Summary
טיפול גנטי בשריר הלב למחלות לב איסכמיות טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפולים עתידיים. כאן, אנו מציגים מודל חייתי גדול להערכת היעילות של ריפוי גנטי בלב איסכמי.
Abstract
מחלת לב כלילית היא אחד הגורמים המשמעותיים לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. למרות התקדמות הטיפולים הנוכחיים, חלק ניכר מהחולים במחלת לב כלילית נשארים סימפטומטיים. אנגיוגנזה טיפולית בתיווך ריפוי גנטי מציעה שיטה טיפולית חדשנית לשיפור זילוח שריר הלב ולהקלה על הסימפטומים. טיפול גנטי עם גורמים אנגיוגניים שונים נחקר במספר ניסויים קליניים. בשל החידוש של השיטה, ההתקדמות של טיפול גנטי שריר הלב הוא נתיב מתמשך מספסל למיטה. לכן, מודלים גדולים של בעלי חיים נדרשים להערכת הבטיחות והיעילות. ככל שמודל בעלי החיים הגדולים מזהה יותר את המחלה המקורית ואת נקודות הקצה המשמשות במרפאות, כך התוצאות צפויות יותר מניסויים קליניים. כאן, אנו מציגים מודל חייתי גדול להערכת היעילות של הטיפול הגנטי בלב חזירי איסכמי. אנו משתמשים בשיטות הדמיה רלוונטיות מבחינה קלינית כגון הדמיית אולטרסאונד ו- 15H2O-PET. לצורך מיקוד העברות הגן לאזור הרצוי, נעשה שימוש במיפוי אלקטרואנטומי. מטרת שיטה זו היא: (1) לחקות מחלת לב כלילית כרונית, (2) לגרום לאנגיוגנזה טיפולית באזורים היפוקסיים של הלב, ו-(3) להעריך את הבטיחות והיעילות של הטיפול הגנטי באמצעות נקודות קצה רלוונטיות.
Introduction
מחלת לב כלילית אחראית לחלק העצום של נטל התמותה והמחלה ברחבי העולם1. אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות הן התערבויות מלעוריות, טיפול תרופתי וניתוח מעקפים2. עם זאת, למרות ההתקדמות של טיפולים נוכחיים אלה, חולים רבים סובלים מה שנקרא תעוקת חזה עקשנית, המדגישה את הצורך הבלתי מסופק בגישות טיפול חדשניות3. אנגיוגנזה טיפולית בתיווך ריפוי גנטי יכולה להתמקד בקבוצת חולים זו.
טיפול גנטי בשריר הלב מועבר לרוב באמצעות וקטורים נגיפיים שונים, לרוב אדנו-וירוס חסר שכפול4. כגנים טיפוליים, נעשה שימוש בגורמי גדילה אנגיוגניים שונים. גורמי הגדילה האנגיוגניים הנחקרים ביותר הם גורמי גדילה אנדותל כלי דם (VEGFs) המתווכים את האיתות האנגיוגני שלהם באמצעות קולטני גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGFRs) וקולטני המשנה שלהם5. מספר ניסויים קליניים הוכיחו את התועלת והבטיחות של טיפול גנטי לבבי והפכו שיטת טיפול חדשנית זו לאפשרות מציאותית לטיפול במחלות לב איסכמיות 6,7. עם זאת, תפיסה זו עדיין זקוקה לשיפור של הגנים הטיפוליים והווקטורים הנגיפיים שהועמדו למבחן במודלים גדולים של בעלי חיים לפני הכניסה למרפאות. החזיר שימש לעתים קרובות כחיית מעבדה מכיוון שליבו דומה מאוד ללב האדם. גודלה של מערכת הלב וכלי הדם של חזיר מאפשר שימוש בהמצאות קטטר דומות לאלה המשמשות בבני אדם. ניתן להשתמש בכל שיטות ההדמיה הזמינות לבני אדם בחזירים8.
ישנם מספר מודלים גדולים של בעלי חיים לאיסכמיה כרונית. הנפוץ ביותר הוא דגם מכווץ אמרואיד 9,10,11. החיסרון של שיטה זו הוא הפולשנות שכן בית החזה נחוץ כדי לגשת כלי הדם הכליליים. בעבר בקבוצה שלנו פותח מודל סטנט מיני פולשני לצוואר בקבוק לאיסכמיה כרונית של שריר הלב12. שיטה זו משמשת גם בכתב יד זה לגרימת איסכמיה של שריר הלב.
