Methodenartikel

Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung

DOI:

10.3791/62831

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27. August 2021

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Das Reisstreifenvirus (RSV), das in Ostasien zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten der Landwirtschaft führt, hängt für seine effektive Übertragung unter wirtseigenem Reis vollständig von Insektenvektoren ab. Laodelphax striatellus (Kleine braune Zwergzikade, SBPH) ist der primäre Insektenvektor, der RSV horizontal überträgt, während er Saft aus dem Phloem saugt. Speichel spielt eine bedeutende Rolle im Fressverhalten von Insekten. Eine praktische Methode, die für die Erforschung des Speichels von Insekten mit piercing-saugendem Fressverhalten nützlich sein wird, wird hier beschrieben. Bei dieser Methode durften sich Insekten von einer künstlichen Diät ernähren, die zwischen zwei gestreckten Paraffinfilmschichten eingeklemmt war. Die Diät, die den Speichel enthielt, wurde jeden Tag gesammelt, filtriert und für weitere Analysen konzentriert. Schließlich wurde die Qualität des gesammelten Speichels durch Proteinfärbung und Immunoblotting untersucht. Diese Methode wurde durch den Nachweis von RSV und einem Mucin-ähnlichen Protein im Speichel von SBPH veranschaulicht. Diese künstliche Fütterungs- und Speichelsammelmethode wird eine Grundlage für die weitere Erforschung von Faktoren im Speichel von Insekten im Zusammenhang mit dem Fressverhalten und der Virusübertragung bilden.

Einleitung

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Reisstreifenvirus (RSV), ein negativ gestrandetes RNA-Virus der Gattung Tenuivirus,verursacht schwere Erkrankungen in der Reisproduktion in Ostasien1,2,3. Die Übertragung von RSV von infizierten Reispflanzen auf gesunde pflanzen hängt von Insektenvektoren ab, hauptsächlich Laodelphax striatellus, die RSV persistent-propagierend übertragen. SBPH erwirbt das Virus nach der Fütterung von RSV-infizierten Pflanzen. Einmal im Inneren des Insekts infiziert RSV einen Tag nach der Fütterung die Mitteldarmepithelzelle und passiert dann die Mitteldarmbarriere, um die Hämolymphe zu durchdringen. Anschließend breitet sich RSV über die Hämolymphe in verschiedene Gewebe aus und vermehrt sich dann. Nach einer Latenzzeit von etwa 10-14 Tagen nach dem Erwerb kann das Virus in der Speicheldrüse über den sezernierten Speichel auf die gesunden Wirtspflanzen übertragen werden, während SBPH Saft aus dem Phloemsaugt 4,5,6,7,8,9,10 . Ein effizienter Fütterungsprozess und verschiedene Faktoren im Speichel sind für die Ausbreitung von RSV vom Insekt auf die Wirtspflanze unerlässlich.

Es wird angenommen, dass Insektenspeichel, der von Speicheldrüsen abgesondert wird, Insekten, Viren und Wirtspflanzen vermittelt. Hemiptera-Insekten produzieren normalerweise zwei Arten von Speichel: gelierenden Speichel und wässrigen Speichel11,12,13. Gelierender Speichel wird hauptsächlich in das Apoplasma ausgeschieden, um die Bewegung des Stylets zwischen den Wirtszellen aufrechtzuerhalten, und ist auch mit der Überwindung der Pflanzenresistenz und der Immunantworten verbunden14,15,16,17. In der Sondierungsphase der Fütterung sezernieren Insekten intermittieren sie gelierenden Speichel, der sofort oxidiert wird, um einen Oberflächenflansch zu bilden. Dann umschließen einzelne oder verzweigte Hüllen den Stylet, um einen röhrenförmigen Kanal18,19,20zu reservieren. Es wird angenommen, dass der Oberflächenflansch an der Epidermis das Eindringen in den Stylet erleichtert, indem er als Ankerpunkt dient, während die Ummantelungen um den Stylet mechanische Stabilität und Schmierung bieten können16,21,22,23. Nlshp wurde als essentielles Protein für die Speichelscheidenbildung und die erfolgreiche Fütterung der braunen Zwergzikade(Nilaparvata lugens,BPH) identifiziert. Die Hemmung der Expression des strukturellen Mantelproteins (SHP), das von der Blattlaus Acyrthosiphon pisum sezerniert wird, reduzierte seine Fortpflanzung, indem die Fütterung aus wirtsiebröhren unterbrochen wurde24. Darüber hinaus sollen Gelspeichelfaktoren bei einigen Insektenarten pflanzliche Immunantworten auslösen, indem sie sogenannte Pflanzenfresser-assoziierte molekulare Muster (HAMPs) bilden. In N. lugensinduziert NlMLP, ein Mucin-ähnliches Protein, das mit der Scheidenbildung zusammenhängt, pflanzliche Abwehrkräfte gegen die Fütterung, einschließlich Zelltod, die Expression von verteidigungsbezogenen Genen und Kallosettenablagerung 25,26. Es wurde auch nachgewiesen, dass einige Gelspeichelfaktoren bei Blattläusen pflanzenabwehrreaktionen über Gen-zu-Gen-Interaktionen ähnlich den pathogenassoziierten molekularen Musternauslösen 12,15,27.

