In vitro Differenzierung humaner dendritischer Zellen und ihrer Marker bei Leishmania-Infektionen

Zusammenfassung

Dendritische Zellen (DCs) sind wesentliche Bestandteile der angeborenen Immunität gegen Leishmanien-Infektionen. Die Mechanismen, die der komplexen Interaktion zwischen DCs und Leishmanien zugrunde liegen, sind nach wie vor wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um zu bewerten, wie sich eine Leishmaniose-Infektion auf die immunbiologische Funktion menschlicher DCs auswirkt, wie z.B. die migrationsbedingte und kostimulatorische Molekülexpression.

Zusammenfassung

Die Leishmaniose umfasst eine Sammlung klinischer Manifestationen, die mit der Infektion obligat intrazellulärer Protozoen, der Leishmaniose, assoziiert sind.Der Lebenszyklus von Leishmania-Parasiten besteht aus zwei sich abwechselnden Lebensstadien (Amastigoten und Promastigoten), in denen sich die Parasiten entweder in Arthropodenvektoren bzw. in Wirbeltierwirten aufhalten. Insbesondere die komplexen Wechselwirkungen zwischen Leishmania-Parasiten und mehreren Zellen des Immunsystems beeinflussen den Ausgang der Infektion erheblich. Wichtig ist, dass, obwohl bekannt ist, dass Makrophagen die Hauptwirtsnische für die Leishmania-Replikation sind, Parasiten auch von anderen angeborenen Immunzellen wie Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) phagozytiert werden.

DCs spielen eine wichtige Rolle bei der Überbrückung des angeborenen und des adaptiven Zweigs der Immunität und orchestrieren so Immunantworten gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern. Die Mechanismen, durch die Leishmanien und DCs interagieren, bleiben unklar und umfassen Aspekte der Erregereinfangung, der Dynamik der DC-Reifung und -Aktivierung, der DC-Migration zu drainierenden Lymphknoten (dLNs) und der Antigenpräsentation in T-Zellen. Obwohl eine große Anzahl von Studien die Vorstellung unterstützt, dass DCs eine doppelte Rolle bei der Modulation der Immunantwort gegen Leishmanien spielen, ist die Beteiligung dieser Zellen an der Anfälligkeit oder Resistenz gegen Leishmanien nach wie vor wenig verstanden. Nach der Infektion durchlaufen DCs einen Reifungsprozess, der mit der Hochregulierung des Oberflächen-Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) II zusätzlich zu kostimulatorischen Molekülen (nämlich CD40, CD80 und CD86) verbunden ist.

Das Verständnis der Rolle von DCs für den Infektionsverlauf ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer und prophylaktischer Strategien zur Modulation der Immunantwort gegen Leishmanien. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Charakterisierung der Leishmania-DC-Wechselwirkung beschrieben. Dieses detaillierte Protokoll bietet eine Anleitung in den Schritten der DC-Differenzierung, der Charakterisierung von Zelloberflächenmolekülen und Infektionsprotokollen und ermöglicht es den Wissenschaftlern, die DC-Reaktion auf eine Leishmania-Infektion zu untersuchen und Einblicke in die Rolle dieser Zellen im Verlauf der Infektion zu gewinnen.

Einleitung

Bei der Leishmaniose handelt es sich um einen Komplex vernachlässigter Krankheiten, die durch verschiedene Arten der Gattung¹ der Leishmania verursacht werden. Leishmania ist ein intrazelluläres Protozoon aus der Familie der Trypanosomatidae, das Menschen und andere Säugetiere infiziert und ein Spektrum von Krankheiten verursacht, die von Hautläsionen bis hin zu viszeralen Formen reichen². Die wichtigsten klinischen Manifestationen dieser Krankheit sind die tegumentäre Leishmaniose (TL) und die viszerale Leishmaniose (VL). Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass jährlich 700.000 bis 1 Million neue Fälle auftreten, die jedes Jahr 70.000 Todesfälle verursachen². Weltweit sind etwa 12 bis 15 Millionen Menschen von Leishmaniose betroffen, und 350 Millionen sind gefährdet, an der Krankheit zu erkranken³.

