Transiente Transduktion der strobatierten Formen von Echinococcus granulosus

Summary

Wir beschreiben eine schnelle transiente Transduktionstechnik in verschiedenen Entwicklungsstadien von Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation.

Abstract

Die zystische Echinokokkose oder Hydatiden-Krankheit ist eine der wichtigsten zoonotischen parasitären Erkrankungen, die durch Echinococcus granulosus , einen kleinen Bandwurm, der im Darm von Hunden untergebracht ist, verursacht wird. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung, um die Mechanismen der Pathogenese und der Krankheitsbekämpfung und -prävention zu verstehen. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems behindert jedoch die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich der Echinococcus-Spezies . Die vorliegende Studie zeigt das Potenzial der transienten Transduktion des lentiviralen Gens in den Metazestoden und strobilierten Formen von E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) wurden aus Hydatidenzysten isoliert und auf spezifische biphasische Kulturmedien übertragen, um sich zu strobilierten Würmern zu entwickeln. Die Würmer wurden mit geerntetem Lentivirus der dritten Generation transfiziert, zusammen mit HEK293T-Zellen als Transduktionsprozesskontrolle. Eine ausgeprägte Fluoreszenz wurde bei den strobierten Würmern über 24 h und 48 h nachgewiesen, was auf eine transiente lentivirale Transduktion in E. granulosus hinweist. Diese Arbeit präsentiert den ersten Versuch einer lentivirusbasierten transienten Transduktion in Bandwürmern und zeigt die vielversprechenden Ergebnisse mit möglichen Implikationen in experimentellen Studien zur Plattwurmbiologie.

Introduction

Die zystische Echinokokkose (CE) ist eine der wichtigsten Helminthenerkrankungen, die durch Echinococcus granulosus, einen kleinen Bandwurm innerhalb der Familie ^{Taeniidae 1,2}, verursacht wird. Umfangreiche Studien zur Immundiagnostik und Impfstoffentwicklung für E. granulosus wurden durchgeführt. Unzureichende Kenntnisse über die molekularen Grundlagen der Parasitenbiologie stellen jedoch große Einschränkungen bei der Diagnose, Behandlung und Prävention der Hydatidenkrankheit^dar 3,4,5,6.<....

Protocol

Diese Studie wurde vom National Institute for Medical Research Development und dem Research Ethics Review Committee, Nr. 958680, genehmigt. Lentiviren werden als BSL-2-Organismen klassifiziert; Daher wurden alle Laborkulturverfahren in diesem Protokoll unter Verwendung steriler Laborpraktiken durchgeführt und unter einer laminaren Durchflusshaube gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Studienprotokolls für die verschiedenen E. granulosus-Stadien .

1. Sammeln von Hydatidenzysten

1. Sammeln Sie Leberhydatidenzysten von natürlich....

Results

Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente transiente Transduktionstechnik in E. granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Wir kultivierten PSCs in einem biphasischen Kulturmedium, um strobazierte Würmer zu erhalten, wie zuvor beschrieben^25,26. Protoscoleces entwickeln sich nach 6 Wochen in vitro zu strobilierten Würmern. Im biphasischen Kulturmedium wurden verschiedene Stadien von E. granulosus

Discussion

Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Nematoden und Platyhelminthesbiologie ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenität zoonotischer Parasiten²⁷. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems ist ein großes Hindernis für die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich Echinococcus-Spezies ^12,27. Die vorliegende Studie zeigt das ausgezeichnete Potenzial von Lentivirus i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Well-Kulturplatten	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 Kulturkolben	SPL Life Sciences	70325
6-Well-Kulturplatten	SPL Life Sciences	30006
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Arbeitskonzentration: 2,5  mM
CMRL 1066 medium	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 Inkubator	memmert	ICO150
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
	DMEM Life Technology	12100046
Hundegalle			Isoliert von einem euthanasierten Hund und sterilisiert durch 0,2 μ m Spritzenvorsatzfilter
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	0,1% Eosin für den Arbeitsausschlusstest vorbereiten
Fötales Rinderserum (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Hitzeinaktivierung von  FBS (30 min in 40 & Grad; C)
Fötales Kälberserum (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Hitzeinaktivierung von  FCS (30 min in 40°; C)
HEK293T Zellen	BONbiotech	BN_0012.1.14	Humane embryonale Niere 293T
HEPES gepufferte Kochsalzlösung (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x Konzentrat
Inverses Fluoreszenzmikroskop	OLYMPUS	IX51
Penicillin	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Arbeitskonzentration: 100 IE/mL
Pepsin	Roche	10108057001	Arbeitskonzentration: 2 mg/ml, pH 2
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	DNAbiotech	DB0011	Dieses Reagenz löst sich in weniger als 1 min in DW
Polybrene (Transfektionsreagenz)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI Medium	BioIdea	BI-1006-05
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Arbeitskonzentration: 100 μ g/mL
Lentivirales Plasmid der dritten Generation (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Transfervektor (kommerziell bezogen von der Forschungsabteilung für Molekulare Medizin des Iranischen Akademischen Zentrums für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Mashhad, Iran)
Lentivirales Plasmid der dritten Generation (pLPI und pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Helfervektor (kommerziell bezogen von der Forschungsabteilung für Molekulare Medizin des Iranischen Akademischen Zentrums für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Mashhad, Iran)
Lentivirales Plasmid der dritten Generation (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Helfervektor (kommerziell bezogen von der Forschungsabteilung für Molekulare Medizin des Iranischen Akademischen Zentrums für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA-Puffer (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x Arbeitslösungen (pH 7,4– 7.6)