Method Article

Benutzerfreundliche Datenerfassungssoftware mit hohem Durchsatz und vollautomatischer Datenerfassung für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert ein geeignetes Softwarepaket und eine benutzerfreundliche Pipeline für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. Hier präsentieren wir die Anwendung eines vollautomatischen Bilderfassungssoftwarepakets, Latitude-S, und einer praktischen Pipeline zur Datenerfassung von vitrifizierten Biomolekülen unter niedrig dosierten Bedingungen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologische und methodische Fortschritte in der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben in den vergangenen Jahren einen neuen Weg für die hochauflösende Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle eröffnet. Trotz der bemerkenswerten Fortschritte in der Kryo-EM gibt es noch Raum für Verbesserungen in verschiedenen Aspekten des Einzelpartikelanalyse-Workflows. Die Einzelpartikelanalyse erfordert ein geeignetes Softwarepaket für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. In den letzten acht Jahren wurden mehrere Softwarepakete für die automatische Datenerfassung für die automatische Bildgebung von Einzelpartikel-Kryo-EM entwickelt. Dieser Beitrag stellt eine Anwendung einer vollautomatischen Bilderfassungspipeline für vitrifizierte Biomoleküle unter niedrig dosierten Bedingungen vor.

Es demonstriert ein Softwarepaket, das Kryo-EM-Daten vollständig, automatisch und präzise sammeln kann. Darüber hinaus können verschiedene mikroskopische Parameter durch dieses Softwarepaket einfach gesteuert werden. Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial dieses Softwarepakets bei der automatisierten Bildgebung des Spike-Proteins SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus 2) mit einem 200-keV-Kryo-Elektronenmikroskop, das mit einem direkten Elektronendetektor (DED) ausgestattet ist. Rund 3.000 Kryo-EM-Filmbilder wurden in einer einzigen Sitzung (48 h) der Datenerhebung aufgenommen, was zu einer atomaren Auflösungsstruktur des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 führte. Darüber hinaus zeigt diese Strukturstudie, dass das Spike-Protein zwei Hauptkonformationen annimmt, 1-RBD (Rezeptor-bindende Domäne) offen und alle RBD nach unten geschlossenen Konformationen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Einzelpartikel-Kryo-EM hat sich zu einer gängigen strukturbiologischen Technik zur hochauflösenden Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle entwickelt1. Die Einzelpartikelrekonstruktion hängt von der Aufnahme einer großen Anzahl von Mikroaufnahmen von verglasten Proben ab, um zweidimensionale (2D) Partikelbilder zu extrahieren, die dann verwendet werden, um eine dreidimensionale (3D) Struktur eines biologischen Makromoleküls zu rekonstruieren2,3. Vor der Entwicklung von DEDs lag die durch die Einzelpartikelrekonstruktion erreichte Auflösung zwischen 4 und 30 Å4,5. Vor kurzem hat die erreichbare Auflösung von Einzelpartikel-Kryo-EM mehr als 1,8 Å6 erreicht. DED und automatisierte Datenerfassungssoftware haben wesentlich zu dieser Auflösungsrevolution beigetragen7, bei der menschliche Eingriffe zur Datenerfassung minimal sind. Im Allgemeinen wird die Kryo-EM-Bildgebung bei niedrigen Elektronendosisraten (20-100 e/Å2) durchgeführt, um die durch Elektronenstrahle induzierte Strahlenschädigung biologischer Proben zu minimieren, was zu dem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Bild beiträgt. Diese niedrige SNR behindert die Charakterisierung der hochauflösenden Strukturen biologischer Makromoleküle mittels Einzelpartikelanalyse.

Die Elektronendetektoren der neuen Generation sind CMOS-basierte Detektoren (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor), die diese niedrigen SNR-bezogenen Hindernisse überwinden können. Diese CMOS-Kameras mit direkter Detektion ermöglichen ein schnelles Auslesen des Signals, wodurch die Kamera eine bessere Punktspreizungsfunktion, ein geeignetes SNR und eine hervorragende Detektivquanteneffizienz (DQE) für biologische Makromoleküle beiträgt. Direktdetektionskameras bieten ein hohes SNR8 und ein geringes Rauschen in den aufgenommenen Bildern, was zu einer quantitativen Steigerung der Detektivquanteneffizienz (DQE) führt - ein Maß dafür, wie viel Rauschen ein Detektor zu einem Bild hinzufügt. Diese Kameras zeichnen auch Filme mit einer Geschwindigkeit von Hunderten von Bildern pro Sekunde auf, was eine schnelle Datenerfassung ermöglicht9,10. All diese Eigenschaften machen schnelle Direktdetektionskameras für anwendungen mit niedriger Dosis geeignet.

