Methodenartikel

Transiente Transduktion der strobatierten Formen von Echinococcus granulosus

DOI:

10.3791/62783

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16. September 2022

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1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben eine schnelle transiente Transduktionstechnik in verschiedenen Entwicklungsstadien von Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation.

Zusammenfassung

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Die zystische Echinokokkose oder Hydatiden-Krankheit ist eine der wichtigsten zoonotischen parasitären Erkrankungen, die durch Echinococcus granulosus , einen kleinen Bandwurm, der im Darm von Hunden untergebracht ist, verursacht wird. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung, um die Mechanismen der Pathogenese und der Krankheitsbekämpfung und -prävention zu verstehen. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems behindert jedoch die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich der Echinococcus-Spezies . Die vorliegende Studie zeigt das Potenzial der transienten Transduktion des lentiviralen Gens in den Metazestoden und strobilierten Formen von E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) wurden aus Hydatidenzysten isoliert und auf spezifische biphasische Kulturmedien übertragen, um sich zu strobilierten Würmern zu entwickeln. Die Würmer wurden mit geerntetem Lentivirus der dritten Generation transfiziert, zusammen mit HEK293T-Zellen als Transduktionsprozesskontrolle. Eine ausgeprägte Fluoreszenz wurde bei den strobierten Würmern über 24 h und 48 h nachgewiesen, was auf eine transiente lentivirale Transduktion in E. granulosus hinweist. Diese Arbeit präsentiert den ersten Versuch einer lentivirusbasierten transienten Transduktion in Bandwürmern und zeigt die vielversprechenden Ergebnisse mit möglichen Implikationen in experimentellen Studien zur Plattwurmbiologie.

Einleitung

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Die zystische Echinokokkose (CE) ist eine der wichtigsten Helminthenerkrankungen, die durch Echinococcus granulosus, einen kleinen Bandwurm innerhalb der Familie Taeniidae 1,2, verursacht wird. Umfangreiche Studien zur Immundiagnostik und Impfstoffentwicklung für E. granulosus wurden durchgeführt. Unzureichende Kenntnisse über die molekularen Grundlagen der Parasitenbiologie stellen jedoch große Einschränkungen bei der Diagnose, Behandlung und Prävention der Hydatidenkrankheitdar 3,4,5,6.

In den letzten Jahren wurden aufgrund der Entwicklung von Genomsequenzierungs- und transkriptomischen Methoden eine breite Palette von molekularen Studien an Plattwürmern von mehreren Forschungsgruppendurchgeführt 7,8,9. In der Welt der Parasiten sind die Fortschritte in der Gentransfertechnologie bei parasitären Plattwürmern jedoch im Vergleich zu den hochreproduzierbaren transienten Transduktionsmethoden, die für einige Protozoen entwickelt wurden, immer noch begrenzt10,11,12.

Der Einsatz viraler Abgabesysteme hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem wesentlichen Instrument für die Transgenabgabe und Gen-/Proteinuntersuchungen entwickelt13. Lentivirus infiziert sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen, wodurch es möglich wird, postmitotische Zellen zu infizieren14,15,16. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung eines Lentivirus-basierten Transduktionssystems in Säugetierzellen das Potenzial bietet, die meisten Einschränkungen früherer Knock-in/Knock-down-Techniken zu überwinden. Das Design und die Konstruktion von lentiviralen Expressionsvektoren mit geeigneten molekularen Markern, wie der GFP-Expression, wurden bereitsbeschrieben 16. Daher untersuchen wir die lentivirale transiente Transduktion eines GFP-Reportergens in den Protoscoleces und strobilierten Würmern von E. granulosus.

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Protokoll

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Diese Studie wurde vom National Institute for Medical Research Development und dem Research Ethics Review Committee, Nr. 958680, genehmigt. Lentiviren werden als BSL-2-Organismen klassifiziert; Daher wurden alle Laborkulturverfahren in diesem Protokoll unter Verwendung steriler Laborpraktiken durchgeführt und unter einer laminaren Durchflusshaube gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Studienprotokolls für die verschiedenen E. granulosus-Stadien .

