Automatisierte Assays mit Multi-Well-Mikroplatten sind vorteilhafte Ansätze zur Identifizierung von Signalwegregulatoren, indem sie die Bewertung einer Vielzahl von Bedingungen in einem einzigen Experiment ermöglichen. Hier haben wir das etablierte Makropinosomen-Bildgebungs- und Quantifizierungsprotokoll an ein 96-Well-Mikroplattenformat angepasst und bieten einen umfassenden Überblick über die Automatisierung mit einem Multimode-Plattenleser.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Makropinozytose ist ein unspezifischer Flüssigkeitsphasenaufnahmeweg, der es Zellen ermöglicht, große extrazelluläre Fracht wie Proteine, Krankheitserreger und Zelltrümmer durch Bulk-Endozytose zu internalisieren. Dieser Signalweg spielt eine wesentliche Rolle bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Regulierung von Immunantworten und des Stoffwechsels von Krebszellen. Angesichts dieser Bedeutung für die biologische Funktion kann die Untersuchung der Zellkulturbedingungen wertvolle Informationen liefern, indem Regulatoren dieses Signalwegs identifiziert und die Bedingungen für die Entdeckung neuartiger therapeutischer Ansätze optimiert werden. Die Studie beschreibt eine automatisierte Bildgebungs- und Analysetechnik unter Verwendung von Standardlaborgeräten und einem zellbildenden Multimode-Plattenleser zur schnellen Quantifizierung des makropinozytären Index in adhärenten Zellen. Die automatisierte Methode basiert auf der Aufnahme von hochmolekularem fluoreszierendem Dextran und kann auf 96-Well-Mikrotiterplatten angewendet werden, um die Beurteilung mehrerer Bedingungen in einem Experiment oder fester Proben auf Glasdeckgläsern zu erleichtern. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Reproduzierbarkeit zu maximieren und die experimentelle Variation zu reduzieren, während er gleichzeitig zeitsparend und kostengünstig ist.
Einleitung
Der unspezifische endozytäre Weg der Makropinozytose ermöglicht es Zellen, eine Vielzahl von extrazellulären Komponenten, einschließlich Nährstoffen, Proteinen, Antigenen und Krankheitserregern, durch Massenaufnahme von extrazellulärer Flüssigkeit und ihren Bestandteilen zu internalisieren1. Obwohl wichtig für die Biologie zahlreicher Zelltypen, wird zunehmend beschrieben, dass der Makropinozytoseweg eine wesentliche Rolle in der Tumorbiologie spielt, wo Tumorzellen durch makropinozytäre Aufnahme in der Lage sind, in Gegenwart einer nährstoffarmen Mikroumgebung zu überleben und sich zu vermehren2,3
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vorbereitung der Materialien
- Lösen Sie 70 kDa Dextran, das mit FITC oder Tetramethylrhodamin (TMR) markiert ist, in PBS, um eine 20 mg/ml-Lösung zu erhalten. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
- DaPI in ddH2O auflösen, um eine 1 mg/ml Lösung zu erhalten. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
VORSICHT: DAPI ist ein potenzielles Karzinogen und sollte mit Vorsicht behandelt werden. - Bereiten Sie am Tag der Fixierung frisches 3,7% ACS-Formaldehyd in PBS zu.
VORSICHT: Formaldehyd ist ein Fixiermittel, bekanntes Karzinogen und ist giftig, wenn es eingeatmet wird. Stellen Sie die Lösung in einem chemischen Abzug her, um ein Einat....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Wenn die Schritte und die Anpassung des oben beschriebenen Protokolls entsprechend befolgt werden, sollten die endgültigen experimentellen Ergebnisse Informationen darüber liefern, ob die untersuchten Zellkulturbedingungen oder Inhibitoren die Makropinozytose in der interessierenden Zelllinie induzieren oder reduzieren. Um die Validität dieser Ergebnisse zu stärken, ermöglicht die Einbeziehung von Kontrollbedingungen die Überprüfung der Ergebnisse, um festzustellen, ob das Experiment erfolgreich abgeschlossen wurde. Makr.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Qualität der Experimente und der Datenerfassung hängt stark von der Qualität der Reagenzien, der Optimierung der Einstellungen und der Sauberkeit der Deckgläser und der Mikrotiterplatte ab. Die Endergebnisse sollten eine minimale Variation zwischen den Replikaten ergeben; Biologische Variationen kommen jedoch natürlich vor oder können anderweitig durch eine Reihe von Faktoren verursacht werden. Die Zelldichte kann dazu führen, dass Zellen mehr oder weniger auf Makropinozytose-Induktoren oder -inhibitoren reagieren. E.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
C.C. ist Erfinder eines erteilten Patents mit dem Titel "Cancer diagnostics, therapeutics, and drug discovery associated with macropinocytosis", Patent Nr.: 9,983,194.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch NIH/NCI-Zuschüsse (R01CA207189, R21CA243701) an C.C unterstützt. KMO.G. erhielt einen TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). Der BioTek Cytation 5 ist Teil des Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, der finanzielle Unterstützung aus dem NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199) erhält. Die Abbildungen 1-3 wurden mit BioRender erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin | Corning | 25053CI | 0,1 % EDTA in HBSS ohne Calcium-, Magnesium- und Natriumbicarbonat |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10 cm Gewebekulturschale | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L | Becherglas Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagenzreservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Becherglas | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Gewebekulturschale | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Kanal-Aspirationsadapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Kanal-Aspirationsadapter für Standardspitzen | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammoniakfreier Glasreiniger | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-Well-High-Content-Screening-Mikroplatte | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Applikator mit Baumwollspitze | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Deckgläser | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysin-fixierbar |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Ohne Calcium- und |
| Magnesiumzange | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont # |
| Formaldehyd, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagenzqualität |
| Glycerin | Fisher BioReagenzien | BP229-1 | |
| Härtungsfluoreszenz-Eindeckmedien | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Salzsäure (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | zertifiziert ACS Plus, 36,5%– 38.0% |
| Fusselfreie Tücher | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope | Objektträger Fisherbrand | 12-544-1 | Premium Glattglas |
| Mehrkanalpipette | Gilson | FA10013 | 8 Kanäle, 0,5– 10 & Mikro; L |
| Mehrkanalpipette | Gilson | FA10012 | 12 Kanäle, 20– 200 & Mikro; L |
| Mehrkanalpipette | Gilson | FA10011 | 8 Kanälen, 20 Kanäle; 200 & Mikro; L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastikfolie | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silikonisolatoren | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Durchmesser x 0,8 mm Tiefe ID, 25 mm x 25 mm |
| Schiebeadapter | Biotek | 1220548 | |
| Waschflasche | Fisherbrand | FB0340922C |
Referenzen
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
