Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Zusammenfassung

Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.

Zusammenfassung

Messungen der retinalen neuronalen Lichtreaktionen sind entscheidend für die Untersuchung der Physiologie der gesunden Netzhaut, die Bestimmung pathologischer Veränderungen bei Netzhauterkrankungen und das Testen therapeutischer Interventionen. Das ex vivo Elektroretinogramm (ERG) ermöglicht die Quantifizierung von Beiträgen einzelner Zelltypen in der isolierten Netzhaut durch Zugabe spezifischer pharmakologischer Wirkstoffe und die Bewertung gewebeintrinsischer Veränderungen unabhängig von systemischen Einflüssen. Retinale Lichtantworten können mit einem speziellen Ex-vivo-ERG-Probenhalter und Aufnahmeaufbau gemessen werden, der von bestehenden Patchklemmen oder Mikroelektroden-Array-Geräten modifiziert wurde. Insbesondere die Untersuchung von ON-bipolaren Zellen, aber auch von Photorezeptoren, wurde durch den langsamen, aber fortschreitenden Rückgang der Lichtantworten im ex vivo ERG im Laufe der Zeit behindert. Die erhöhte Perfusionsgeschwindigkeit und die Einstellung der Perfusattemperatur verbessern die Ex-vivo-Netzhautfunktion und maximieren die Reaktionsamplitude und -stabilität. Das ex vivo ERG ermöglicht auf einzigartige Weise die Untersuchung einzelner retinaler neuronaler Zelltypen. Darüber hinaus ermöglichen Verbesserungen zur Maximierung der Reaktionsamplituden und -stabilität die Untersuchung von Lichtreaktionen in Netzhautproben von großen Tieren sowie menschlichen Spenderaugen, was das ex vivo ERG zu einer wertvollen Ergänzung des Repertoires an Techniken macht, die zur Untersuchung der Netzhautfunktion verwendet werden.

Einleitung

Die Elektroretinographie misst die Netzhautfunktion als Reaktion auf Licht¹. Es ist integraler Bestandteil des Studiums der Netzhautphysiologie und Pathophysiologie und der Messung des Erfolgs von Therapien für Netzhauterkrankungen. Das In-vivo-ERG wird häufig zur Beurteilung der Netzhautfunktion in intakten Organismen verwendet, weist jedoch signifikante Einschränkungen^{auf 2,3}. Unter diesen wird die quantitative Analyse einzelner retinaler Zelltypen im in vivo ERG erschwert, da es die Summe der möglichen Veränderungen und damit überlagerten Reaktionen von allen Netzha....

Protokoll

Alle Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Studies Committee der University of Utah genehmigt. Schweineaugen zur Demonstration dieses Videos wurden postmortal aus dem Schlachthof (Sustainable Swine Resources, Johnsonville) erhalten. Die Augen wurden von menschlichen Spendern nach Hirn- oder Herztod mit Zustimmung zur Forschungsnutzung durch die Utah Lions Eye Bank, die San Diego Eye Bank oder Lifesharing erhalten, die von der FDA, der Association of Organ Procurement Organizations (AOPO) und der Eye Banks of America Association vollständig akkrediti....

Ergebnisse

Ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung reproduzierbarer und stabiler Photorezeptor- und ON-bipolarer Zelllichtantworten, beispielsweise von der Netzhaut der Maus (Abbildung 2A-C). Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten menschlicher Spendernetzhaut ist mit bis zu 5 h postmortaler Verzögerung der Enukleation (Abbildung 2D) und von ON-bipolaren Zellantworten mit einer Enukleationsverzögerung von <20 min (

Diskussion

Ursprünglich 1865 von Holmgren entwickelt, um die retinalen Lichtantworten der Amphibiennetzhaut¹⁰ zu messen, verhinderten technische Einschränkungen zunächst eine breite Anwendung. Dennoch identifizierten wegweisende Studien von Ragnar Granit und anderen die zellulären Ursprünge des ERG und maßen Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten ex vivo^11,12,13. Seitdem haben verfeinerte Methoden ein.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-mm-Sockel	WPI	2026-10	Materialien zur Herstellung der Elektrode
Ag/AgCl-Elektrode	World Precision Instruments	EP1-Materialien	zur Herstellung der Elektrode
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420	Perfusionsmedium
Bariumchlorid	Sigma Aldrich	B0750	Kaliumkanalblocker
DL-AP4	Tocris	0101	Breitspektrum-glutamaterger Antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter	OcuScience	n/a	ex vivo ERG Probenhalter
Luer-Gewindeanschluss	McMaster-Carr	51525K222 oder 51525K223	Materialien zur Vorbereitung der Elektrode