Synthetische Antigenkontrollen für die Immunhistochemie

Zusammenfassung

Diese Arbeit dokumentiert eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer Antigenkontrollen für die Immunhistochemie. Die Technik ist an eine Vielzahl von Antigenen in einem breiten Konzentrationsbereich anpassbar. Die Proben bieten eine Referenz zur Beurteilung der Intra- und Inter-Assay-Leistung und Reproduzierbarkeit.

Zusammenfassung

Immunhistochemische (IHC) Assays liefern wertvolle Einblicke in Proteinexpressionsmuster, deren zuverlässige Interpretation gut charakterisierte positive und negative Kontrollproben erfordert. Da nicht immer geeignete Gewebe- oder Zelllinienkontrollen verfügbar sind, kann eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer IHC-Kontrollen von Vorteil sein. Eine solche Methode wird hier beschrieben. Es ist anpassungsfähig an verschiedene Antigentypen, einschließlich Proteine, Peptide oder Oligonukleotide, in einem breiten Konzentrationsbereich. Dieses Protokoll erklärt die Schritte, die notwendig sind, um synthetische Antigenkontrollen zu erstellen, wobei als Beispiel ein Peptid aus der intrazellulären Domäne (ICD) des humanen erythroblastischen Onkogens B2 (ERBB2 / HER2) verwendet wird, das von einer Vielzahl von diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wird. Serielle Verdünnungen des HER2 ICD-Peptids in Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung werden mit Formaldehyd gemischt und 10 min bei 85 °C erhitzt, um das Peptid/BSA-Gemisch zu verfestigen und zu vernetzen. Das resultierende Gel kann wie ein Gewebe verarbeitet, geschnitten und gefärbt werden, was zu einer Reihe von Proben bekannter Antigenkonzentrationen führt, die einen weiten Bereich von Färbeintensitäten abdecken.

Dieses einfache Protokoll steht im Einklang mit routinemäßigen histologischen Laborverfahren. Die Methode erfordert lediglich, dass der Benutzer über eine ausreichende Menge des gewünschten Antigens verfügt. Rekombinante Proteine, Proteindomänen oder lineare Peptide, die für relevante Epitope kodieren, können lokal oder kommerziell synthetisiert werden. Labore, die hauseigene Antikörper erzeugen, können Aliquots des immunisierenden Antigens als synthetisches Kontrollziel reservieren. Die Möglichkeit, gut definierte Positivkontrollen für einen breiten Konzentrationsbereich zu erstellen, ermöglicht es Benutzern, die Leistung von Intra- und Inter-Laboratory-Assays zu bewerten, Einblicke in den Dynamikbereich und die Linearität ihrer Assays zu erhalten und die Assay-Bedingungen für ihre jeweiligen experimentellen Ziele zu optimieren.

Einleitung

Die Immunhistochemie (IHC) ermöglicht den sensitiven und spezifischen, räumlich präzisen Nachweis von Zielantigenen in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten. Die Ergebnisse der IHC-Färbung können jedoch durch mehrere Variablen beeinflusst werden, einschließlich der warmen und kalten Ischämiezeit, der Gewebefixierung, der Gewebevorbehandlung, der Antikörperreaktivität und -konzentration, der Assay-Erkennungschemie und der Reaktionszeiten¹. Dementsprechend erfordern die reproduzierbare Leistung und Interpretation von IHC-Reaktionen eine strenge Kontrolle dieser Variablen und die Verwendung gut charakterisierter positiver....

Protokoll

1. Vorbereitung der Lagerlösung und der Werkzeuge

1. Bereiten Sie 20 ml einer 25% w/v BSA-Lösung vor, indem Sie 5 g BSA-Pulver in 14 ml PBS, pH 7,2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mischen, bis es gleichmäßig dispergiert ist. Vortex nach Bedarf, um das BSA-Pulver zu dispergieren.
   1. Halten Sie die Lösung über Nacht bei 4 °C, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen. Stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 ml ein, um eine 25% w/v Lagerlösung zu erhalten.
2. Bereiten Sie 20 ml einer 31,3% w/v BSA-Lösung vor, indem Sie 6,26 g BSA-Pulver in 13 ml PBS, pH 7,2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mischen, bis es gleichmäßig dispergiert ist....

Ergebnisse

Peptide sollten sich bei Raumtemperatur vollständig in einem geeigneten Lösungsmittel auflösen, um eine optisch klare Lösung zu bilden. Wenn nach 30-60 min noch sichtbares partikuläres Material vorhanden ist, kann es hilfreich sein, zusätzliche Volumina des ursprünglichen Lösungsmittels oder eines alternativen Lösungsmittels hinzuzufügen, das das beabsichtigte Volumen der in Tabelle 1 berechneten 5-fachen Peptidlagerlösung nicht überschreitet. Ebenso sollte die kombinierte Peptid/BSA-Lösung durchscheinen.......

Diskussion

Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, einheitliche Proben der bekannten Zusammensetzung und Antigenkonzentration als Standards für IHC-Reaktionen zu erstellen, wobei Materialien und Techniken verwendet werden, die den meisten Histologielabors vertraut sind. Der wichtigste Schritt besteht darin, das Epitop zu identifizieren, an das der Antikörper von Interesse bindet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines linearen Peptidantigens aus dem ERBB2/HER2-ICD. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um BSA-Gel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-HER2/neu-Klon 4B5	Ventana	5278368001
Biopsiepackungen	Leica	3801090
Rinderserumalbumin, ultrareines	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Einweg-Basisform (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Einweg-Basisform (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Einwegspatel	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	15686
ERBB2 / HER2 Peptid			UniProt P04626-1; u.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetischer Rührstab
NanoZoomer 2.0 HT Ganzdia-Imager	Hamamatsu
10% neutral gepuffertes Formalin	VWR	16004-128
Nukleasefreie Mikrofuge-Röhrchen 1,5 mL
Paraplast Paraffin	Leica	39601006
Peptid Parameterrechner	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptidlieferanten	ABclonal Science		Anwender sollten sich an die Peptidanbieter wenden, um Einzelheiten zu Masse, Reinheit und Kosten zu erfahren.
	Anaspec Peptid-Anwender sollten sich an die Peptidhersteller wenden, um Einzelheiten zu Masse, Reinheit und Kosten zu erfahren.
	CPC Scientific-Anwender sollten sich an die Peptidhersteller wenden, um Einzelheiten zu Masse, Reinheit und Kosten zu erfahren.
	Peptidbenutzer		sollten sich an die Peptidanbieter wenden, um Einzelheiten zu Masse, Reinheit und Kosten zu erfahren.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,2
Reagenz	Alkohol Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positiv geladene Objektträger	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylole	VWR	Artikel-Nr.: 89370-088