השימושיות של הדמיית אולטרסאונד התפתחה באופן משמעותי למרות גיל שיטת ההדמיה. לדוגמה, זן שריר הלב הוא עדיין בעיקר בשימוש מחקרי בשל החידוש שלה. מתח שריר הלב משקף שינויים בתפקוד ההתכווצות של הלב טוב יותר מאשר מדידת מקטע הפליטה המסורתית במצב M13. כך, כאן במודל בעלי החיים הגדולים, נעשה שימוש במדידת מתח שריר הלב. כדי להעריך את תפקוד הלב, תפוקת הלב נמדדת גם על ידי הדמיית cine של החדר השמאלי במהלך אנגיוגרפיה. תפוקת הלב נמדדת הן במנוחה והן תחת לחץ הנגרם על ידי דובוטמין כדי להעריך את תפקוד שריר הלב תחת לחץ.
בנוסף למדידות של תפקוד הלב, מידע על זילוח שריר הלב חיוני במחקרי ריפוי גנטי שמטרתם אנגיוגנזה טיפולית. במודל זה של בעלי חיים, בעלי חיים מצולמים עם טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים של 15 H 2 O-PET עם תווית O (15H2O-PET) מכיוון שזהו תקן הזהב למדידת זילוח שריר הלב. 15H2O-PET אומת בעבר למדידת זילוח של לב חזירי איסכמי14.
לפיכך, השיטות והשיטות שהוזכרו לעיל מהוות פרספקטיבה מצוינת להערכת יעילות הטיפול הגנטי בלב האיסכמי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים המוצגים כאן מבוצעים באמצעות נקבות חזירי בית בנות כ-10 שבועות ומאושרים על ידי המועצה לניסויים בבעלי חיים בפינלנד. בעלי חיים שוקלים 30-40 ק"ג בתחילת הפרוטוקול, מה שמאפשר את אותו ציוד פרוצדורלי ושיטות הדמיה ככל האפשר לבני אדם. איסכמיה כרונית נגרמת 14 יום לפני העברת הגנים, וזמן המעקב לאחר העברת הגן תלוי בווקטור הנגיפי בו נעשה שימוש. פרוטוקול המחקר מוצג באיור 1. פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע זריקות טיפול גנטי אדנו-ויראלי או בתיווך AAV. יש להתאים את זמן איסוף הדגימה לשיא ביטוי הטרנסגנים, התלוי בווקטור הנגיפי בו נעשה שימוש. לדוגמה, בעת ביצוע העברות גנים אדנו-ויראליות, זמן איסוף הדגימה מוגדר ל -6 ימים לאחר העברת הגנים.
1. תרופות
- לנהל מינון יומי של 200 מ"ג של amiodarone ו 2.5 מ"ג של bisoprolol כדי למנוע הפרעות קצב חדריות קטלניות. התרופה מתחילה שבוע לפני ניתוח האיסכמיה ונמשכת מדי יום עד למעקב.
- בנוסף, לנהל מינונים peroral של clopidogrel (300 מ"ג) וחומצה אצטילסליצילית (300 מ"ג) לבעלי החיים 1 יום לפני ניתוח איסכמיה כדי למנוע פקקת חריפה in-stent לאחר מיקום סטנט.
- לתת 100 מ"ג של לידוקאין ו 2.5 מ"ל של (246 מ"ג / מ"ל) MgSO4 תוך ורידי לבעלי החיים בתחילת ניתוח איסכמיה כדי למנוע הפרעות קצב חדרים.
- יש לבצע הזרקה תוך שרירית של cefuroxime (500 מ"ג) בתחילת כל ניתוח למניעת זיהום.
- לנהל 30 מ"ג של enoxaparin תוך ורידי בתחילת פעולות איסכמיה תת עורית לאחר הליך הניתוח למניעת פקקת.
- להרדמה ושיכוך כאבים, יש לתת 1.5 מ"ל אטרופין, 6 מ"ל אזפרון (40 מ"ג/מ"ל), פרופופול 20 מ"ג/מ"ל, בקצב של 15 מ"ג/ק"ג/שעה, ופנטניל 50 מק"ג/מ"ל בקצב של 10 מק"ג/ק"ג/שעה. מינוני התרופות היו זהים עבור כל חזיר. עיין בהנחיות מקומיות לשימוש בבעלי חיים למתן מינון.
- מרדימים את בעלי החיים במהלך כל הניתוחים. כל הפעולות צריכות להתבצע בסביבה סטרילית בטכניקה סטרילית.
2. אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה
- בצע אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה לפני ניתוח איסכמיה, העברת גנים והמתת חסד כדי להעריך כל נוזל קרום הלב הניתן לגילוי ולקבוע את זן שריר הלב.
- מקם את המתמר בחלל הבין-קוסטלי השלישי או הרביעי מתחת לבית השחי של החזיר כדי לגשת לתצוגות פרסטרנליות קצרות ציר ברמת המסתם המיטרלי, שריר פפילרי ורמות אפיקליות (וידאו 1). סמן המתמר צריך להצביע על עצם החזה של החזיר. כדי לשמור סרטון, לחץ על Acquire.