Die Gattung Leishmania weist zwei evolutionäre Formen auf: die Promastigote und die Amastigote⁴. Leishmania promastigotes zeichnen sich durch das Vorhandensein von Flagellen und eine hohe Beweglichkeit aus. Diese Formen kommen im Verdauungstrakt der Sandmücke vor, wo sie sich in die infektiöse Form (metazyklische Promastigoten) ^{differenzieren5}. Im Gegensatz dazu kommen Amastigoten in der intrazellulären Umgebung infizierter Säugetierzellen vor. Diese evolutionäre Form wiederum repliziert sich in den Phagolysosomen phagozytärer Zellen⁶.

Der Übertragungszyklus von Leishmania spp. beginnt während der Blutfütterung, wenn Sandmücken metazyklische Promastigoten in die Haut des Wirts impfen¹. Kurz nach der Leishmanien-Impfung phagozytieren angeborene Immunzellen, darunter Neutrophile und geweberesidente Makrophagen, die Parasiten. In parasitophoren Vakuolen differenzieren sich Leishmanien zu Amastigoten und replizieren sich, was in einem Bruch der Wirtszellmembran gipfelt, der die Infektion benachbarter Zellen und die Ausbreitung des Parasiten ermöglicht⁴. Der Zyklus wird abgeschlossen, wenn Phlebotomine Amastigoten-haltige Fresszellen aufnehmen, die sich im Darmtrakt des Insekts zu prozyklischen Promastigoten und später zu metazyklischen Promastigoten differenzieren⁷.

Dendritische Zellen, professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die in Geweben und Lymphknoten vorkommen, fungieren als Wächter für das Immunsystem⁸. Diese Zellen befinden sich in peripheren Geweben in unreifen Stadien und sind hauptsächlich an der Antigeneinfangung und -verarbeitung beteiligt. Nach dem Kontakt mit Krankheitserregern durchlaufen DCs einen Reifungsprozess, der in ihrer Wanderung in die Lymphknoten gipfelt und anschließend Antigene an naive CD4⁺ T-Zellen präsentiert. Diese Zellen sind auch wichtig für die Orchestrierung der angeborenen und adaptiven Immunantworten, die Toleranz oder Entzündungen erzeugen⁹. Der DC-Reifungsprozess umfasst mehrere Aspekte, darunter eine erhöhte Expression von MHC und kostimulatorischen Molekülen wie CD40 und CD86 sowie eine erhöhte Zytokinsekretion. DCs exprimieren unterschiedliche Marker, darunter CD11b und CD11c, und beim Menschen exprimieren die DCs, die von CD14⁺ -Monozyten (moDCs) stammen, CD1a¹⁰. CCR7 wird auf DCs stark exprimiert und deutet auf den komplexen Migrationsprozess dieser Zellen hin¹². CD209 und CD80 spielen auch eine wichtige Rolle beim Erstkontakt mit DCs und Lymphozyten¹³.

Bei Leishmaniose deuten Studien darauf hin, dass moDCs Parasiten phagozytieren und sie an die drainierenden Lymphknoten (dLNs) abgeben, wo sie Antigene an T-Zellen abgeben¹³. Der Mechanismus des Parasitenfangs ist mit der Reorganisation des Zytoskeletts durch Aktinfilamente während der Phagozytose verbunden, was die Internalisierung des Parasiten fördert¹⁴. Die meisten Studien über die Rolle von DCs bei Leishmaniose konzentrierten sich auf L. major, L. amazonensis und L. braziliensis¹⁵. Interessanterweise haben in vivo Studien zur Leishmaniose-Infektion gezeigt, dass die Beeinträchtigung der DC-Funktion auf parasitenstammspezifische Weise auftritt.

