Method Article

Lichtinduzierte GFP-Expression in Zebrafischembryonen mit dem optogenetischen TAEL/C120-System

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit vielfältigen Anwendungen. Dieses Protokoll zeigt, wie eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen mit dem blaulichtempfindlichen TAEL/C120-System erreicht werden kann.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induzierbare Genexpressionssysteme sind ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung biologischer Prozesse. Optogenetische Expressionssysteme können eine präzise Kontrolle über das Timing, den Ort und die Amplitude der Genexpression mit Licht als induzierendem Mittel ermöglichen. In diesem Protokoll wird ein optogenetisches Expressionssystem verwendet, um eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen zu erreichen. Dieses System basiert auf einem künstlichen Transkriptionsfaktor namens TAEL, der auf einem natürlich vorkommenden lichtaktivierten Transkriptionsfaktor des Bakteriums E. litoralisbasiert. Bei blauer Beleuchtung dimerisiert TAEL, bindet an sein verwandtes regulatorisches Element namens C120 und aktiviert die Transkription. Dieses Protokoll verwendet transgene Zebrafischembryonen, die den TAEL-Transkriptionsfaktor unter der Kontrolle des allgegenwärtigen Ubb-Promotors exprimieren. Gleichzeitig treibt das regulatorische Element C120 die Expression eines fluoreszierenden Reportergens (GFP) an. Mit einem einfachen LED-Panel zur Abgabe von aktivierendem blauem Licht kann die Induktion der GFP-Expression erst nach 30 Minuten Beleuchtung erkannt werden und erreicht nach 3 Stunden Lichtbehandlung einen Höhepunkt von mehr als 130-facher Induktion. Die Expressionsinduktion kann mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) und fluoreszenzmikroskopischer Mikroskopie beurteilt werden. Diese Methode ist ein vielseitiger und einfach zu bedienender Ansatz für die optogenetische Genexpression.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induzierbare Genexpressionssysteme helfen, die Menge, den Zeitpunkt und den Ort der Genexpression zu kontrollieren. Es war jedoch eine Herausforderung, eine genaue räumliche und zeitliche Kontrolle in mehrzelligen Organismen zu erreichen. Die zeitliche Kontrolle wird am häufigsten durch Zugabe von niedermolekularen Verbindungen1 oder Aktivierung von Hitzeschockpromotoren2erreicht. Dennoch sind beide Ansätze anfällig für Probleme des Timings, der Induktionsstärke und der Stressreaktionen außerhalb des Ziels. Die räumliche Kontrolle wird hauptsächlich durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotorenerreicht 3, aber dieser Ansatz erfordert einen geeigneten Promotor oder ein regulatorisches Element, die nicht immer verfügbar sind, und es ist nicht förderlich für die Induktion auf Untergewebeebene.

Im Gegensatz zu solchen herkömmlichen Ansätzen haben lichtaktivierte optogenetische Transkriptionsaktivatoren das Potenzial für eine feinere räumliche und zeitliche Kontrolle der Genexpression4. Das blaulichtempfindliche TAEL/C120-System wurde für den Einsatz in Zebrafischembryonen5,6entwickelt und optimiert. Dieses System basiert auf einem endogenen lichtaktivierten Transkriptionsfaktor aus dem Bakterium E. litoralis7,8. Das TAEL/C120-System besteht aus einem Transkriptionsaktivator namens TAEL, der eine Kal-TA4-Transaktivierungsdomäne, eine blaulichtempfindliche LOV-Domäne (Light-Oxygen-Voltage Sensing) und eine Helix-Turn-Helix (HTH) DNA-Bindungsdomäne5enthält. Wenn sie beleuchtet werden, durchlaufen die LOV-Domänen eine Konformationsänderung, die es zwei TAEL-Molekülen ermöglicht, zu dimerisieren, an einen TAEL-responsiven C120-Promotor zu binden und die Transkription eines nachgeschalteten Gens von Interesseeinzuleiten 5,8. Das TAEL/C120-System weist eine schnelle und robuste Induktion mit minimaler Toxizität auf und kann durch verschiedene Lichtabgabemodalitäten aktiviert werden. Vor kurzem wurden Verbesserungen am TAEL/C120-System vorgenommen, indem ein nukleares Lokalisierungssignal zu TAEL (TAEL-N) hinzugefügt und das C120-Regulationselement an einen cFos-Basalpromotor (C120F) gekoppelt wurde(Abbildung 1A). Diese Modifikationen verbesserten die Induktion um mehr als das 15-fache6.