1. Sammeln von Hydatidenzysten

  1. Sammeln Sie Leberhydatidenzysten von natürlich infizierten Schafen, die routinemäßig in einem Schlachthof geschlachtet werden.
  2. Sterilisieren Sie die Zystenoberfläche vollständig mit steriler Gaze und 70% Alkohol, bevor Sie die Protoscoleces (PSCs) absaugen.
  3. Saugen Sie 20-50 ml Hydatidenflüssigkeit in sterile 50 ml konische Röhrchen ab.
  4. Nach dem Abtropfen die Zyste mit einer scharfen Klinge auslöschen, die Keimschicht in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen überführen und für kurze Zeit (~ 2 min) schütteln, um die Sammlung von PSCs zu erhöhen. Übertragen Sie die Keimschicht zur molekularen Charakterisierung auf ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
  5. Waschen Sie die PSCs 3-5x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  6. Beobachten Sie die PSCs in 0,1% Eosin für 5 Minuten, um die PSC-Lebensfähigkeit unter einem Lichtmikroskop zu bestimmen. Verwenden Sie PSCs mit einer Lebensfähigkeit von mindestens 95% für die Kultur.
  7. Behandeln Sie den PSC-Niederschlag mit 2 ml Pepsin (2 mg / ml, pH 2) für 15-20 min.
  8. Um einzelne PSCs zu isolieren, suspendieren Sie das PSC-Sediment in PBS und leiten Sie es durch zwei Schichten steriler Gaze in ein neues steriles 50 ml konisches Röhrchen.
    HINWEIS: Berechnen Sie den Durchschnitt von drei Zählungen auf 50 μL PSC-Sedimenten mit einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie für nachfolgende Versuche den geschätzten Wert, um die PSCs/μL zu bestimmen. Jedes Hydatidenzystenisolat sollte auf der Grundlage von Nukleotidpolymorphismen durch molekulare Methoden wie PCR-Sequenzierung17 oder hochauflösende Schmelzkurvenanalyse18 charakterisiert werden.

2. Biphasische Kultivierung von PSCs von E. granulosus , um erwachsene Würmer zu erhalten

HINWEIS: Isolierte PSCs sollten unter sterilen Bedingungen unter einem Laminar-Flow-Schrank der Klasse II kultiviert werden. Bereiten Sie die festen und flüssigen Phasen des biphasischen Kulturmediums separat vor, bevor Sie mit den nächsten Schritten19 fortfahren.

  1. Bereiten Sie das biphasische Kulturmedium so vor, dass es aus zwei Phasen besteht.
    1. Für die feste Phase 10 ml Rinderserum in einen 25 ml Kolben geben und bei 76 °C für 20-30 min koagulieren lassen.
    2. Für die flüssige Phase (modifizierte CMRL) mischen Sie 100 ml hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum (FCS), 36 ml 5% Hefeextrakt, 5,6 ml 30% Glucose (in destilliertem Wasser), 1,4 ml 5% Hundegalle in PBS, 20 mM HEPES-Puffer und 10 mMNaHCO 3 in 260 ml CMRL-1066-Medium. Schließlich Penicillin (100 IE / ml) und Streptomycin (100 mg / ml) zu der Mischung hinzufügen.
  2. 10 ml des flüssigen Phasenmediums in jeden 25 cm2 Kulturkolben geben.
  3. Geben Sie ~ 5.000 PSCs in den Kulturkolben und geben Sie den Kolben in den CO 2 -Inkubator (37 °C, 5% CO2).
  4. Nach 24-48 h werden die PSCs in einen neuen Kolben mit der festen Phase (Rinderserum) überführt und 1 ml des gleichen frischen flüssigen Phasenmediums pro Kolben zugegeben. Überführung der Kolben in den CO 2 Inkubator (37 °C, 5 % CO2).
  5. Ersetzen Sie das Medium alle 5-7 Tage durch frisches flüssiges Phasenmedium, basierend auf Änderungen der Farbe des Kulturmediums und dem geschätzten Anteil differenzierter PSCs.
    HINWEIS: Protoscoleces reagieren schnell auf Umweltveränderungen nach der Kultivierung, und die meisten von ihnen werden innerhalb von 2-3 Wochen differenziert. Aufgrund des Verbrauchs von Nährstoffen und des Wachstums und der Entwicklung von Protoscoleces ändert sich der pH-Wert des Kulturmediums und seine Farbe verschiebt sich in Richtung Orange und Gelb.