Für die Untersuchung der Speichelfaktoren, die für die Fütterung von Insekten und / oder die Übertragung von Krankheitserregern unerlässlich sind, ist es notwendig, den sekretierten Speichel zu analysieren. Hier werden künstliche Fütterungs- und Entnahmemethoden beschrieben, um ausreichende Mengen an Speichel für die weitere Analyse zu erhalten. Mit einem Medium, das nur ein einziges Nährstoff enthielt, wurden viele Speichelproteine gesammelt und durch Silberfärbung und Western Blotting analysiert. Diese Methode wird bei der weiteren Erforschung von Faktoren im Speichel hilfreich sein, die für die RSV-Übertragung durch SBPH unerlässlich sind.

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Protokoll

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1. SBPH-Wartung

  1. Aufzucht der viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen in einem Glasinkubator (65 x 200 mm) mit 5-6 Reissämlingen(Oryza sativa cv. Nipponbare) pro Glaskammer im Labor. Wachsen Sie die Reispflanzen bei 25 ° C unter einer 16 h hellen / 8 h dunklen Photoperiode.
    HINWEIS: Die viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen wurden ursprünglich in der Provinz Jiangsu, China, gefangen.
  2. Nachweis von RSV in SBPH durch dot-enzym-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) mit einem Kaninchen-RSV-spezifischen polyklonalen Antikörper (siehe Materialtabelle), dergegen die RSV-Ribonukleoproteine (RNPs) aufgezogen wurde.
    HINWEIS: Um eine hohe Infektionseffizienz der Nachkommen zu gewährleisten, wurden virulifere Weibchen separat gehalten und 15% ihrer Nachkommen wurden nach dem Zufallsprinzip auf eine RSV-Infektion getestet. Die Einzelheiten des Punkt-ELISA sind in den Schritten 1.3-1.7 beschrieben.
  3. Homogenisieren Sie einzelne SBPH in 20 μL Beschichtungspuffer (0,05 MNa2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Spot 3 μL von jedem auf Nylonmembran (siehe Tabelle der Materialien) und trocknen Sie dann die Membran bei Raumtemperatur (RT).
  4. Inkubieren Sie die Membran mit 15 ml Sperrpuffer (PBS + 3% Magermilch) für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. Inkubieren Sie die Membran mit verdünnten primären Kaninchen-Antikörpern gegen RSV (1:10000) in 15 ml PBS für 1 h bei RT und waschen Sie die Membran dreimal mit PBS für jeweils 5 min Inkubation.
  6. Inkubieren Sie die Membran mit 1,5 μL Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern (siehe Materialtabelle) in 15 ml PBS und waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 min Inkubation.
  7. Entwickeln Sie die Immunoblots mit dem Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (siehe Materialtabelle)gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen.