Bewegungskorrigierte Stapelbilder werden für die Datenverarbeitung verwendet, um die 2D-Klassifizierung zu berechnen und eine 3D-Dichtekarte von Makromolekülen mit verschiedenen Softwarepaketen wie RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 und EMAN215 zu rekonstruieren. Für die Einzelpartikelanalyse ist jedoch ein enormer Datensatz erforderlich, um eine hochauflösende Struktur zu erreichen. Daher sind automatische Datenerfassungsmauten für die Datenerfassung von großer Bedeutung. Um große Kryo-EM-Datensätze zu erfassen, wurden in den letzten zehn Jahren mehrere Softwarepakete verwendet. Dedizierte Softwarepakete wie AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS und EPU wurden für die automatisierte Datenerfassung entwickelt.

Diese Softwarepakete verwenden Routineaufgaben, um Bohrungspositionen automatisch zu finden, indem sie die Bilder mit geringer Vergrößerung mit Bildern mit hoher Vergrößerung korrelieren, was bei der Identifizierung von Löchern mit glasigem Eis von geeigneter Eisdicke für die Bildaufnahme unter niedrig dosierten Bedingungen hilft. Diese Softwarepakete haben die Anzahl der sich wiederholenden Aufgaben reduziert und den Durchsatz der Kryo-EM-Datenerfassung erhöht, indem sie mehrere Tage lang kontinuierlich eine große Menge an qualitativ hochwertigen Daten ohne Unterbrechung und die physische Anwesenheit des Bedieners erfasst haben. Latitude-S ist ein ähnliches Softwarepaket, das zur automatischen Datenerfassung für die Einzelpartikelanalyse verwendet wird. Dieses Softwarepaket ist jedoch nur für K2/K3-DEDs geeignet und wird mit diesen Detektoren ausgeliefert.

Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial von Latitude-S bei der automatisierten Bilderfassung des SARS-CoV-2-Spikeproteins mit einem direkten Elektronendetektor, der mit einem 200 keV Kryo-EM ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Mit diesem Datenerfassungstool werden automatisch 3.000 Filmdateien des SARS-CoV-2-Spike-Proteins erfasst und eine weitere Datenverarbeitung durchgeführt, um eine Spike-Proteinstruktur mit einer Auflösung von 3,9-4,4 Å zu erhalten.

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Protocol

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HINWEIS: Für die Kryo-EM-Datenerfassung sind drei wichtige Schritte erforderlich: 1. Kryo-EM-Rastervorbereitung, 2. Kalibrierung und Ausrichtung des Mikroskops, 3. automatische Datenerfassung (Abbildung 1). Des Weiteren gliedert sich die automatisierte Datenerfassung in a. geeignete Flächenauswahl, b. Optimierung von Latitude-S, c. Start der automatischen Lochauswahl und d. Start der automatischen Datenerfassung (Abbildung 1).

1. Cryo-EM-Netzvorbereitung und Probenbeladung zur automatischen Datenerfassung

  1. Reinigen Sie die Gitter mit einem Glühentleerer und variieren Sie die Leuchtentladungsparameter je nach experimentellen Anforderungen (hier 60 s bei 20 mA).
  2. Eine frisch zubereitete Proteinprobe (3 μL) in das glühende Gitter geben und 10 s inkubieren.
  3. Tupfen Sie die Gitter für 3-5 s bei 100% Luftfeuchtigkeit ab und tauchen Sie sie mit einem Kryokolben schnell in flüssiges Ethan.
  4. Klemmen Sie die Gitter manuell in einen Clipring, um die Patrone mit einem flexiblen C-Clip-Ring zu bilden.
  5. Legen Sie die eingefrorenen Patronengitter in die Autoloader-Kassette und übertragen Sie die Kassette mit der Nanokappe zur Datenerfassung auf den vorgekühlten Autoloader des Mikroskops.

