Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Jing Yang; Qing-Ming Qin; Erin Van Schaik; James E. Samuel; Paul de Figueiredo

doi:10.3791/62764

Methodenartikel

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

DOI:

10.3791/62764

⸱

17. September 2021

Jing Yang¹ , Qing-Ming Qin¹ , Erin Van Schaik¹ , James E. Samuel¹ , Paul de Figueiredo¹^,²

¹Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, ²College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

In diesem Artikel

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Zusammenfassung

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Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.

Zusammenfassung

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Die Identifizierung neu auftretender bakterieller Krankheitserreger ist für die menschliche Gesundheit und Sicherheit von entscheidender Bedeutung. Die bakterielle Adhärenz an wirtszellen ist ein wesentlicher Schritt bei bakteriellen Infektionen und stellt ein Kennzeichen potenzieller Bedrohung dar. Daher kann die Untersuchung der Adhärenz von Bakterien an Wirtszellen als Bestandteil der bakteriellen Bedrohungsbewertung verwendet werden. Eine Standardmethode zur Aufzählung der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen besteht darin, Bakterien mit Wirtszellen zu inkubieren, die adhärenten Bakterien zu ernten, die geernteten Zellen auf festen Medien zu plattieren und dann die resultierenden koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Alternativ kann die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen bewertet werden. Herkömmliche Strategien zur Umsetzung dieser Ansätze sind jedoch zeitaufwendig und ineffizient. Hier wird ein kürzlich entwickeltes automatisiertes fluoreszenzmikroskopiebasiertes Bildgebungsverfahren beschrieben. In Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse ermöglicht die Methode eine schnelle Quantifizierung von Bakterien, die an Wirtszellen haften. Zwei Bakterienarten, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa und Gram-positive Listeria monocytogenes und entsprechende Negativkontrollen, wurden getestet, um das Protokoll zu demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz adhärente Bakterien schnell und genau aufzählt und experimentelle Arbeitsbelastungen und Zeitpläne signifikant reduziert.

Einleitung

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Bakterielle Adhäsion ist ein Prozess, bei dem sich Bakterien an andere Zellen oder Oberflächen anlagern. Die erfolgreiche Etablierung einer Infektion durch bakterielle Krankheitserreger erfordert die Adhäsion an Wirtszellen, die Besiedlung von Geweben und in einigen Fällen die Invasion von Wirtszellen¹^,²^,³. Neu auftretende Infektionskrankheiten stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, wie die jüngste COVID-19-Pandemie⁴^,⁵^,^{6 zeigt.} Wichtig ist, dass neue oder au....

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Protokoll

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1. A549 Zellkultur

Halten Sie die A549-Zelllinie in F-12K-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und inkubieren Sie bei 37 °C, 5%_CO2.
Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage und passieren Sie es mit 85% -95% Konfluenz.
Spülen Sie die Zellen kurz mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, sofern nicht anders angegeben) und behandeln Sie sie mit 1 ml 0,25% 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung (Untertauchen der Zellschicht) für etwa 2 min bei 37 °C.
Fügen Sie zusätzliche 6 ml komplettes Wachstumsmedium (F-12K-Medium + 10% FBS) hinzu, um die Proteaseaktivität zu stoppen. Anschließend ....

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Ergebnisse

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Zur Entwicklung des fluoreszenzbildgebenden bakteriellen Adhärenztests wurden P. aeruginosa Stamm PAO1 und sein Negativadhärenz-Gegenstück E. coli verwendet, um die Wirksamkeit des Protokolls zu testen, da die Adhärenz dieser Bakterien an A549-Zellen berichtet worden war¹⁴^,²⁰^,²². Zuerst wurden GFP-markierte P. aeruginosa (PAO1) und GFP-markierte E. coli mit einer humanen immortalisierten Epith.......

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Diskussion

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Das Protokoll beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Aufzählung der bakteriellen Bindung an Wirtszellen. Der beschriebene Ansatz hat mehrere attraktive Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden. Erstens ermöglicht dieser Ansatz die genaue Quantifizierung der Anzahl der mikrobiellen Pathogenzellen, die an einzelne Wirtszellen gebunden sind. Wichtig ist, dass diese Quantifizierung ohne die Notwendigkeit einer mühsamen Bakterienernte, seriellen Verdünnung, Beschichtung auf festen Medien und Bestimmung der CFUs

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Offenlegungen

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Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Kaite Zlotkowski von Biotek Inc. für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium unter der Vertragsnummer W911NF1920013 an PdF, die Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) und das Innenministerium unter der Vertragsnummer 140D6319C0029 an PdF unterstützt. Der Inhalt der Informationen spiegelt nicht unbedingt die Position oder die Politik der Regierung wider, und es sollte keine offizielle Billigung abgeleitet werden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Färbefarbstoff für Wirtszellen
96-Well-Platte	Corning	3882	Halbflächige Vertiefung, flacher, klarer Boden
A549 Zellen	ATCC	CCL 185	Säugetier-Zelllinie
BactoView Live Red	Biotium	40101	Bakterien-Staning-Farbstoff-Zentrifuge
	Eppendorf	5810R
CFSE-Zellteilungs-Tracker	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Multimode-Reader für die Zellbildgebung
E. coli			Laborbestand
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC Zellkulturmedium
EHEC			NIST Kollektionen
F-12k Medium	ATCC	302004	A549 Zellkulturmedium
Fötales Rinderserum	Corning	35-016-CV
HUVEC			Laborat
L. monocytogenes			NIST-Sammlungen
OD600, DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa	, Dr. Lori Burrows,
, P. aeruginosa & Delta; pilA			, Dr. Lori Burrows, Laborbestand
, S. agalactiae,			NIST-Sammlungen
, S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus & Delta; saeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST-Sammlungen
Typische Sojabrühe	Growcells	MBPE-4040

, , , , Laborbestand, ,

Referenzen

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Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 2/08/2022. Citeable Link.

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Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

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Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Schlagwörter

Automatisierte Detektion Hochdurchsatz Imaging Fluoreszenzmikroskopie Bildanalyse koloniebildende Einheiten Multiplizit t der Infektion A549 Zellen Pseudomonas aeruginosa

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

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