2. Vorbereitung der Futterkammer und der künstlichen Ernährung

  1. 2 g Saccharosepulver wiegen und in 40 mlddH2 O auflösen, um 5% ige wässrige Saccharoselösung als künstliche Diät herzustellen.
  2. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm-Filter (siehe Materialtabelle),um bakterielle Verunreinigungen und Verunreinigungen zu entfernen.
  3. Verhungern Sie 2003.-5. SBPH-Larven für 3-5 h, bevor Sie sie in die Kammer einführen.
    HINWEIS: 200 SBPH sind für eine Kammer vorbereitet; mehr SBPH sollte für mehrere Kammern vorbereitet werden.
  4. Bereiten Sie die Glaszylinder als Zuführkammern vor (Abbildung 1A). Bedecken Sie ein offenes Ende der Kammer mit einer Paraffinmembran (siehe Materialtabelle),bevor Sie die experimentellen Insekten einführen.
    HINWEIS: Jeder Zylinder ist 15,0 cm lang und hat einen Durchmesser von 2,5 cm. Diese Glaszylinder werden nach der experimentellen Anforderung maßgefertigt.
  5. Übertragen Sie Insekten in einen Glaszylinder.
  6. Bedecken Sie das andere Ende der Kammer mit einer gestreckten Paraffinmembran (insbesondere Parafilm M). Dann fügen Sie 200 μL künstliche Diät hinzu. Zum Schluss bedecken Sie die Flüssigkeit mit einer weiteren Schicht gestreckter Paraffinmembran.
    HINWEIS: Die Paraffinmembran ist auf etwa das Doppelte ihrer ursprünglichen Fläche gedehnt.
  7. Decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie ab, aber lassen Sie das Ende mit dem künstlichen Diätgerät dem Licht ausgesetzt.

3. Sammlung von SBPH-Speichel

  1. Sammeln Sie künstliche Diät aus RSV-freier und viruliferer SBPH separat am Ende des 24-Stunden-Zeitraums.
  2. Kühlen Sie den Zylinder bei 4 ° C, um die Insekten zu immobilisieren.
  3. Decken Sie den äußeren Film auf und sammeln Sie die künstliche Diätflüssigkeit mit einer sterilen Pipette in 1,5 ml sterile röhrchen. Den gesammelten Speichel bis zur Analyse bei -80 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Der gesammelte Speichel konnte 1 Jahr lang bei -80 °C gelagert werden.
  4. Spülen Sie die innere Membran dreimal mit 50 μL frischer künstlicher Nahrung durch sanftes Pipettieren aus und sammeln Sie die künstliche Waschdiät wie in Schritt 3.3 beschrieben ein. Legen Sie die neue künstliche Diät auf die innere Membran und halten Sie eine frisch gedehnte Paraffinmembran darauf.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für 5 Tage bis 2 Wochen.
    HINWEIS: Zählen Sie die Überlebensrate der künstlichen Fütterung SBPH und stellen Sie eine ausreichende Ergänzung der frischen SBPH entsprechend der Überlebensrate sicher.
  6. Filtern Sie die gesammelten Proben durch eine 0,22 μm Filtereinheit, um Mikroben und andere Verunreinigungen zu entfernen.

4. Konzentration des gesammelten Speichels

  1. Die entnommenen Speichelproben werden in einem 0,5 mL 10 kD Zentrifugalfilter (siehe Materialtabelle) überführtund bei 5.500 x g bei 4 °C für 20 min gedreht. Sammeln Sie den Überstand und machen Sie das endgültige Volumen auf 100 μL.
  2. Messen Sie die Konzentration des gesammelten Speichels mit einem geeigneten UV-Vis-Spektralphotometer gemäß den Schritten 4.3-4.6.
  3. Schalten Sie das Spektralphotometer ein und waschen Sie die Sockel dreimal mit ddH2O.
  4. Wählen Sie die folgenden Optionen auf dem Bildschirm in der richtigen Reihenfolge: Proteine | Protein A280 | Typ | auswählen 1 Abs = 1 mg/ml. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Baseline-Korrektur 340 nm.
  5. Laden Sie 2 μL 5% ige Saccharose-Wässrige Lösung als Leer, berühren Sie Blank am unteren Bildschirmrand.
  6. Nachdem Sie Standards gesetzt haben, laden Sie 2 μL des gesammelten Speichels zur Messung ein. Lesen und notieren Sie die Proteinkonzentration.
    ANMERKUNG: Insgesamt wurden schließlich mindestens 1 mg Speichelproteine gesammelt.