2. Mikroskopabstimmung und Grundausrichtung vor der automatischen Datenerfassung

  1. Strahlverschiebung
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Direkte Ausrichtung auf Balkenverschiebung.
    2. Reduzieren Sie die Vergrößerung und zentrieren Sie den Strahl mit dem Multifunktions-X- und Y-Knopf auf die optische Achse.
  2. Ausrichtung des Drehpunkts
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Direkte Ausrichtung (Direct Alignment) auf die Option Balkenneigung (Direct Alignment pp X).
    2. Kondensieren Sie den Strahl auf einen Punkt und minimieren Sie die Bewegung mit dem Multifunktions-X- und Y-Knopf .
  3. Zentrierung der C2-Blende
    1. Wählen Sie auf der Registerkarte Ausrichtung die Kondensatorblende aus.
    2. Kondensieren Sie den Strahl zu einem Punkt, zentrieren Sie den Strahl auf die optische Achse und erweitern Sie dann den Strahl, um den Kreis gleichmäßig abzudecken.
    3. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Blende des Kondensators 2 angepasst ist.
  4. Komafreie Ausrichtung
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Direkte Ausrichtung auf Komafreie Ausrichtung X, um den Strahl an der optischen Achse auszurichten.
    2. Verwenden Sie den Multifunktionsknopf , um die Form und die Bewegung des FFT zu minimieren (stellen Sie sicher, dass er stabil ist).
    3. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für Koma - freie Ausrichtung Y.
  5. Stellen Sie aufgrund der C-Zwillingslinse eine parallele Beleuchtung vor der Datenerfassung im Kryo-EM ein.
    1. Setzen Sie die Objektivblende (70 μm) im Beugungsmodus ein.
    2. Fokussieren Sie die Objektivblende auf die vordere Brennebene der Beugungslinse, indem Sie den Defokussierungs-Intensitätsregler (Objektivobjektiv und C2-Objektivstrom) steuern.
    3. Stellen Sie sicher, dass der scharfe Rand der Objektivblende nach ordnungsgemäßer Defokussierung sichtbar wird.
    4. Setzen Sie den Strahlstopper ein und verteilen Sie die Intensität, bis die Goldpulverbeugungsringe minimiert sind.
      HINWEIS: Wenn der Strahl richtig verteilt ist, ist ein klarer Beugungsring des Goldpulvers auf dem Bildschirm sichtbar, der anzeigt, dass der Strahl parallel ist.
    5. Ziehen Sie den Strahlstopper nach dem Einstellen der Parallelbeleuchtung zurück und ändern Sie den Mikroskopmodus auf Nanosonde.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Mikroskopabstimmung, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen, um die optimale Leistung des Mikroskops sicherzustellen. Alle diese Einstellungen werden in der Gui-Registerkarte Direct Alignment des Mikroskops vorgenommen. Das gesamte Mikroskop-Tuning wird vor der Datenerfassung mit einem Testraster durchgeführt.

