 1 Liter) mit Schraubdeckel verwendet. Stellen Sie sicher, dass der Behälter groß genug ist, um die für das Experiment erforderlichen CVs aufzunehmen. Um mehr Herz-Lungen-Erkrankungen auf gleichem Raum zu behandeln, können Kunststoffplattformen übereinander gestapelt werden (Abbildung 3A).
2. Zur Vorbereitung der Sprudelkammer (siehe 3.2) wird mit einem handelsüblichen mechanischen Bohrer ein Loch in den Kolbendeckel gebohrt, wobei ein Bohrer etwas kleiner als das Rohr ist, und ein Kunststoffrohr durch das Loch in den Kolben eingeführt. Versiegeln Sie das Loch mit Parafilm, um die hermetische Abdichtung aufrechtzuerhalten (Abbildung 3B).
3. Sterilisieren Sie den Behälter und den Kolben mit 70 % Ethanol und bestrahlen Sie ihn einen Zyklus lang mit ultraviolettem Licht, bevor Sie sie verwenden.

3. Sauerstoff-Glukose-Entzug (OGD)

HINWEIS: Das Protokoll für OGD wurde von Tasca et ^al.7 übernommen.

1. Bereiten Sie die OGD-Lösung mit Phosphatlösung (Tabelle 2) vor, die zuvor mit Antibiotika ergänzt wurde.
   HINWEIS: Verwenden Sie für jede 35-mm-Platte 5 ml; Für eine 100-mm-Platte verwenden Sie 10 ml.
2. Geben Sie die OGD-Lösung in die Sprudelkammer (Abbildung 3B) und geben Sie sie in ein Wasserbad (bereits auf 37 °C vorgewärmt). Verbinden Sie den Kolben mit der Stickstoffquelle (N₂, 100 %).
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die OGD-Lösung kein CO₂ -Gehalt benötigt, da sie HEPES als Puffer enthält. Wenn die OGD-Lösung auf einem Bicarbonat-Puffersystem basiert, verwenden Sie 5 % CO₂ und 95 % N₂ , um die hypoxische Lösung und die Kammer zu sättigen.
3. Tränken Sie die OGD-Lösung mit sanft sprudelndem Stickstoff. Lassen Sie die Lösung 20-30 Minuten lang leicht sprudeln.
4. Den Kolben sofort in die Zellkulturhaube umfüllen und 5 ml der OGD-Lösung ohne Sauerstoff in 35-mm-Platten oder 10 ml in 100-mm-Kulturplatten hinzufügen.
5. Verschieben Sie die CVs mit den kultivierten Zellen auf die Platten mit OGD. Schieben Sie die Platten, ohne sie abzudecken, in die Hypoxiekammer und verschließen Sie sie fest, aber vorsichtig.
   HINWEIS: Die Schritte 3.4 und 3.5 müssen so schnell wie möglich abgeschlossen werden. Halten Sie die Kontroll-CVs (Neuronales Medium bei Normoxie) in den Well-Platten im Inkubator. Alternativ können die Kontrollneuronen dem normoxischen OGD-Medium ausgesetzt werden, das mit Glukose (10 mM) ergänzt wurde, um die Auswirkungen von Hypoxie und Glukoseentzug selektiver zu untersuchen.
6. Schließen Sie das Stickstoffsystem an die Hypoxiekammer an und prüfen Sie, ob die Schläuche geöffnet sind. Die Kammer wird einige Minuten lang bei einem Druck von 2-3 bar (z. B. 2-3 min; 1 bar = 750 mmHg) mit N₂ gesättigt (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Vergessen Sie nicht, die OGD-Lösung zwischen mehreren Zeitpunkten erneut 15 Minuten lang sprudeln zu lassen.
7. Reduzieren Sie den Stickstoffdruck auf 1,3-1,5 bar und schließen Sie beide Röhrchen der Hypoxiekammer (Abbildung 3C). Lassen Sie die Kammer für die erforderliche Zeit (z. B. 60 min) bei 37 °C, 5 % CO₂ im Inkubator.
   HINWEIS: Die Dauer der OGD kann je nach Versuchsbedingungen und Forschungszielen angepasst werden müssen. Eine kurze Inkubationszeit (z. B. 30 Minuten) würde eine leichte Hypoxie simulieren. Zwei Stunden OGD sind in der Regel sehr hart für die Neuronen. Es wird empfohlen, vor Beginn der Studie eine OGD-Dauer von 45 bis 90 Minuten zu testen. Natürlich wirkt sich die Dauer der OGD auf das Gesamtüberleben und den relativen Beginn des neuronalen Todes nach der Genesung von der OGD aus. Wenn das Ziel darin besteht, den neuronalen Tod in Echtzeit zu analysieren, versuchen Sie, OGD-Bedingungen zu erreichen, die einige Stunden nach der Genesung von OGD den Zelltod provozieren würden, um eine effektivere Analyse zu ermöglichen.
8. Öffnen Sie die Kammer und setzen Sie die CVs zur Wiederherstellung in ihre ursprüngliche Multiwell-Platte ein. Ziehen Sie nach diesem Schritt zwei Alternativen in Betracht: 1) Fahren Sie für kleine Experimente mit Abschnitt 4 für Immunfluoreszenz und Bildanalyse fort. 2) Für das High-Content-Screening fahren Sie mit Abschnitt 5 für die Analyse im Zellanalysator (oder einer gleichwertigen Plattform) fort.
   HINWEIS: Die Live-Bildgebung bietet einen flexibleren Ansatz, da sie eine Echtzeitüberwachung der verschiedenen Experimentierpunkte ermöglicht.