3. Monophasische Kultivierung von PSCs von E. granulosus

  1. Stellen Sie sicher, dass die monophasische Kultivierung 24-48 h vor der Transduktion durchgeführt wird.
    1. Kultur ~ 5.000 PSCs in einem 25 cm2 Kulturkolben mit RPMI und 10% fetalem Rinderserum (FBS).
    2. Die Kolben bis zur Verwendung in den CO 2 Inkubator (37 °C, 5 % CO2) geben.

4. Zellkultur zur Virusproduktion und -aufbereitung

HINWEIS: Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) wurden für die Vektorproduktion vom Pathology and Stem Cell Research Center der Kerman University of Medical Sciences gewonnen.

  1. Übertragen Sie 5 × 10 5 HEK293T-Zellen in einen 25 cm2-Kolben, der5 ml DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält.
  2. Die HEK293T-Zellen bei 37 °C in 5% CO2 inkubieren und alle 48 h im kompletten Kulturmedium passieren. Verwenden Sie schließlich HEK293T-Zellen mit niedriger Passage für die Transduktion20.

5. Produktion und Präparation des Virus mit den lentiviralen Vektoren der dritten Generation

HINWEIS: Der Lentivirus-Vektor pCDH513b (Transfervektor) und PLPII, PLPI und PMD2G (Hilfsvektoren) wurden verwendet, um das GFP-Reporter-Gen zu exprimieren. Siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung S1.

  1. Tag 1:
    1. Nach der Trypsinisierung der HEK293T-Zellen21 in 6-Well-Kulturplatten werden 7 × 104 Zellen pro Well mit frischem, antibiotikafreiem DMEM mit 10% FBS ausgesät.
    2. Verwenden Sie Zellen mit 50% -60% Konfluenz für die Transduktion durch die Calciumphosphatmethode.
  2. Tag 2:
    1. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium 2-3 h vor dem Experiment durch frisches, antibiotikafreies DMEM mit 2% FBS.
    2. Mischen Sie in einer 1,5-ml-Röhre die lentiviralen Plasmide der dritten Generation, einschließlich 7 μg/μL pCDH513b (Transfervektor), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI und 2 μg/μL PMD2G (Hilfsvektoren).
    3. HEPES-Puffer (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES und 1,5 mM Na2HPO4; optimaler pH-Bereich, 7,00-7,28) zu der Mischung auf ein Volumen von 422 μL.
    4. 16 μL 1% Tris-EDTA (TE)-Puffer in die Mischung geben.
    5. 62 μL 2,5 mM Calciumchlorid in die Röhrchen geben und gut mischen.
    6. Geben Sie 500 μL 2x HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) zu der Mischung, tropfenweise, innerhalb von 1-2 min mit einer Pasteur-Pipette. Mischen Sie vorsichtig, bis eine halbundurchsichtige Lösung erhalten wird, und inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
    7. Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen.
    8. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator und ersetzen Sie das Medium nach 4-6 h durch antibiotikafreies DMEM mit 10% FBS.
  3. Tag 3:
    1. Bestätigen Sie die erfolgreiche transiente Transduktion und Zelllebensfähigkeit mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop.
  4. Tag 4:
    1. Ernten Sie Viren aus dem Kulturmedium, indem Sie den Überstand jedes Brunnens sammeln und bis zur Verwendung bei -70 ° C lagern.
      HINWEIS: Geerntete Lentiviren könnten für eine präzise Transfektion konzentriert und titriert werden22.

6. Transiente Transduktion verschiedener Stadien von E. granulosus mit dem Virus

  1. Tag 1:
    1. Verwenden Sie eine 12-Well-Kulturplatte für den Gentransfer. Kultur 5 × 103-5 × 10 4 HEK293T Zellen in dreifacher Ausfertigung, mit vollständigem DMEM-Medium alsinterner Referenz.
    2. Kultur 150 frische PSCs in dreifacher Ausfertigung in RPMI und 10% FBS.
    3. Kultur 30 strobilierte Würmer in dreifacher Ausfertigung in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem FBS.
      HINWEIS: Alle Transduktionsmedien müssen antibiotikafrei sein. Bewahren Sie dabei drei unbehandelte Kontrollquellen für HEK293T-Zellen, PSCs und stroboskopierte Würmer auf.
    4. Bereiten Sie eine Mischung aus 1 × 106 Viren mit 4 μg/ml Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) vor, um die HEK293T-Zellen und verschiedene Stadien des Wurms zu transduzieren.
    5. Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen. Inkubieren Sie die Platten für 4-6 h in einem CO 2 Inkubator (37 °C, 5% CO2). Ersetzen Sie das Medium für jede Probe durch das gleiche vollständige Kulturmedium, um die toxischen Wirkungen des Transfektionsreagenzes zu minimieren.
  2. Tag 2:
    1. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.4-6.1.5, um die Effizienz der transienten Transduktion für die HEK293T-Zellen, PSCs und stroboskopierten Würmer zu erhöhen.
    2. Inkubieren Sie alle Platten für 24-48 h in einem CO2 -Inkubator mit den gleichen Kulturbedingungen basierend auf der Art des Zellmediums.
  3. Tag 3:
    1. Überprüfen Sie, ob die Transduktion erfolgreich ist, indem Sie die Fluoreszenzmikroskopie verwenden.
      HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung weiterer Bestätigungsassays wie PCR/qPCR 20,23 oder Western Blotting 24-Techniken im Gentransferverfahren.