3. Datenerfassung mit Latitude-S

  1. Starten Sie die automatisierte Datenerfassungssoftware Latitude-S.
    HINWEIS: Die Installation des Latitude-S erfordert auch eine Mikroskopkalibrierung, die vor der Datenerfassung durchgeführt wird, und die Einstellungen werden dauerhaft gespeichert. Fünf verschiedene Zustände für die Datenerfassung werden mit vier verschiedenen Vergrößerungen kalibriert (Abbildung 1 und Abbildung 2). Atlaszustand und Gitterzustand liegen im LM-Modus in zwei verschiedenen Vergrößerungen vor (niedrige Vergrößerungsbereiche). Der Lochzustand befindet sich im SA-Modus (Bereiche mit hoher Vergrößerung), jedoch mit einer moderaten Vergrößerung. Fokus und Datenzustand verwenden den SA-Modus mit hoher Vergrößerung.
    1. Klicken Sie im Startmenü auf DigitalMicrograph oder doppelklicken Sie auf das DigitalMicrograph-Symbol auf dem Desktop.
    2. Wählen Sie unter DigitalMicrograph das Symbol Technik-Manager aus.
      HINWEIS: Dieses System zeigt TEM - und Latitude-S-Symbole an (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung S1).
    3. Wählen Sie das Latitude-S-Symbol für die automatisierte Einzelpartikelerfassung aus.
      HINWEIS: Die K2-Kamera arbeitet in drei Modi: linear/integriert, gezählt und Superauflösung. Der Benutzer kann einen beliebigen Modus in der Benutzeroberfläche von DigitalMicrograph auswählen. Datenbilder können entweder als dosisfraktionierte Bildstapel oder als summierte Bilder in MRC-, TIF- oder DM4-Dateien mit unterschiedlichen Bittiefen gespeichert werden. Darüber hinaus konnten Daten als bewegungskorrigierte Bilder für die K3-Kamera gespeichert werden. Auf einer K2-Kamera kann ein unverarbeiteter Bildstapel als 4-Bit-MRC-, 8-Bit-TIF- oder 8-Bit-DM4-Dateien gespeichert werden.
  2. Erstellen Sie eine neue Sitzung basierend auf den Einstellungen aus einer vorherigen Sitzung.
    1. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Basierend auf vorheriger Sitzung in der Palette.
    2. Wählen Sie die Schaltfläche Neu aus.
    3. Wählen Sie den Ordner aus, der die Sitzung enthält, auf der die Einstellungen der neuen Sitzung basieren. Wechseln Sie zum vorherigen Sitzungsverzeichnis, um die neue Sitzung zu erstellen. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die neue Sitzung und die zugehörigen Daten gespeichert werden sollen.
    4. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die neue Sitzung und die zugehörigen Daten gespeichert werden sollen.
      HINWEIS: Jeder Status und die zugrunde liegenden Einstellungen (Vergrößerung, Beleuchtungsbedingungen, Bild oder Projektor) und Strahlverschiebung und Kameraparameter (Gesamtbelichtung, Einzelbildbelichtung und Binning) werden von der vorhandenen Sitzung in die neue Sitzung exportiert. Der Pfad des Ordners wird als Textzeichenfolge am unteren Rand der Palette angezeigt. An jede der Status- und Konfigurationspaletten ist ein Sternchen (*) angehängt, um anzuzeigen, dass sie bereits eingerichtet wurde und verwendet werden kann.
  3. Setzen Sie eine vorhandene Sitzung fort.
    1. Klicken Sie in der Palette auf die Schaltfläche Weiter , um eine vorhandene Sitzung fortzusetzen.
      HINWEIS: Die Atlasmontage kann nicht geändert werden.
    2. Wählen Sie den Ordner aus, der die Sitzung enthält, die fortgesetzt werden soll, und navigieren Sie zu diesem Ordner.
  4. Starten Sie eine völlig neue Sitzung.
    1. Klicken Sie in der Palette auf die Registerkarte Neu . Wählen Sie den Ordner aus, der die Fortsetzung der Sitzung enthält. Wählen Sie einen Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen.
      HINWEIS: Der Standardordnername wird unter Verwendung von Datum und Uhrzeit erstellt.
    2. Klicken Sie auf das Einstellungssymbol . Fügen Sie im angezeigten Feld Status durchsuchen den Status hinzu, legen Sie die TEM-Bedingung, die Kamerabedingung und image/stack fest, und benennen Sie dann den Status.
      HINWEIS: Der automatisierte Datenerfassungsworkflow verwendet 5 verschiedene Zustände für die automatisierte Datenerfassung. Diese Status werden konfiguriert und in ihren jeweiligen Statuspaletten gespeichert. Die Zusammenfassung des Zustands ist in Tabelle 1 dargestellt.
  5. Konfigurieren Sie den Atlasstatus.
    1. Klicken Sie auf Atlas-Statuspalette.
    2. Konfigurieren Sie den Atlaszustand mit den folgenden Parametern: Vergrößerung 115x LM-Modus in Nanosonde, Beleuchtungsbedingungen-Spotgröße 8 und Helligkeit 934400, Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s für Die Bildgebung bei geringer Vergrößerung. Beziehen Sie sich auf die Zusammenfassung des Zustands in Tabelle 1.
    3. Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
