Benutzerfreundliche Datenerfassungssoftware mit hohem Durchsatz und vollautomatischer Datenerfassung für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie

Summary

Die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert ein geeignetes Softwarepaket und eine benutzerfreundliche Pipeline für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. Hier präsentieren wir die Anwendung eines vollautomatischen Bilderfassungssoftwarepakets, Latitude-S, und einer praktischen Pipeline zur Datenerfassung von vitrifizierten Biomolekülen unter niedrig dosierten Bedingungen.

Abstract

Technologische und methodische Fortschritte in der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben in den vergangenen Jahren einen neuen Weg für die hochauflösende Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle eröffnet. Trotz der bemerkenswerten Fortschritte in der Kryo-EM gibt es noch Raum für Verbesserungen in verschiedenen Aspekten des Einzelpartikelanalyse-Workflows. Die Einzelpartikelanalyse erfordert ein geeignetes Softwarepaket für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. In den letzten acht Jahren wurden mehrere Softwarepakete für die automatische Datenerfassung für die automatische Bildgebung von Einzelpartikel-Kryo-EM entwickelt. Dieser Beitrag stellt eine Anwendung einer vollautomatischen Bilderfassungspipeline für vitrifizierte Biomoleküle unter niedrig dosierten Bedingungen vor.

Es demonstriert ein Softwarepaket, das Kryo-EM-Daten vollständig, automatisch und präzise sammeln kann. Darüber hinaus können verschiedene mikroskopische Parameter durch dieses Softwarepaket einfach gesteuert werden. Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial dieses Softwarepakets bei der automatisierten Bildgebung des Spike-Proteins SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus 2) mit einem 200-keV-Kryo-Elektronenmikroskop, das mit einem direkten Elektronendetektor (DED) ausgestattet ist. Rund 3.000 Kryo-EM-Filmbilder wurden in einer einzigen Sitzung (48 h) der Datenerhebung aufgenommen, was zu einer atomaren Auflösungsstruktur des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 führte. Darüber hinaus zeigt diese Strukturstudie, dass das Spike-Protein zwei Hauptkonformationen annimmt, 1-RBD (Rezeptor-bindende Domäne) offen und alle RBD nach unten geschlossenen Konformationen.

Introduction

Einzelpartikel-Kryo-EM hat sich zu einer gängigen strukturbiologischen Technik zur hochauflösenden Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle ^entwickelt1. Die Einzelpartikelrekonstruktion hängt von der Aufnahme einer großen Anzahl von Mikroaufnahmen von verglasten Proben ab, um zweidimensionale (2D) Partikelbilder zu extrahieren, die dann verwendet werden, um eine dreidimensionale (3D) Struktur eines biologischen Makromoleküls zu ^{rekonstruieren2,3}. Vor der Entwicklung von DEDs lag die durch die Einzelpartikelrekonstruktion erreichte Auflösung zwischen 4 und 30 ^Å4,5<....

Protocol

HINWEIS: Für die Kryo-EM-Datenerfassung sind drei wichtige Schritte erforderlich: 1. Kryo-EM-Rastervorbereitung, 2. Kalibrierung und Ausrichtung des Mikroskops, 3. automatische Datenerfassung (Abbildung 1). Des Weiteren gliedert sich die automatisierte Datenerfassung in a. geeignete Flächenauswahl, b. Optimierung von Latitude-S, c. Start der automatischen Lochauswahl und d. Start der automatischen Datenerfassung (Abbildung 1).

1. Cryo-EM-Netzvorbereitung und Probenbeladung zur automatischen Datenerfassung

1. Reinigen Sie die Gitter mit einem Glühentleerer und variieren Sie d....

Results

In der aktuellen Pandemiesituation spielt Kryo-EM eine Schlüsselrolle bei der Charakterisierung der Strukturen verschiedener Proteine aus SARS-CoV-226,27,28,29, die zur Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gegen das Virus beitragen können. Es besteht ein dringender Bedarf an schnelllebigen Forschungsanstrengungen mit begrenzten personellen Ressourcen, um die Coronavirus-Krankheit von 20.......

Discussion

Latitude-S ist eine intuitive Benutzeroberfläche, die eine Umgebung zum automatischen Einrichten und Sammeln von Tausenden von hochauflösenden Mikroaufnahmen oder Filmdateien in zwei Tagen bietet. Es bietet eine einfache Navigation durch die Gitter und behält die Position des Mikroskoptisches bei, während es sich von niedriger Vergrößerung zu hoher Vergrößerung bewegt. Jeder Schritt der Datenerfassung mit Latitude-S ist zeiteffizient, mit Funktionen wie einer einfachen Benutzeroberfläche, schnellem Streaming von Daten mi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Löschpapier	Ted Pella, INC.	47000-100	EM Probenvorbereitungsgerät
Kapsel	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97591	EM Probenvorbereitungsgerät
Kassette	Thermo Fisher Scientific	1020863	EM Probenvorbereitungsgerät
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	EM Probenvorbereitungsgerät
C-Clip Einführwerkzeug	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97571	EM-Probenvorbereitungswerkzeug
C-Clip Ring	Thermo Fisher Scientific	1036173	EM-Probenvorbereitungsartikel
EM-Gitter (Quantifoil)	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	Q3100AR1.3	R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glimmentladungsmaschine	Quorum	N/A	Quorum GlowQube Glimmentladungsmaschine
K2 DED	Gatan Inc.	N/A	Kryo-EM-Datenerfassungsgerät (Kamera)
Latitude S Software	Gatan Inc.		Imaging-Software
Ladestation	Thermo Fisher Scientific	1130698	EM-Probenvorbereitungseinheit
Talos 200 kV Arctica	Thermo Scientific™	N/A	Kryo-Elektronenmikroskop
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A	EM Probenvorbereitungseinheit