Es wurde gezeigt, dass DCs in den frühen Stadien der L . amazonensis-Infektion eine verminderte Fähigkeit aufweisen, Parasiteninfektionen einzudämmen. Umgekehrt wurde in einem experimentellen Modell der L . braziliensis-Infektion gezeigt, dass DCs geeignete Immunantworten auslösten, die das Überleben der Leishmania einschränkten¹⁶. Die wichtigsten Aspekte, von denen bekannt ist, dass sie mit unterschiedlichen Reaktionen auf eine Leishmania spp. -Infektion verbunden sind, sind der Grad der DC-Reifung und -Aktivierung. In dieser Arbeit wird eine Methode beschrieben, um die Rolle menschlicher DCs bei Leishmania-Infektionen zu untersuchen, um besser zu verstehen, wie diese Zellen den Krankheitsverlauf beeinflussen.

Protokoll

HINWEIS: Die Zellen wurden von gesunden freiwilligen Spendern gewonnen. Das hier beschriebene Verfahren wurde von der Nationalen Ethikkommission (Nummer 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, Brasilien) genehmigt.

1. Differenzierung humaner dendritischer Zellen

1. Pipettieren Sie 10 ml Polysaccharose-Natriumtriazoat-Gemisch in konischen 50-ml-Röhrchen.
2. Beschriften Sie die konischen 50-ml-Röhrchen jeweils für jeden Spender.
3. Entnehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern und führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Laminar-Flow-Haube durch.
4. Füllen Sie das Blut vorsichtig in die konischen Röhrchen und verdünnen Sie das Blut in Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid) im Verhältnis 1:1 bei Raumtemperatur.
5. Das langsam verdünnte Blut auf das Polysaccharose-Natriumtriazoat-Gemisch in den Röhrchen aufschichten (Schritt 1.1). Die Röhrchen einmal bei 400 × g für 30 min bei 25 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: Schalten Sie die Bremse vor dem Zentrifugieren aus, um eine Vermischung von Gradientenschichten zu verhindern. Nach der ersten Zentrifugation die Temperatur in der Zentrifuge auf 4 °C senken.
6. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.
7. Achten Sie in der Probe auf den Ring, der von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gebildet wird (Buffy Coat); Saugen Sie das restliche Plasma vorsichtig mit einer Pipette ab.
   HINWEIS: Die Zentrifugation führt zur Bildung der folgenden Gradientenschichten: Erythrozyten, Dichtegradientenmedium, PBMC-Ring und Plasma. Der PBMC-Ring befindet sich zwischen dem Dichtegradientenmedium und den Plasmaschichten.
8. Übertragen Sie die trübe PBMC-Schicht in ein anderes Röhrchen und fügen Sie Kochsalzlösung zu einem Endvolumen von 30 mL hinzu.
9. Die Röhrchen mit den Zellsuspensionen werden bei 250 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Kochsalzlösung hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren.
10. Entnehmen Sie ein Aliquot für die Zellzählung und verdünnen Sie es 1:1.000. Verwenden Sie 10 μl der verdünnten Zellen zur Zählung der Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode unter Verwendung einer Neubauer-Kammer, um die Zellviabilität zu bestimmen.
11. Die Suspension erneut bei 200 × g für 10 min unter 4 °C schleudern.
12. Resuspendieren Sie das Pellet in einem MACS-Puffer (magnetic-activated cell sorting). Verwenden Sie 80 μl des Puffers pro 1 × 10⁷ Zellen.
    HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Zusammensetzung des MACS-Puffers. Den Puffer kalt halten und bei 2-8 °C lagern.
13. CD14-Mikrokügelchen zu der in Schritt 1.9 hergestellten Zellsuspension geben. Verwenden Sie 20 μl CD14-Mikrokügelchen pro 1 × 10⁷ Zellen.
    HINWEIS: CD14-Mikrokügelchen werden verwendet, um menschliche Monozyten positiv von PBMCs zu selektieren, da Beads, die humane Anti-CD14-Kügelchen enthalten, an CD14⁺ -Zellen binden, die auf den Oberflächen der meisten Monozyten exprimiert werden.
14. Pipettieren Sie auf und ab, um die Pellets und Mikrokügelchen gleichmäßig zu resuspendieren. 15 Minuten auf Eis halten.
15. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
16. Resuspendieren Sie die Zellen im MACS-Puffer. Verwenden Sie 1-2 mL pro 1 × 10⁷ Zellen in der Zell-Mikrokügelchen-Mischung.
17. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
18. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl MACS-Puffer.
    HINWEIS: Dies ist das maximale Volumen der Zellsuspension, das in einer Spalte verarbeitet werden soll.
19. Montieren Sie die Magnetsäule.
20. Waschen Sie die Säule einmal mit 500 μl MACS-Puffer und lassen Sie den Puffer unter Schwerkraft durch die Säule fließen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Säule nicht austrocknet, da Luft die Säule verstopfen kann.
21. Pro Säule werden 500 μl der Zellbead-Suspension (Schritt 1.19) zugegeben. Lassen Sie die Zellsuspension unter der Schwerkraft durch die Säule fließen.
22. Waschen Sie die Säule mit 500 μl MACS-Puffer (2x). Fügen Sie nur dann frischen Puffer hinzu, wenn das Säulenreservoir leer ist. Lassen Sie die Säule nicht trocknen.
23. Platzieren Sie ein neues Röhrchen unter der Säule, pipettieren Sie 1 ml des MACS-Puffers auf die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus der Säule, indem Sie den Kolben fest drücken.
24. Die CD14-angereicherten Zellen werden bei 300 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
25. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer.
26. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem RPMI mit 100 μl/ml Interleukin-4 (IL-4) ( (50 ng/ml) + Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) (50 ng/ml).
27. Saatzellen auf einer 24-Well-Platte in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 500 μl vollständigem RPMI-Medium, das die oben genannten Zytokine enthält, und 7 Tage lang bei 37 °C inkubieren.