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Ergebnisse

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Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente transiente Transduktionstechnik in E. granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Wir kultivierten PSCs in einem biphasischen Kulturmedium, um strobazierte Würmer zu erhalten, wie zuvor beschrieben25,26. Protoscoleces entwickeln sich nach 6 Wochen in vitro zu strobilierten Würmern. Im biphasischen Kulturmedium wurden verschiedene Stadien von E. granulosus

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Diskussion

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Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Nematoden und Platyhelminthesbiologie ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenität zoonotischer Parasiten27. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems ist ein großes Hindernis für die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich Echinococcus-Spezies 12,27. Die vorliegende Studie zeigt das ausgezeichnete Potenzial von Lentivirus i...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Elite Researcher Grant Committee unter der Preisnummer 958680 des National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-KulturplattenSPL Life Sciences30012
25 cm2 KulturkolbenSPL Life Sciences70325
6-Well-KulturplattenSPL Life Sciences30006
CalciumchloridSigma-AldrichC4901-500GArbeitskonzentration: 2,5  mM
CMRL 1066 mediumThermo Fisher Scientific11530037
CO2 InkubatormemmertICO150
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG8270-1KG
DMEM Life Technology12100046
HundegalleIsoliert von einem euthanasierten Hund und sterilisiert durch 0,2 μ m Spritzenvorsatzfilter
Eosin YSigma-AldrichE4009-5G0,1% Eosin für den Arbeitsausschlusstest vorbereiten
Fötales Rinderserum (FBS)DNAbiotechDB9723-100mlHitzeinaktivierung von  FBS (30 min in 40 & Grad; C)
Fötales Kälberserum (FCS)DNAbiotechDB9724-100mlHitzeinaktivierung von  FCS (30 min in 40°; C)
HEK293T ZellenBONbiotechBN_0012.1.14Humane embryonale Niere 293T
HEPES gepufferte Kochsalzlösung (HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x Konzentrat
Inverses FluoreszenzmikroskopOLYMPUSIX51
PenicillinSigma-AldrichP3032-10MUArbeitskonzentration: 100 IE/mL
PepsinRoche10108057001Arbeitskonzentration: 2 mg/ml, pH 2
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)DNAbiotechDB0011Dieses Reagenz löst sich in weniger als 1 min in DW
Polybrene (Transfektionsreagenz)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI MediumBioIdeaBI-1006-05
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
StreptomycinSigma-AldrichS9137-25GArbeitskonzentration: 100 μ g/mL
Lentivirales Plasmid der dritten Generation (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBITransfervektor (kommerziell bezogen von der Forschungsabteilung für Molekulare Medizin des Iranischen Akademischen Zentrums für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Mashhad, Iran)
Lentivirales Plasmid der dritten Generation (pLPI und pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00Helfervektor (kommerziell bezogen von der Forschungsabteilung für Molekulare Medizin des Iranischen Akademischen Zentrums für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Mashhad, Iran)
Lentivirales Plasmid der dritten Generation (pMD2G)AddgenePlasmid 12259Helfervektor (kommerziell bezogen von der Forschungsabteilung für Molekulare Medizin des Iranischen Akademischen Zentrums für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA-Puffer (TE)DNAbiotechDB9713-100ml
TrypsinSigma-AldrichT9935-50MG1x Arbeitslösungen (pH 7,4– 7.6)

Referenzen

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Lentivirale Vektorenstrobilierte W rmerEchinokokkoseIsolation von Protoskolezesbiphasische KulturGentransferFluoreszenzmikroskopieBandwurmgenetik

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