      HINWEIS: Der Atlaszustand ist der niedrigste Vergrößerungszustand, der die Vermessung des gesamten Gitters ermöglicht (ergänzende Abbildung S2). Im Allgemeinen hilft uns dieser Zustand, die gesamten Gitter bei geringer Vergrößerung zu visualisieren und die Eisdicke, Die Ebenheit und das gebrochene Quadrat der Gitter zu beurteilen. Es wird empfohlen, den Atlas an verschiedenen Stellen des Gitters zu erstellen, um die optimale Eisdicke und suboptimale Eisdicke der Gitter zu beobachten (ergänzende Abbildung S3). Die genannten Parameter können je nach den Bedürfnissen des Benutzers variiert werden.
  6. Konfigurieren Sie den Rasterstatus.
    1. Klicken Sie auf die Rasterstatuspalette.
    2. Konfigurieren Sie den Grid-Zustand mit der folgenden Mikroskop-Bildgebungsoptik (Vergrößerung 380x LM-Modus in Nano-Sonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 8 und Helligkeit 626.200), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
    3. Weitere Informationen finden Sie in der Latitude-S-Statusübersicht in Tabelle 1.
    4. Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
      HINWEIS: Der Rasterzustand wird mit einer höheren Vergrößerung als der Atlaszustand so eingestellt, dass das Sichtfeld ein Rasterquadrat ist (Abbildung 2). Bei dieser speziellen Vergrößerung wird ein Gitterquadrat beobachtet. Daher werden Löcher in dieser Vergrößerung korrekt beobachtet, was hilft, die Eisdicke der Löcher zu überprüfen (ergänzende Abbildung S4). Ein einfacher Bandpassfilter wird im Gitterzustand verwendet, um die Löcher im Patentgitter zu lokalisieren. Die genannten Parameter können je nach den Bedürfnissen des Benutzers variiert werden.
  7. Konfigurieren Sie den Bohrungsstatus.
    1. Klicken Sie auf die Lochpalette.
    2. Konfigurieren Sie den Lochzustand mit den folgenden Mikroskopeinstellungen: Abbildungsoptik (Vergrößerung 4500x SM-Modus in Nanosonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 7 und Strahldurchmesser 8,81 μm), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
    3. Ändern Sie die Parameter bei Bedarf basierend auf dem Rastertyp. Siehe die Zusammenfassung des Zustands in Tabelle 1.
    4. Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
      HINWEIS: Der SA-Modus zeigt einen hohen Vergrößerungsbereich im Elektronenmikroskop an. Der Lochzustand liegt im SA-Vergrößerungsbereich mit einem Sichtfeld von wenigen Mikrometern (10-20 μm) (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung S4). Dieser Vergrößerungsbereich ist höher als der Atlas- oder Grid-Zustand, aber viel kleiner als der Fokus-/Datenzustand. Bei dieser Vergrößerung sind einzelne Löcher sichtbar. Die Lochgröße ist angemessen, um hohe Verschmutzungsgrade, leere Löcher und die richtige Eisdicke der Löcher zu beobachten. Die Löcher für die Bildgebung werden auf der Grundlage dieser Annahmen ausgewählt. Im Bohrungszustand werden zwei Filter verwendet: einer zum Kreuzkorrelieren eines Bohrungsreferenzbildes mit einem neuen Bohrungsbild und ein weiterer zum Anpassen der Bühnenhöhe an die euzentrische Höhe.
  8. Konfigurieren Sie den Fokusstatus.
    1. Klicken Sie auf Fokuspalette.
    2. Konfigurieren Sie den Fokuszustand mit folgenden Mikroskopeinstellungen: Abbildungsoptik (Vergrößerung 45.000x SA-Modus in Nanosonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 8 und Helligkeit 934400), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
    3. Konzentriere dich auf den amorphen Kohlenstoffbereich in der Nähe des Lochs. Weitere Informationen finden Sie in der Latitude-S-Statusübersicht in Tabelle 1.
    4. Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
      HINWEIS: Der SA-Modus zeigt einen hohen Vergrößerungsbereich im Elektronenmikroskop an. Der Fokuszustand ist die höhere Vergrößerung des SA-Bereichs. Im Fokusmodus wird der Strahl in einen nahe gelegenen Kohlenstoffbereich des Ziellochs verschoben und führt den Fokus automatisch durch, um die Daten im Datenzustand zu sammeln. Ein Bandpassfilter in Kombination mit einem Hanning- oder Soft-Rechteckfilter wird im Fokuszustand verwendet, um den Offset zwischen zwei Fokuszustandsbildern desselben Bereichs zu messen (Abbildung 2). Die genannten Parameter können je nach den Bedürfnissen des Benutzers variiert werden.
  9. Konfigurieren Sie den Datenstatus.
    1. Klicken Sie auf Datenpalette.
    2. Konfigurieren Sie den Datenzustand mit folgenden Mikroskopeinstellungen: Abbildungsoptik (z.B. Vergrößerung 28.000x, 45.000x, 54.000x im SA-Modus in Nanosonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 8 und Helligkeit 934400), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
    3. Weitere Informationen finden Sie in der Latitude-S-Statusübersicht in Tabelle 1.
    4. Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
      HINWEIS: Der Datenstatus ist die höchste Vergrößerung, die basierend auf den Anforderungen an die Pixelgröße und die Zielauflösung ausgewählt wurde (Abbildung 2). Im Allgemeinen wird der Strahl nach dem Fokussieren automatisch in den Zielbereich verschoben, um die Daten zu sammeln. Die oben genannten Parameter können basierend auf den Anforderungen des Benutzers geändert werden.