2. Leishmania-Kultur

HINWEIS: In diesem Test wurden L . amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125)-Parasiten verwendet.

1. Promastigoten werden auf Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) Blut-Agar-Medium mit 5 ml Schneider's Complete Medium oder Minimum Essential Medium (MEM) in einer 25^{cm 2} Kulturflasche in einem Inkubator mit Bio-Oxygen Demand (BSB) bei 24 °C gehalten.
   HINWEIS: Zur Kultivierung der promastigoten Form der Spezies L. amazonensis wurden 5 ml des Schneider-Komplettmediums (Schneider's Insect Medium mit 10 % inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und Gentamicin in einer Konzentration von 50 μg/ml) verwendet.
2. 7 Tage bei 24 °C im BSB-Inkubator inkubieren.
3. 100 μl Promastigoten-Kultur in einen neuen 25-cm-2-Zell-Kulturkolben pipettieren.
4. Fügen Sie 5 ml des supplementierten MEM hinzu.
5. Inkubieren Sie bei 24 °C im BSB-Inkubator und zählen Sie periodisch die Promastigoten, indem Sie ein Aliquot der mit Kochsalzlösung verdünnten Parasitenzellsuspension in eine Neubauer-Kammer (d. h. ein Hämozytometer) überführen, bis die stationäre Phase erreicht ist.
   HINWEIS: Verwenden Sie den ersten Durchgang nach NNN Medium nicht für Experimente.
6. Übertragen Sie 1 × 10⁵ Promastigoten aus der stationären Wachstumsphase von Leishmania in einen neuen 25 cm 2-Zellkulturkolben und fügen Sie 5 ml des supplementierten MEM hinzu.
7. Überwachen Sie das Wachstum der Kulturen regelmäßig mit einer Neubauer-Kammer, bis die stationäre Phase erreicht ist.
   HINWEIS: Verwenden Sie Promastigoten-Kulturen für bis zu 7 Passagen in vitro , um Virulenzverlust zu vermeiden.