In diesem Protokoll wird ein einfaches LED-Panel verwendet, um das TAEL / C120-System zu aktivieren und die allgegenwärtige Expression eines Reportergens, GFP, zu induzieren. Die Expressionsinduktion kann qualitativ durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität oder quantitativ durch Messung der Transkriptspiegel mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) überwacht werden. Dieses Protokoll wird das TAEL/C120-System als vielseitiges, einfach zu bedienendes Werkzeug demonstrieren, das eine robuste Regulierung der Genexpression in vivoermöglicht.

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Protocol

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Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California Merced durchgeführt.

1. Zebrafischkreuzung und Embryonentnahme

  1. Halten Sie separate transgene Zebrafischlinien aufrecht, die entweder den TAEL-Transkriptionsaktivator oder das C120-kontrollierte Reportergen enthalten, um eine falsche Aktivierung zu minimieren.
  2. Kreuzen Sie 6-8 erwachsene Zebrafische aus jeder Linie mit Standardmethoden9, um doppelte transgene Embryonen zu erzeugen, die sowohl die TAEL- als auch die C120-Komponente enthalten (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Alternativ können beide Komponenten transient durch Mikroinjektion von mRNA oder Plasmid-DNA mit Standardmethoden exprimiert werden10.
  3. Sammeln Sie Embryonen in Petrischalen, die Eiwasser enthalten (60 μg / ml Instant Ocean Meersalz, gelöst in destilliertem Wasser), wobei etwa 30 Embryonen pro Zustand getestet werden müssen.
  4. Stellen Sie das Geschirr in eine lichtdichte Box oder decken Sie es mit Aluminiumfolie ab, um eine unbeabsichtigte Aktivierung durch Umgebungslicht zu minimieren (siehe Tabelle 1).

2. Globale Lichtinduktion

  1. Verwenden Sie ein Blaulicht-LED-Panel (465 nm), um mehrere Embryonen gleichzeitig aktivierendes blaues Licht zu liefern.
  2. Positionieren Sie das LED-Panel relativ zu den Petrischalen, die Embryonen enthalten, so dass die tatsächliche Lichtleistung, die von den Embryonen empfangen wird, ungefähr 1,5 mW/ cm2 beträgt, gemessen mit einem Lichtleistungs- und Energiemessgerät (Abbildung 2A).
  3. Pulsieren Sie das Licht in Abständen von 1 h ein / 1 h aus mit einem Timerrelais, wenn Sie mehr als 3 h leuchten, um das Risiko einer Fotoschäden für den TAEL-Transkriptionsaktivator zu reduzieren5,8.
    HINWEIS: Die genaue Beleuchtungsdauer muss möglicherweise für bestimmte Anwendungen optimiert werden. In diesem Protokoll werden Beispiele für Beleuchtungsdauern von 30 min, 1 h, 3 h und 6 h bereitgestellt.
  4. Entfernen Sie die Deckel der Petrischale, um die Lichtstreuung durch Kondensation zu minimieren.
  5. Legen Sie Petrischalen mit Kontrollembryonen in eine lichtdichte Box oder decken Sie sie mit Aluminiumfolie für dunkle Kontrollen ab.