4. Fokus-Konfiguration

  1. Klicken Sie auf Fokus-Konfigurationspalette. Geben Sie den Bereich der Defokussierungswerte und die Schrittweite auf der angegebenen Registerkarte an.
  2. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter , um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
    HINWEIS: Für die hochauflösende Datenerfassung können niedrigere Defokussierungswerte verwendet werden. Im Allgemeinen werden für die Bildaufnahme Defokussierungswerte von -0,5 bis -3,0 μm mit Defokussierungsschrittweiten von 0,25 oder 0,5 verwendet. Benutzer können den Fokuseinrichtungsschritt überspringen, wenn sie nur das Beispiel überprüfen möchten. Drücken Sie einfach die Schaltfläche Weiter in der Palette, um den Schritt zur Fokuskonfiguration zu überspringen.

5. Feine Ausrichtung

  1. Konzentrieren Sie sich auf einige Merkmale im Gitter (z. B. Eiskontamination hexagonales Eis); siehe Abbildung 3.
    HINWEIS: Features sollten nicht zu groß oder zu klein sein. Sie sollten sowohl bei der 115-fachen Atlas-Zustandsvergrößerung (LA-Modus) als auch bei der Datenvergrößerung sichtbar sein.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen . Positionieren Sie das rote Kreuz auf demselben Feature auf jedem Bild verschiedener Zustände.
  3. Beginnen Sie mit Fokus-, Daten- und Lochzuständen, da ihr Sichtfeld viel größer ist als die Atlas- und Gitterzustände. Zoomen Sie auf Atlas- und Gitterzustände, um das rote Kreuz auf demselben Feature im Atlas- und Gitterzustand zu positionieren.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen , um die Positionen von fünf verschiedenen Zuständen zu berechnen, die die Offsets zwischen den einzelnen Zuständen berechnen und diese im Ausgabefenster widerspiegeln.
    HINWEIS: Die Offset-Werte werden zur weiteren Verwendung in die Zustände integriert (Abbildung 3). Die Feinausrichtung wird durchgeführt, um eine hohe Genauigkeit der Position jedes Zustands zu gewährleisten (Abbildung 3). Diese feine Ausrichtung hilft, die genaue Position in allen fünf Zuständen zu bestimmen. Fine Alignment ist entscheidend für die Erfassung von Einzelpartikeldaten. Daher wird dringend empfohlen, vor der Bildgebung eine Feinausrichtung durchzuführen.