3. Leishmania-Infektion

1. Nachdem Sie das stationäre Wachstum von kultivierten Parasiten überprüft haben, entfernen Sie den gesamten Inhalt aus den Kulturflaschen und geben Sie sie in konische 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie kalte Kochsalzlösung hinzu, um ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen.
2. Dreimal 10 min bei 4 °C bei 1.600 × g zentrifugieren. Der Überstand wird nach dem Zentrifugieren verworfen und das Pellet in einer kalten Kochsalzlösung wieder suspendiert.
3. Waschen Sie die Zellen, um nicht lebensfähige Parasiten zu entfernen, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml kalter Kochsalzlösung. Führen Sie die Suspension 5 Mal langsam durch eine 1-ml-Spritze, die mit einer 16-G-Nadel versehen ist, um Parasitencluster zu trennen.
4. Entnehmen Sie ein Aliquot aus der Probe, um die Parasitenkonzentration in einem Hämozytometer mit Gl (1) zu zählen.
   Parasitenkonzentration = Mittelwert der Parasiten in 4 Quadranten × Verdünnungsfaktor × 10⁴ (1)
5. Berechnen Sie die Menge von Leishmania sp. erforderlich für die Anzahl der Wirtszellen, die plattiert werden müssen, um ein Parasit-Wirt-Zell-Verhältnis von 10:1 aufrechtzuerhalten (Schritt 1.27).
6. Waschen Sie die DCs, indem Sie 1 mL Kochsalzlösung hinzufügen und die Zellen dreimal bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
7. Geben Sie das erforderliche Volumen Leishmania in jede Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte (siehe Schritt 3.5).
8. Die DCs mit Parasiten werden 4 h lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ -Atmosphäre inkubiert.

4. Immunfärbung für die Durchflusszytometrie-Analyse

1. Waschen Sie die Zellen nach der Infektion zweimal mit 1 ml Kochsalzlösung, um nicht internalisierte Parasiten zu entfernen.
   HINWEIS: Das Panel mit Antikörperklonen und Fluorochromen ist in der Materialtabelle aufgeführt.
2. Antikörper (1:50) in Puffer für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) (1x PBS mit 1 % BSA) bei einem Endvolumen von 50 μl pro Versuchsbedingung verdünnen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, Antikörper vor dem Experimentieren zu titrieren, um optimale Färbekonzentrationen zu gewährleisten. In diesem Protokoll wurde 1:50 nach Titrationsexperimenten verwendet.
3. Bereiten Sie einen Mastermix vor (1x PBS mit 1% BSA + Antikörpermix). Vortex und pipettieren Sie 50 μl der Mischung in Vertiefungen, die Zellen enthalten.
4. Inkubieren Sie die DCs mit dem Antikörper-Mix (Anti-Human-CD1a, Anti-Human-CCR7, Anti-Human-CD83, Anti-CD11c, Anti-Human-CD209, Anti-Human-HLA-DR) 30 min lang kurz auf Eis lichtgeschützt.
5. Die Zellen zweimal mit 1 mL Kaltfärbepuffer (1 % FBS in 1x PBS) waschen und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
6. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in 200 μl Kaltfärbepuffer resuspendiert.
7. Fahren Sie mit der Datenerfassung auf einem Durchflusszytometer fort.
   HINWEIS: Um optimale Bedingungen für die FACS-Analyse zu gewährleisten, sollte die Datenerfassung innerhalb von 48 Stunden nach der Probenfärbung durchgeführt werden. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software analysiert.
   1. Öffnen Sie das FlowJo-Softwareprogramm und erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich. Fügen Sie die zu analysierenden Durchflusszytometrie-Dateien hinzu, indem Sie sie in das Arbeitsbereichsfenster ziehen.
   2. Klicken Sie auf den Röhrennamen , um die Parameter Lateral Scatter (SSC) und Forward Scatter (FSC) auszuwählen.
      HINWEIS: Die durchflusszytometrische Analyse der DC-Reifung basierte auf der Expression von CD1a, CD11c, CD80, CCR7, CD209 und HLA-DR.
   3. Zeichnen Sie mit dem Polygon-Gating-Werkzeug ein Tor um die DCs. Doppelklicken Sie auf die ausgewählten Gated Cells, um ein neues Fenster anzuzeigen. Führen Sie die Dublettenbereinigung durch, indem Sie die Parameter FSC-A und FSC-H auswählen. Zeichnen Sie mit dem Polygonwerkzeug ein neues Diagramm um einzelne Zellen.
   4. Doppelklicken Sie auf die Gated Cells und wählen Sie die Parameter SSC und CD11c, um ein Gate mit CD11c⁺ -Zellen zu generieren.
   5. Exportieren Sie das gereinigte CD11c⁺ -Cell-Gate, indem Sie es auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Tor und wählen Sie die Option Äquivalente Knoten auswählen . Klicken Sie mit der rechten Maustaste und exportieren Sie das Gate zusammen mit allen kompensierten Parametern, indem Sie es in einem kürzlich erstellten Ordner speichern.
   6. Erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich, indem Sie die zuletzt gespeicherten Dateien öffnen. Klicken Sie auf Workspace und wählen Sie Plugins | Stichprobe | 30.000 bis 50.000 Ereignisse; Drücken Sie OK.
      HINWEIS: Da TSNE sowohl ein zeitaufwändiger als auch rechenintensiver Prozess ist, wird dieser Schritt empfohlen, um die Gesamtzahl der analysierten Ereignisse zu reduzieren.
   7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine heruntergerechnete Datei und wählen Sie die entsprechenden Knoten aus.
   8. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine heruntergerechnete Datei, und wählen Sie Exportieren/Verketten aus.
   9. Klicken Sie auf das Verkettungsfenster und wählen Sie alle kompensierten Parameter aus. Wählen Sie die verketteten Dateien aus und klicken Sie auf Arbeitsbereich | Plugin | tSNE.
   10. Wählen Sie die gewünschten Parameter (CD1a, HLA-DR, CCR7, CD80, CD209 und CD11c) aus, um Cluster zu erstellen. Drücken Sie OK.
   11. Klicken Sie auf die verkettete Datei, um die Parameter tSNE1 und tSNE2 zu visualisieren.