5. Silberfärbung von Speichelproteinen

  1. Extrahieren Sie Protein aus den Speichelproben der Insekten unter Verwendung des Probenbeladungspuffers (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% Glycerin, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 1% β-Mercaptoethanol). Dann fraktionieren Sie es mit 10% SDS-PAGE (siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie die 5% ige sucroseaqueöse Lösung, die auf die gleiche Weise wie eine Negativkontrolle behandelt wird.
  2. Laden Sie ein 20 μL Aliquot der Probe neben einem vorgefärbten Marker auf ein SDS-PAGE-Gel. Lassen Sie das Gel 15 Minuten bei 90 Volt und dann 50 Minuten bei 140 Volt laufen.
  3. Fixieren Sie das Gel in 30% (vol/vol) Ethanol, 10% (vol/vol) Essigsäure für mindestens 30 min nach elektrophorese.
  4. Spülen Sie das Gel zweimal mit 20% (vol/vol) Ethanol und Wasser separat für jeweils 10 min.
  5. Sensibilisieren Sie das Gel in 0,8 mM Natriumthiosulfat für 1 min und spülen Sie es dann zweimal in Wasser für jeweils 1 min.
  6. Tauchen Sie das Gel für mindestens 1 h in 12 mM Silbernitrat und tauchen Sie es dann für 10 s in deionisiertes Wasser, bevor Sie es in die Entwicklerlösung überführen.
  7. Wenn der Hintergrund des Gels dunkel wird, tauchen Sie das Gel für mindestens 30 Minuten in eine Stopplösung (5% ige Essigsäure) ein, um die Reaktion zu stoppen.
  8. Waschen Sie das Gel zweimal mit Wasser für jeweils 30 minuten. Entwickeln Sie das Bild mit dem Detektionssystem (siehe Materialverzeichnis).

6. Proteinnachweis durch Western Blotting

  1. Nachweis des speichelmucinähnlichen Proteins von SBPH (LssgMP) und RSV durch Western Blots mit spezifischen Antikörpern.
  2. Behandeln Sie Insektenspeichelproben nach Schritt 5.1.
  3. Laden Sie ein 20 μL Aliquot der Probe auf ein 10% SDS-PAGE Gel zusammen mit einem vorgefärbten Marker und einer 20 μL RSV nicht infizierten Speichelprobe als Negativkontrolle. Lassen Sie das Gel 15 Minuten bei 90 Volt und dann 50 Minuten bei 140 Volt laufen.
  4. Mischen Sie 100 ml 10x Proteintransferpuffer (nass) (siehe Materialtabelle)mit 900 mL ddH2O zu einer Arbeitslösung (1x) und übertragen Sie dann Proteine unter Verwendung von Proteintransferpuffer (1x) auf eine Polyvinylidendifluoridmembran.
  5. Blockieren Sie die Membran in 5% Magermilch mit 0,01 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 (TBST) bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.
    HINWEIS: Mischen Sie in diesem Protokoll 100 ml 10x TBST (siehe Materialtabelle)mit 900 ml ddH2O in die Arbeitslösung.
  6. Inkubieren Sie die Membran mit primären Kaninchenantikörpern gegen RSV oder LssgMP (beide 1:10000), verdünnt in TBST bei RT für mindestens 2 h.
    HINWEIS: Die Produktion von primären Antikörpern gegen RSV wurde oben erwähnt. Ein Biotechnologieunternehmen produzierte den polyklonalen Kaninchen-Anti-LssgMP-Antikörper gegen das LssgMP-Peptid GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten Inkubation.
  8. Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern, die in 1:10000 TBST verdünnt sind.
  9. Entwickeln Sie die Immunoblots mit dem verbesserten Chemilumineszenz Western Blotting Detection System.