6. Datenerfassungsverfahren mit Latitude-S

  1. Klicken Sie auf die Aufnahmepalette.
    HINWEIS: Im Allgemeinen werden Atlasdaten bei geringer Vergrößerung (115x) gesammelt, um die meisten Gitterquadrate zu visualisieren.
  2. Wählen Sie die Größe des Atlas, um das gesamte Raster oder einen Teil des Rasters basierend auf der Anforderung abzudecken (z. B. 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 oder 8 x 12).
    HINWEIS: Die Atlasgröße 16 x 16 deckt das gesamte Raster ab.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um den Atlas aufzunehmen.
    HINWEIS: Das Latitude-S-Hauptnavigationsfenster wird geöffnet und füllt den verfügbaren Platz in DigitalMicrograph aus (ergänzende Abbildung S5). Drei Bildbereiche im Hauptnavigationsfenster zeigen Bilder der Systemzustände bei drei verschiedenen Vergrößerungen. Der Gesamtatlas wird derzeit in seinem aktuellen Erfassungsstand ganz links angezeigt. Kacheln im Atlas füllen sich bei jeder Erfassung.
  4. Wählen Sie das Gitterquadrat basierend auf der Eisdicke aus, indem Sie auf dem Atlas navigieren (ergänzende Abbildung S5). Sobald die gewünschten Rasterquadrate ausgewählt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan und beobachten Sie, wie sich die Kacheln im Rasterquadrat füllen, während jedes Rasterquadrat erfasst wird.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan, sobald die Rasterquadrate ausgewählt sind.
  6. Wählen Sie eine repräsentative Bohrung im Rasterquadrat aus, indem Sie ihre Position hinzufügen. Sobald ein Lochbild erfasst wurde, definieren Sie die Daten und Fokuspositionen und speichern Sie das Layout als Vorlage (Ergänzende Abbildung S6).
  7. Klicken Sie auf Automatisch suchen, geben Sie die Lochgröße an (z. B. R1.2/1.3) und klicken Sie im Programm auf die Schaltfläche Suchen , wodurch das Find-Programm die Löcher basierend auf dem Lochdurchmesser automatisch findet. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Markieren , um die Vorlage hinzuzufügen (Abbildung 4), und fügen Sie rote Kreismarkierungen in allen Löchern in einem Raster oder einem teilförmigen Gitterquadrat hinzu.
  8. Richten Sie die Intensität ein, um die Löcher aus dem Gitterquadrat und die Eiskontamination zu entfernen (Abbildung 4).
    HINWEIS: Schließlich werden die ausgewählten Löcher gelb markiert, um die Datenerfassung zu planen.
  9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan in Latitude-Tasks , nachdem Sie die Löcher über die automatische Suche hinzugefügt haben.
    HINWEIS: Stellen Sie vor dem Planen der automatisierten Datenerfassung sicher, dass der Tankfüllstand für flüssigen Stickstoff ausreicht, die Autoloader-Turbopumpe ausgeschaltet ist und der RAID-Speicherplatz frei ist. Der Latitude-S-Task-Manager zeigt die Anzahl der Atlas-, Rasterquadrat-, Loch- und Datenzustände an, die für die Datenerfassung geplant sind (Abbildung 5). In der Latitude-S GUI sind verschiedene Farbschemata sichtbar und die Bedeutung der verschiedenen Farbschemata wird angezeigt: 1. Gelb zeigt ungeplant an; 2. Grün zeigt geplant an; 3. Blau zeigt Erworben an; 4. Rot zeigt fehlgeschlagen an.

7. Cryo-EM-Datenverarbeitung

HINWEIS: Die Kryo-EM-Bildverarbeitung von Spike-Protein wird in der neueren Literatur ausführlich beschrieben25.