5. Aktin-Immunfärbung

1. Platteninfizierte DCs auf Deckgläsern, die in 24-Well-Platten platziert sind. Die Platten bei 300 × g bei 4 °C 10 min zentrifugieren. Waschen Sie die Zellen nach der Infektion 3x mit steriler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, um extrazelluläre Parasiten zu entfernen.
2. Inkubieren Sie die DCs mit 500 μl 4%igem Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und fügen Sie 1 ml Kochsalzlösung hinzu (siehe Tabelle 1).

6. Immunmarkierung

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter Rühren durch.

1. Waschen Sie die Deckgläser 5 min lang mit 1x PBS; 3x wiederholen. Fügen Sie 500 μl Ammoniumchloridlösung pro Vertiefung hinzu; 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Waschen Sie die Deckgläser 5 min lang mit 1x PBS; 3x wiederholen.
3. Permeabilisieren Sie die Membran mit 0,15% Saponin für 15 min.
4. Block für 1 h mit 1x PBS 1x/3% BSA/0,15% Saponin. Waschen Sie die Deckgläser 5 min lang mit 1x PBS/0,15% Saponin; 3x wiederholen.
5. Inkubieren Sie die Zellen 1 h lang mit Phalloidin (1:1.200), verdünnt in 1x PBS/1% BSA/0,15% Saponin. Waschen Sie die Deckgläser 5 min lang mit 1x PBS/0,15% Saponin; 3x wiederholen.
6. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach unten auf ein Eindeckmedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Decken Sie die Dias mit Alufolie ab, um sie vor Licht zu schützen.
7. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einem 63x/1,4-Objektiv auf.

