Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.
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Methodenartikel
Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Reisstreifenvirus (RSV), das in Ostasien zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten der Landwirtschaft führt, hängt für seine effektive Übertragung unter wirtseigenem Reis vollständig von Insektenvektoren ab. Laodelphax striatellus (Kleine braune Zwergzikade, SBPH) ist der primäre Insektenvektor, der RSV horizontal überträgt, während er Saft aus dem Phloem saugt. Speichel spielt eine bedeutende Rolle im Fressverhalten von Insekten. Eine praktische Methode, die für die Erforschung des Speichels von Insekten mit piercing-saugendem Fressverhalten nützlich sein wird, wird hier beschrieben. Bei dieser Methode durften sich Insekten von einer künstlichen Diät ernähren, die zwischen zwei gestreckten Paraffinfilmschichten eingeklemmt war. Die Diät, die den Speichel enthielt, wurde jeden Tag gesammelt, filtriert und für weitere Analysen konzentriert. Schließlich wurde die Qualität des gesammelten Speichels durch Proteinfärbung und Immunoblotting untersucht. Diese Methode wurde durch den Nachweis von RSV und einem Mucin-ähnlichen Protein im Speichel von SBPH veranschaulicht. Diese künstliche Fütterungs- und Speichelsammelmethode wird eine Grundlage für die weitere Erforschung von Faktoren im Speichel von Insekten im Zusammenhang mit dem Fressverhalten und der Virusübertragung bilden.
Einleitung
Reisstreifenvirus (RSV), ein negativ gestrandetes RNA-Virus der Gattung Tenuivirus,verursacht schwere Erkrankungen in der Reisproduktion in Ostasien1,2,3. Die Übertragung von RSV von infizierten Reispflanzen auf gesunde pflanzen hängt von Insektenvektoren ab, hauptsächlich Laodelphax striatellus, die RSV persistent-propagierend übertragen. SBPH erwirbt das Virus nach der Fütterung von RSV-infizierten Pflanzen. Einmal im Inneren des Insekts infiziert RSV einen Tag nach der Fütterung die Mitteldarmepithelzelle und passiert dann die Mitteldarmbarriere, um die H....
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Protokoll
1. SBPH-Wartung
- Aufzucht der viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen in einem Glasinkubator (65 x 200 mm) mit 5-6 Reissämlingen(Oryza sativa cv. Nipponbare) pro Glaskammer im Labor. Wachsen Sie die Reispflanzen bei 25 ° C unter einer 16 h hellen / 8 h dunklen Photoperiode.
HINWEIS: Die viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen wurden ursprünglich in der Provinz Jiangsu, China, gefangen. - Nachweis von RSV in SBPH durch dot-enzym-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) mit einem Kaninchen-RSV-spezifischen polyklonalen Antikörper (siehe Materialtabelle), dergegen die RSV-Ribonukleoproteine (RNPs) aufgezogen wurde.
HIN....
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Ergebnisse
Schematische Darstellung der künstlichen Fütterungsanlage und Speichelsammlung
Abbildung 1A zeigt den Glaszylinder (15 cm x 2,5 cm), der als Futterkammer zum Sammeln des Speichels verwendet wird. Zuerst wurden die SBPH-Larven für mehrere Stunden ausgehungert, um die Sammeleffizienz zu verbessern, und dann durch Abkühlen für 5 Minuten immobilisiert. Nachdem die Insekten in den Glaszylinder überführt wurden, wurden beide offenen Enden der Kammer mit gestreckter Paraffinmemb.......
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Diskussion
Die erfolgreiche Aufzucht von Insekten auf künstlicher Diät wurde erstmals 1962 berichtet, als Mittler und Dadd die Paraffinmembrantechnik zur Durchführung einer künstlichen Diät beschrieben29,30. Und diese Methode wurde in vielen Aspekten der Insektenbiologie und des Verhaltens erforscht, zum Beispiel in den Bereichen Nahrungsergänzungsmittel, dsRNA-Fütterung und Virusakquisition. Basierend auf den Anforderungen der Speichelanalyse wird in dieser Studie 5% Sacch.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2019YFC1200503), von der National Science Foundation of China (Nr. 32072385) und von der Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10-KD Zentrifugalfilter | Merck Millipore | R5PA83496 | Für die Konzentration |
| 10x Protein Transfer Buffer (nass) | macGENE | MP008 | Transfer Puffer für Western Blotting |
| 10x TBST Puffer | Coolaber | SL1328-500mL&mal; 10 | Waschpuffer für Western Blotting |
| Azure c600 Biosysteme | Azure Biosystems | Azure c600 | Bildgebungssystem für Western Blotting und Silberfärbung |
| Farbe Vorgefärbte Proteinleiter | GenStar | M221-01 | Proteinmarker für Western Blotting |
| ECL Western Blotting Nachweis Reagenzien | GE | Healthcare RPN2209 | Western Blot Nachweis |
| Enchanced HRP-DAB Chromogen Kit | TIANGEN | Chromogene Reaktion | |
| Meerrettichperoxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper | Sigma | 401393-2ML | Polyklonaler Sekundärantikörper für Western Blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidendifluorid-Membran | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfermembran für Western Blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | Für quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | Für Reverse-transkriptionelle PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0,22 & Mikro; m | Merck Millipore | SLGP033RB | Für die Filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gele | Bio-Rad | 4561043 | Für SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Nachweis der Proteinkonzentration |
| Nylonmembran | PALL | T42754 | Membran für Punkt-ELISA |
| Parafilm M Membran | Sigma | P7793-1EA | Herstellung von künstlicher Diät Sandwiches |
| Kaninchen anti-LssgMP polyklonaler Antikörper gegen LssgMP Peptide | Genstript | Kaninchen primärer anti-LssgMP polyklonaler Antikörper für Western Blotting | |
| Kaninchen anti-RSV polyklonaler Antikörper | Genstript | Kaninchen primärer anti-RSV polyklonaler Antikörper für Western Blotting und Dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | für die RNA-Extraktion |
Referenzen
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....
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Nachdrucke und Genehmigungen