7. Erkennung des LssgMP-Expressionsmusters in SBPH

  1. Immobilisieren Sie die Insekten bei 4 ° C für 5 min.
  2. Waschen Sie die Insekten nacheinander mit 75% Ethanol undddH2Ound sezieren Sie die Insekten dann in vorgekühlter TBS (0,01 M Tris-gepufferte Kochsalzlösung).
  3. Sezieren Sie die Insekten aus dem Bauch, während Sie die Vorderbeine von SBPH am Coxa-Trochanter-Gelenk mit einer Pinzette abtrennen; Waschen Sie den Mitteldarm und die Speicheldrüsen zweimal in TBS, um jegliche Kontamination von der Hämolymphe zu entfernen.
  4. Legen Sie fünf Gewebe in ein 1,5 ml RNase-freies Röhrchen, um RNA zu extrahieren. Betrachten Sie jedes Röhrchen als eine Probe.
  5. Führen Sie RNA-Extraktion gemäß den Protokollen des Herstellers und Reverse-Transkriptional PCR (RT-PCR) durch (siehe Materialtabelle).
  6. Durchführung einer quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR), um die relativen Transkriptexpressionsniveaus von LssgMP in Extrakten des ganzen Körpers oder verschiedener Gewebe von L. striatelluszu untersuchen.
    HINWEIS: Die Primerpaare, die für die Genamplifikation verwendet wurden, waren LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green-basierte qPCR wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das Transkriptniveau des L. striatellus Translationsdehnungsfaktors 2 (ef2) wurde mit dem Primerpaar ef2-q-F/ef2-q-R für die Normalisierung der cDNA-Templates quantifiziert. Und die Primersequenzen sind unten angehängt:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: AGBTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

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Ergebnisse

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Schematische Darstellung der künstlichen Fütterungsanlage und Speichelsammlung
Abbildung 1A zeigt den Glaszylinder (15 cm x 2,5 cm), der als Futterkammer zum Sammeln des Speichels verwendet wird. Zuerst wurden die SBPH-Larven für mehrere Stunden ausgehungert, um die Sammeleffizienz zu verbessern, und dann durch Abkühlen für 5 Minuten immobilisiert. Nachdem die Insekten in den Glaszylinder überführt wurden, wurden beide offenen Enden der Kammer mit gestreckter Paraffinmemb...

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Diskussion

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Die erfolgreiche Aufzucht von Insekten auf künstlicher Diät wurde erstmals 1962 berichtet, als Mittler und Dadd die Paraffinmembrantechnik zur Durchführung einer künstlichen Diät beschrieben29,30. Und diese Methode wurde in vielen Aspekten der Insektenbiologie und des Verhaltens erforscht, zum Beispiel in den Bereichen Nahrungsergänzungsmittel, dsRNA-Fütterung und Virusakquisition. Basierend auf den Anforderungen der Speichelanalyse wird in dieser Studie 5% Sacch...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2019YFC1200503), von der National Science Foundation of China (Nr. 32072385) und von der Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10-KD ZentrifugalfilterMerck MilliporeR5PA83496Für die Konzentration
10x Protein Transfer Buffer (nass)macGENEMP008Transfer Puffer für Western Blotting
10x TBST PufferCoolaberSL1328-500mL&mal; 10Waschpuffer für Western Blotting
Azure c600 BiosystemeAzure BiosystemsAzure c600Bildgebungssystem für Western Blotting und Silberfärbung
Farbe Vorgefärbte ProteinleiterGenStarM221-01Proteinmarker für Western Blotting
ECL  Western Blotting Nachweis ReagenzienGEHealthcare RPN2209Western Blot Nachweis
Enchanced HRP-DAB Chromogen KitTIANGENChromogene Reaktion
Meerrettichperoxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-AntikörperSigma401393-2MLPolyklonaler Sekundärantikörper für Western Blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidendifluorid-MembranMerck MilliporeIPVH00010Transfermembran für Western Blotting
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125Für quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891Für Reverse-transkriptionelle PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0,22 & Mikro; mMerck MilliporeSLGP033RBFür die Filtration
Mini-PROTEAB TGX GeleBio-Rad4561043Für SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WNachweis der Proteinkonzentration
NylonmembranPALLT42754Membran für Punkt-ELISA
Parafilm M MembranSigmaP7793-1EAHerstellung von künstlicher Diät Sandwiches
Kaninchen anti-LssgMP polyklonaler Antikörper gegen LssgMP PeptideGenstriptKaninchen primärer anti-LssgMP polyklonaler Antikörper für Western Blotting
Kaninchen anti-RSV polyklonaler AntikörperGenstriptKaninchen primärer anti-RSV polyklonaler Antikörper für Western Blotting und Dot-ELISA
RNAprep pure Micro KitTIANGENDP420für die RNA-Extraktion
#PA110

Referenzen

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