3. Quantitative Beurteilung der Induktion mittels qRT-PCR

  1. Entfernen Sie Embryonen nach der gewünschten Aktivierungsdauer aus der Beleuchtung.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus 30-50 lichtaktivierten und 30-50 dunklen Embryonen mit einem RNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Kits.
    1. Übertragen Sie die Embryonen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie überschüssiges Eiwasser. Fügen Sie Lysepuffer hinzu und homogenisieren Sie die Embryonen mit einem Kunststoffstößel.
    2. Übertragen Sie das Lysat in eine mit dem Kit bereitgestellte Säule und fahren Sie mit den Anweisungen des Kits fort. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.3 fort oder lagern Sie gereinigte RNA bei -20 °C bis -80 °C.
  3. Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese mit einem cDNA-Synthese-Kit gemäß den Anweisungen des Kits.
    1. Nehmen Sie eine dünnwandige 0,2 ml PCR-Röhrchen, fügen Sie 1 μg RNA zu 4 μL 5x cDNA-Reaktionsmaster-Mix (mit optimiertem Puffer, Oligo-dT und zufälligen Primern sowie dNTPs), 1 μL 20x Reverse Transkriptase-Lösung und nukleasefreiem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzu.
    2. Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler, der wie folgt programmiert ist: 22 °C für 10 min, 42 °C für 30 min, 85 °C für 5 min und dann bei 4 °C halten. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.4 fort oder lagern Sie cDNA bei -20 °C.
  4. Bereiten Sie qPCR-Reaktionen vor, die SYBR Green Enzyme Master Mix, 5-fach verdünnte cDNA (Schritt 3.3) und 325 nM jeder Grundierung für GFP enthalten.
    HINWEIS: Primer, die in diesem Protokoll wie folgt verwendet werden. GFP vorwärts: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP rückseite: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverse: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. Führen Sie qPCR-Reaktionen in einer Echtzeit-PCR-Maschine durch.
    HINWEIS: PCR-Programm: Erstaktivierung bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 1 min bei 72 °C.
  6. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse durch, sobald die PCR abgeschlossen ist, um die Reaktionsspezifität zu bestimmen. Führen Sie für jedes Beispiel drei technische Replikate durch.
  7. Berechnen Sie die lichtaktivierte Induktion als Faltenänderung relativ zu Embryonen, die im Dunkeln gehalten werden, mit der2-ΔΔCt-Methode 11. Die statistische Signifikanz kann mit einem Statistik-Softwarepaket ermittelt werden.

4. Qualitative Beurteilung der Induktion durch Fluoreszenzmikroskopie

  1. Entfernen Sie die Embryonen nach der gewünschten Aktivierungsdauer aus der Beleuchtung.
  2. Immobilisieren Sie Embryonen für die Bildgebung in 3% Methylcellulose mit 0,01% Tricain in Glasdepressionobjektträgern.
  3. Erfassen Sie Fluoreszenz- und Hellfeldbilder auf einem fluoreszierenden Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera verbunden ist, mit Standard-GFP-Filtereinstellungen. Verwenden Sie identische Bilderfassungseinstellungen für alle Samples.
  4. Verschmelzen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder nach der Aufnahme mit einer Bildverarbeitungssoftware.

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Results

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Für diese Demonstration wurde eine C120-responsive GFP-Reporterlinie (Tg(C120F:GFP)ucm107)) mit einer transgenen Linie gekreuzt, die TAEL-N ubiquitär aus dem Ubiquitin b (ubb) -Promotor (Tg (ubb: TAEL-N)ucm113) exprimiert, um doppelte transgene Embryonen zu erzeugen, die beide Elemente enthalten. 24 h nach der Befruchtung wurden die Embryonen der Aktivierung des blauen Lichts ausgesetzt, das mit einer Frequenz von 1 h an / 1 h aus gepulst wurde. Die Induktion der ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des optogenetischen TAEL/C120-Systems, um eine blaulichtinduzierbare Genexpression zu erreichen. Dieses System besteht aus einem Transkriptionsaktivator, TAEL, der bei Beleuchtung mit blauem Licht dimerisiert und die Transkription eines Gens von Interesse nach einem C120-Regulationselement aktiviert. Die induzierte Expression eines GFP-Reporters kann bereits nach 30 Minuten Lichteinwirkung nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz eine relativ schnelle und re...

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Disclosures

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Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Stefan Materna und den Mitgliedern der Woo- und Materna-Labore für hilfreiche Anregungen und Kommentare zu diesem Protokoll. Wir danken Anna Reade, Kevin Gardner und Laura Motta-Mena für wertvolle Diskussionen und Einblicke bei der Entwicklung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) und das University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) an S.W.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender webbasiertes wissenschaftliches IllustrationswerkzeugBioRenderhttps://biorender.com/
Farb-CCD-DigitalkameraLumenara755-107
Kompakte Leistungs- und Energiemesskonsole, Digital 4" LCDThorlabsPM100D
Anregungsfilter, 545 nmOlympusET545/25x
illustra RNAspin Mini KitGE Healthcare95017-491
Instant Ocean MeersalzInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Dimmbare 165 W LED Aquarienleuchte (blau und weiß)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programmierbare digitale ZeitschaltuhrAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR grün Fast MixQuantabio101414-286
Photoshop BildbearbeitungssoftwareAdobe
Prism Grafik- und StatistiksoftwareGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsA28137
StereomikroskopOlympusSZX16
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluoreszenz-LED-LichtquelleExcelitas010-00326RNicht mehr erhältlich. Er wurde durch den X-Cite mini+ ersetzt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

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