4. Analyse mittels Standard-Immunfluoreszenz und ImageJ

HINWEIS: Die Erholungszeit kann je nach Bedingungen zwischen 1 und 24 Stunden variieren.

1. Waschen Sie die Neuronen mit 1x PBS für 10 min.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, da es mehrere Möglichkeiten gibt, fortzufahren und die Bilder zu analysieren.
2. Fixieren Sie die Neuronen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min bei RT. Waschen Sie sie dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min Wäsche.
   HINWEIS: Da Paraformaldehyd giftig ist, arbeiten Sie unter einer chemischen Haube.
3. Permeabilisieren Sie die Neuronen durch Zugabe von 1x PBS mit 0,1% Triton X-100 für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen schnell mit 1x PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal für jeweils 10 Minuten.
4. Geben Sie 350 μl Blockierungslösung (1x PBS mit 2% Rinderserumalbumin) in die CVs und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten einwirken. Der Primärantikörper (AB)-Stamm (5 × g für 30 s) wird geschleudert und mit der Blockierungslösung in der erforderlichen Verdünnung gemischt, z. B. Anti-GFP bei 1:600.
   1. Übertragen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer (eine Schachtel mit wassergetränktem Gewebe, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten und Verdunstung zu vermeiden) auf Parafilm. Je nach Größe der CVs geben Sie vorsichtig 60 oder 80 μl der primären Antikörperverdünnung zu jedem CV und stellen Sie sicher, dass die Zellen mit dem Antikörper in Kontakt kommen. Die CVs o/n werden bei 4 °C inkubiert.
      HINWEIS: Auf der CV-Oberfläche sollte sich ein Tröpfchen bilden, das die gesamte CV-Oberfläche bedeckt. Vermeiden Sie es, die Zellen beim Pipettieren der Antikörperlösung auf die CVs zu stören. Die Inkubationszeit konnte bei RT auf 2 h verkürzt werden.
5. Waschen Sie die CVs mit 1x PBS für 10 min über den Parafilm. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
6. Verdünnen Sie das sekundäre AB, z. B. Alexa 488 (1:500) und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:2.000) in Blockierungslösung. Je nach Größe der CVs geben Sie ein 60-80 μL Tröpfchen der sekundären AB-Lösung auf die Zellen. Inkubieren Sie die CVs für 1 h im Dunkeln bei RT. Waschen Sie die sekundären AB und DAPI 10 min lang mit 1x PBS von den Neuronen und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
7. Montieren Sie die CVs in Eindeckmedium (siehe Materialtabelle) für die Immunfluoreszenzanalyse und lagern Sie sie nach dem Trocknen im Dunkeln bei 4 °C.
8. Bilderfassung und -analyse.
   HINWEIS: Für die Aufnahme der Bilder mit 20x wurde ein inverses Mikroskop verwendet (Abbildung 4A, siehe Materialtabelle).
   1. Verwenden Sie die Open-Source-Software ImageJ, um die Bilder zu analysieren und die Maske für den GFP-Kanal zu erhalten (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Neuronen abzubilden und zu analysieren, abhängig von der Verfügbarkeit der Ausrüstung und dem experimentellen Format. Der folgende Arbeitsablauf wird als grundlegendes Beispiel bereitgestellt, wobei das Ziel darin besteht, das Soma einzelner GFP-exprimierender Neuronen zu identifizieren, die im Bild vorhanden sind. Die hier dargestellten spezifischen Werte, wie z. B. der Schwellenwert und die Partikelgröße, sollten vom Anwender anhand seiner spezifischen Versuchsbedingungen getestet werden. Darüber hinaus können verschiedene Filter und Verarbeitungsschritte hinzugefügt werden. Zum Beispiel helfen die ImageJ-Filter Subtract Background und Despeckle oft dabei, das Bild zu Beginn der Verarbeitung zu bereinigen. Die Optimierung des Workflows für spezifische experimentelle Bedingungen erfordert Vorkenntnisse in der Bildanalyse und die Kenntnis grundlegender Konzepte der quantitativen Bildanalyse. Da ein ausführlicher Leitfaden zur Bildanalyse außerhalb des Geltungsbereichs des aktuellen Protokolls liegt, empfehlen wir die folgenden Ressourcen: ImageJ-Benutzerhandbuch, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; Beispiele und Tutorials finden Sie https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; MBF ImageJ Bundle, https://imagej.net/mbf/index.htm.
   2. Wählen Sie für die Segmentierung die Segmentierung Intensität mit den erforderlichen Parametern aus, um das Soma, den hellsten Bereich der Neuronen, zu isolieren.: Menü | Bild | Anpassen | Schwelle | Mindestschwellenwert festlegen (z. B. 100) | Klicken Sie auf Übernehmen.
   3. Wiederholen Sie den Schwellenwert von 4.8.2. auf alle Bilder, um die Maske (d. h. das segmentierte Bild) für die Somas der Neuronen zu sehen (Abbildung 4E).
   4. Um die Anzahl der verbleibenden Zellen in jedem Bild zu ermitteln und die Ergebnisse in eine Tabelle zu exportieren, um Berechnungen durchzuführen, wählen Sie Menü | Analysieren | Analysieren Sie Partikel und geben Sie die erforderlichen Parameterwerte ein (z. B. Größe: 50 Pixel unendlich; Zirkularität: 0,5-1,00). Beachten Sie, dass bei t = 0 h die Anzahl der gezählten Zellen der Gesamtzahl der identifizierten Zellen entspricht, und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die zu den verschiedenen Zeitpunkten überlebt haben.
      HINWEIS: Ein niedrigerer Größenschwellenwert ist nützlich, um kleinere Objekte als das Soma herauszufiltern (z. B. 60-80 μm²).
   5. Verwenden Sie die Funktion Record Macro von ImageJ, um die Analyse zu automatisieren und zu wiederholen: Menü | Plugins | Makros | Aufzeichnen | Klicken Sie auf Erstellen , um das Makro zu generieren.