7. Konfokale Mikroskopie und Fidschi-Quantifizierung

1. Nehmen Sie Immunfluoreszenzbilder mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop auf (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Für eine optimale Auflösung verwenden Sie eine 63-fache Objektiv-Öl-Immersionslinse.
2. Schützen Sie die Deckgläser vor Licht und lassen Sie sie vor dem Erwerb mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Verwenden Sie ein saugfähiges Tuch, um die Deckgläser zu reinigen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv und legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie das 63x Objektiv mit Öl aus, heben Sie die Plattform an, bis das Öl den Objektträger berührt, und stellen Sie den Fokus am Mikroskop ein.
4. Öffnen Sie das Programm und aktivieren Sie die Laserwellenlängen 488, 552 und 405 nm.
5. Stellen Sie die Bildauflösung auf 1024 x 1024 Pixel ein.
6. Klicken Sie auf Live Bottom, stellen Sie den Z-Stack ein und drücken Sie Begin. Wiederholen Sie diesen Vorgang, und drücken Sie dann die Schaltfläche Ende .
7. Warten Sie, bis die Bildaufnahme abgeschlossen ist, und wählen Sie dann die Option Maximale Projektion in den Werkzeugen.
8. Speichern Sie das Experiment, und exportieren Sie Bilder im LIF-Format auf einen Computer.
9. Öffnen Sie das FIJI-Programm, öffnen Sie das Experiment in FIJI, und legen Sie den View-Stack auf Hyperstack fest.
10. Geöffnete Bilddateien einzeln auswählen | Kacheln zusammenfügen.
11. Wählen Sie das Freihand-Werkzeug in der Symbolleiste "Fidschi " aus, und zeichnen Sie jede Zelle sorgfältig von Hand nach. Drücken Sie auf Analysieren | Messen , um die Fluoreszenzintensität zu visualisieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zellentyp pro Gruppe.
12. Speichern Sie die Messungen und exportieren Sie sie in eine Tabelle. Öffnen Sie die Datei mit den Daten mit einer statistischen Analysesoftware (siehe Materialtabelle), um eine statistische Analyse durchzuführen.

8. Statistische Auswertung

1. Öffnen Sie ein neues Projekt in der Software.
2. Verwenden Sie für Daten mit Normalverteilung den t-Test von Student. Verwenden Sie für nichtparametrische Daten den Mann-Whitney-U-Test.
3. Fügen Sie die aus den Versuchsergebnissen erhaltenen Werte in die Tabelle ein.
4. Wählen Sie Deskriptive Statistik und wählen Sie die Option Spalte Statistik [alle Tests], um die Datenverteilung zu analysieren.
   HINWEIS: Wenn die Daten der Gaußschen Verteilung folgen, wählen Sie t-Test, um Stichproben durch den Vergleich zweier Paare zu untersuchen. Wenn die Verteilung nicht Gauß ist, analysieren Sie die Daten mit dem Mann-Whitney-U-Test mit zentralen Tendenzmaßen (Mittelwerte oder Mediane) und Variationsmaßen.
5. Wählen Sie die beste Diagrammoption für eine optimale Datendarstellung.

Ergebnisse

In diesem Bericht wird die Rolle von DCs bei Leishmania-Infektionen mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Zunächst wurde das phänotypische Profil des humanen Monozyten-abgeleiteten DC erstellt. Bemerkenswert ist, dass die erhaltenen dendritischen CD11c⁺-Zellpopulationen positiv für CCR7, CD209, CD80, CD1a und HLA-DR waren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression dieser Marker in DC-Populationen stark von der Leishmania-Infektion beeinflusst wird. In...

Diskussion

Leishmaniose ist weltweit ein schwerwiegendes Problem für die öffentliche Gesundheit. Die Pathogenese dieser Krankheit ist recht komplex, und die Mechanismen, die das Überleben von Parasiten in Wirbeltierwirten begünstigen, sind nach wie vor schwer fassbar¹⁷. DCs sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die im ganzen Körper vorkommen, einschließlich filtrierender und lymphatischer Organe. Nach dem Einfangen und Verarbeiten von Antigenen durchlaufen unrei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
anti CCR7	Thermo
anti CD209	Isofarma
anti CD83	Leica SP8
anti HLA-DR	Gibco
Rinderserumalbumin	Thermo	A2153-100G	Sigma
Ciprofloxacin	Gibco
konfokales	Mikroskop Thermo Fisher Scientific
Fötales Rinderserum	Gibco
Flow Jo	Thermo Fisher Scientific
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific
Glutamin	Gibco
HEPES	Thermo Fisher Scientific
Phalloidin	Thermo Fisher Scientific
Phosphatpufferlösung	Peprotech
prolong gold antifade kit	BD pharmigen
RPMI	BD pharmigen
Saponin	BD pharmigen	47036 – 50G – F	Sigma
Schneiders Insektenmedium	Software BD biosciences