  1. Bildverarbeitung des Spike-Proteins von SARS-CoV2 mit RELION 3.011.
  2. Zeigen Sie die mit Latitude-S aufgenommenen Filmbilder manuell an, und führen Sie mit der MotionCor2-Software9 eine strahlinduzierte Bewegungskorrektur der einzelnen Filme durch. Führen Sie das erste Screening der bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen manuell mit Hilfe des cisTEM-Softwarepakets14 durch.
    HINWEIS: Fast 85% der automatisch aufgenommenen Mikroaufnahmen waren von guter Qualität, und die Daten hatten ein Signal innerhalb von 3,7-5,2 Å, das mit cisTEM-Software14 berechnet wird (ergänzende Abbildung S7A, B).
  3. Verarbeiten Sie die Daten mit dem Softwarepaket RELION 3.011.
    1. Nehmen Sie Spike-Partikel manuell auf und unterziehen Sie sie der 2D-Klassenklassifizierung (ergänzende Abbildung S7C). Verwenden Sie die beste 2D-Klasse als Referenz für die automatische Auswahl von 3.99.842 Single-Spike-Partikeln aus den Mikroaufnahmen mit dem RELION Autopick-Tool11.
      HINWEIS: Drei Runden der 2D-Klassifizierung wurden durchgeführt, bevor die Partikel einer 3D-Klassifizierung unterzogen wurden (ergänzende Abbildung S8). Etwa 2.55.982 Einzelpartikel wurden für die 3D-Klassifizierung ausgewählt und der Datensatz in sechs Klassen eingeteilt. Die abschließende 3D-Autoverfeinerung wurde mit der besten Klasse durchgeführt; Aus der 3D-Klassifikation wurden 85.227 Spikepartikel gewonnen.
    2. Führen Sie nach der automatischen Verfeinerung eine Defokussierung pro Partikel mit den richtigen Strahlneigungsparametern durch, um die Auflösung zu verbessern. Als nächstes unterziehen Sie die Partikel einem Bayes'schen Polieren mit dem RELION 3.0 Softwarepaket11. Verwenden Sie schließlich das polierte Partikelset für eine weitere Runde 3D-Autoverfeinerung mit RELION 3.011.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der aktuellen Pandemiesituation spielt Kryo-EM eine Schlüsselrolle bei der Charakterisierung der Strukturen verschiedener Proteine aus SARS-CoV-226,27,28,29, die zur Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gegen das Virus beitragen können. Es besteht ein dringender Bedarf an schnelllebigen Forschungsanstrengungen mit begrenzten personellen Ressourcen, um die Coronavirus-Krankheit von 20...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S ist eine intuitive Benutzeroberfläche, die eine Umgebung zum automatischen Einrichten und Sammeln von Tausenden von hochauflösenden Mikroaufnahmen oder Filmdateien in zwei Tagen bietet. Es bietet eine einfache Navigation durch die Gitter und behält die Position des Mikroskoptisches bei, während es sich von niedriger Vergrößerung zu hoher Vergrößerung bewegt. Jeder Schritt der Datenerfassung mit Latitude-S ist zeiteffizient, mit Funktionen wie einer einfachen Benutzeroberfläche, schnellem Streaming von Daten mi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden oder finanziellen Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Department of Biotechnology, dem Department of Science and Technology (DST) and Science und dem Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, für die Finanzierung und die Kryo-EM-Einrichtung am IISc-Bangalore. Wir erkennen das DBT-BUILDER-Programm (BT/INF/22/SP22844/2017) und DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) für die National Cryo-EM-Einrichtung am IISc, Bangalore, an. Wir danken der finanziellen Unterstützung durch das Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 und SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Wir danken Frau Ishika Pramanick für die Vorbereitung von Kryo-EM-Gittern, die Kryo-EM-Datenerfassung und die Erstellung der Materialtabelle. Wir danken auch Herrn Suman Mishra für die Kryo-EM-Bildverarbeitung und die Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen. Wir danken Prof. Raghavan Varadarajan dafür, dass er uns geholfen hat, die gereinigte Spike-Protein-Probe für diese Studie zu erhalten.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LöschpapierTed Pella, INC.47000-100EM Probenvorbereitungsgerät
KapselThermo Fisher Scientific9432 909 97591EM Probenvorbereitungsgerät
KassetteThermo Fisher Scientific1020863EM Probenvorbereitungsgerät
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM Probenvorbereitungsgerät
C-Clip EinführwerkzeugThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM-Probenvorbereitungswerkzeug
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173EM-Probenvorbereitungsartikel
EM-Gitter (Quantifoil)Elektronenmikroskopie WissenschaftenQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
GlimmentladungsmaschineQuorumN/AQuorum GlowQube Glimmentladungsmaschine
K2 DEDGatan Inc.N/AKryo-EM-Datenerfassungsgerät (Kamera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Imaging-Software
LadestationThermo Fisher Scientific1130698EM-Probenvorbereitungseinheit
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/AKryo-Elektronenmikroskop
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM Probenvorbereitungseinheit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

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