5. Echtzeit-Analyse mit dem IN Cell Analyzer 2200

1. Setzen Sie die 12-Well-Platte in den Zellanalysator ein, schließen Sie das CO_{2 -} System an und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann auf dieser Plattform leicht hochskaliert werden, indem ein ähnliches Experiment an Neuronen durchgeführt wird, die in einer 96-Wells-Platte plattiert sind.
2. Wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus, wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 5 Felder pro Vertiefung aus (in diesem Beispiel 2,33 % der Vertiefung) und fokussieren Sie sie automatisch für jeden Fluoreszenzkanal (in diesem Fall Fluorescein-Isothiocyanat [FITC]). Wählen Sie die Parameter für die Aufnahme (30 Minuten Zeitraffer für 16 Stunden). Drücken Sie Start und warten Sie.
   HINWEIS: Die Anzahl der Bildgebungsfelder muss vom Prüfer bestimmt werden und sollte ausreichend sein, um die Variabilität in einer einzelnen Vertiefung zu berücksichtigen.
3. Verwenden Sie IN Cell Developertoolbox v1.9, um den entsprechenden Workflow für die Analyse einzurichten.
4. Analysieren Sie die Neuronenbilder (FITC-Kanal), um eine Maske für das Soma der Neuronen zu generieren (Abbildung 4).
   HINWEIS: Ziel ist es, das Soma der einzelnen Neuronen zu identifizieren, die auf dem Bild vorhanden sind. Diese Analyse folgt Schritten, die den in Abschnitt 4 für ImageJ beschriebenen Schritten entsprechen. In Abschnitt 4 finden Sie Informationen zum Arbeitsablauf und zu allgemeinen Überlegungen. Die Intensitätsschwelle wird bestimmt, um das Soma auszuwählen, das die hellste Region der Neuronen ist.
   1. Wählen Sie für die Segmentierung die Segmentierung Intensität mit den erforderlichen Parametern aus (in diesem Fall ein Mindestschwellenwert von 20005.40).
   2. Wählen Sie für die Nachbearbeitung die Option Sieb , wobei Ziele mit einem Bereich größer als ein vorgegebener Wert (hier 189 Pixel (~80 μm²)) beibehalten werden.
   3. Wählen Sie den Parameter Summe aus, um alle in der Maske identifizierten Neuronen (überlebende Neuronen) für jedes Feld und für alle Felder eines Wells zu jedem Zeitpunkt des Zeitverlaufs zu zählen und zu summieren.
   4. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabelle. Bei t = 0 h ist zu berücksichtigen, dass die Anzahl der gezählten Zellen die Gesamtzahl der identifizierten Zellen ist, und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die zu den verschiedenen Zeitpunkten überlebt haben. Berechnen Sie den Zeitpunkt, zu dem 50 % der Zellen tot sind, um den Vergleich zwischen den Bedingungen zu erleichtern.
      HINWEIS: Die Parameter für die Segmentierungs- und Nachbearbeitungsschritte müssen vom Benutzer für verschiedene Fluoreszenzkanäle in Abhängigkeit von den zu identifizierenden Strukturen angepasst werden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein In-vitro-Modell für Schlaganfälle zu etablieren. Es ist wichtig, eine angemessene neuronale Dichte zu erhalten, die es ermöglicht, einzelne elektroporierte Neuronen zu erkennen, um sie einzeln zu analysieren. Das Stadium der neuronalen Kultur nach dem Plattieren ist ebenfalls entscheidend. Die Reifung von Neuronen in Kultur verläuft fortschreitend. Die Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren, dem Wachstum von Neuriten, der Konnektivität und der elektrophysiologischen Aktivität va...

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt eine effektive Möglichkeit, einen Schlaganfall in vitro zu modellieren. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir die spärliche Markierung von kortikalen Neuronen mit dem Elektroporationssystem NEPA21⁵ vorgeschlagen. Dabei handelt es sich um ein offenes System, das eine Anpassung des Protokolls mit minimalen Betriebskosten im Vergleich zu anderen Systemen, die Kits oder spezielle Geräte verwenden, ermöglicht. Die Mischkultur von naiven...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm Petrischalen	FISHER SCIENTIFIC, S.L.	1130-9283
3,5 cm Petrischalen	Sterilin
75 cm2 Corning		430641U
B-27	Life Technologies	17504-044
Zellkulturplatten	Corning Incorporation Costar®	3513
Zellinkubator	Thermo Electron Corporation	Modell 371
Zellsieb 70 µ m	Falcon	352350
Kaltlichter	Schott	223488	KL 1500 LCD
Deckgläser (15 mm)	Marienfeld	111530
CU500 Küvettenkammer	Nepa Gene
CU600 Küvettenständerhalter	Nepa Gene
DAPI	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	D9542-10MG	1:2000
DMSO	Panreac	A3672
Dumont Feinzange	FST	11254-20
Dumont Feinzange	FST	11252-00
EC-002S NEPA Elektroporationsküvetten, 2mm Abstand	Nepa Gene Filter
Sieb	Falcon	352350
Feinschere-Scharf-Stumpf	FST	14028-10
Feine Schere-ToughCut r	FST	14058-09
GFP Huhn IgY	Aves Labs	GFP-1010	1:600
Glucose	Sigma	68769-100ml
GlutaMAX-I Supplement 200 mM 100 mL	Fisher Scientific	35050-061
HBSS	Thermofisher	14175-095	https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 M	ThermoFisher	15630-080
Pferdeserum	Invitrogen	26050088
MEM	Thermofisher	11095080	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
Objektträger (Polilysin)	VWR	631-0107	Maße: 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	81381-250G
Nadeln gelb, 30 Gauge	BD Microlance™ 3	304000
NEPA21 Elektroporator	Nepa Gene
Neubauer Kammer	Blau Marke	717805
Neurobasal Medium	ThermoFisher	21103-49
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Paraformaldehyd (PFA), 95%	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	158127-500G	Anwendungslösung: 4%
PEI	Polysciences	23966-1
Plasmid für GFP			pCMV-GFP-ires-Cre, beschrieben in Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-Lysin	SIGMA	P2636
PS ( Penicillin, Streptomycin)	ThermoFisher	15140122
Seratzange	FST	11152-10
Stereomikroskop	WORLD PRECISION INSTRUMENTS
Spritzen	BD Plastipak 1ml	303176
Triton X-100	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	MDL-Nummer: MFCD00128254	Nichtionisches
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25300054
Röhrchen 15 mL	Fisher	05-539-4
Röhrchen 50 mL	VWR	21008-242
Tupperware		-	Hermetische Tupperware mit Schraubdeckel. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. Jede gleichwertige hermetische Tupperware kann in jedem Supermarkt gekauft werden.
Wasserbad	SHELDON LABORATORY MODEL 1224 1641951