3. פעולות אנדו-וסקולריות בהנחיה פלואורוסקופית
- ביצוע הדמיית cine בחדר שמאל לאחר אנגיוגרמות כליליות לפני ניתוח איסכמיה, העברת גנים ואיסוף רקמות.
- הכנת המבצע
- היכונו לפעולות על ידי הרגעת החזירים עם הזרקה תוך שרירית של 1.5 מ"ל של אטרופין ו 6 מ"ל של azaperone.
- לאחר ההרגעה, יש להשרות הרדמה כללית של פרופופול ופנטניל עבור ההליכים האנגיוגרפיים לחזירים במינונים של 15 מ"ג/ק"ג/שעה ו-10 מק"ג/ק"ג/שעה, בהתאמה.
הערה: החזירים מורדמים לכל אורך ההליך. - לתמוך בהנשמה על ידי אינטובציה והנשמה ולנטר את הפרמטרים הפיזיולוגיים החיוניים, כגון א.ק.ג. ופרמטרים נשימתיים.
- מבוא מיקום נדן
- הניחו נדן מבוא לעורק הירך הימני לכל הניתוחים כמקובל בקרדיולוגיה. השתמש באולטרסאונד כדי לעקוב אחר עורק הירך ולנקב אותו עם מחט כניסה (18 גרם).
הערה: השתמש במעטפת 8F להעברת גנים תוך שריר הלב ובמעטה 6F לכל הפעולות האחרות. הכנס את חוט ההנחיה של הנדן דרך המחט כדי להשחיל את העורק ולהחזיק את חוט ההנחיה ללא תזוזה תוך הסרת המחט. - הכנס את נדן המבוא לאורך חוט ההנחיה, וכאשר הוא מונח, הסר את חוט ההנחיה ותן 1.25 מ"ג של דיניטרט תת-לשוני לחזיר כדי לגרום להרחבת כלי הדם הכליליים.
- הניחו נדן מבוא לעורק הירך הימני לכל הניתוחים כמקובל בקרדיולוגיה. השתמש באולטרסאונד כדי לעקוב אחר עורק הירך ולנקב אותו עם מחט כניסה (18 גרם).
- אנגיוגרפיה כלילית
- בצע אנגיוגרפיה כלילית ישירות לפני ניתוח איסכמיה, העברת גנים ואיסוף רקמות. המנגנון הדרוש לאנגיוגרמות מוצג באיור 2.
- השתמש בצנתר 6F תחת הנחיה פלואורוסקופית עם חומר ניגוד יוד כדי לצלם את העורק הכלילי הימני ואת העורק הכלילי השמאלי העולה (וידאו 2).
- הדמיית חדר שמאל תחת מנוחה ולחץ דובוטמין
- יש להכניס בולוס בנפח 21 מ"ל של חומר ניגוד יוד לחדר השמאלי באמצעות צנתר זנב חזיר 5F באמצעות מזרק אוטומטי. ראשית, הגדר את משך הבולוס ב -3 שניות ואת הנפח הכולל עבור 21 מ"ל. לאחר מכן, לחץ על יחיד וכן.
- חשב את מקטע הפליטה על ידי תוכנת המדידה של תחנת העבודה האנגיוגרפית. כדי לבצע את החישוב, בחר ניתוח חדרים של התמונה המדוברת. גלול את התמונה כדי לבחור מסגרת זמן, אחת בדיאסטולה ואחת בסיסטולה. בחר כלי לציור קווי מתאר חדריים של כל מסגרת זמן.
הערה: התוכנה מחשבת כעת את נפח מקטע השליפה והשבץ לפי שיטת סימפסון. מדידת מקטע הפליטה מבוצעת במהלך מנוחה ותחת לחץ המושרה על ידי דובוטמין.
- הדמיית מאמץ
- מינון דובוטאמין תוך ורידי במינונים עולים מ-10 מיקרוגרם/ק"ג/דקה ל-20 מק"ג/ק"ג/דקה עבור הדמיית מאמץ הנגרמת על ידי דובוטמין עד להשגת דופק היעד של 160 פעימות לדקה. לאחר מכן, בצע את הדמיית cine.
- ניתוח איסכמיה
- הכניסו סטנט צוואר בקבוק לעורק הכלילי השמאלי (LAD) 14 יום לפני העברת הגן כדי לגרום לאיסכמיה כרונית של שריר הלב. לאחר מיקום הסטנט בצוואר הבקבוק, בדוק אם סטנט צוואר הבקבוק ממוקם כראוי, מה שמגביל את זרימת הדם הכלילית.
הערה: סטנט צוואר הבקבוק ממוקם על צנתר התרחבות ומורכב מתומכן מתכת חשופה המכוסה על ידי צינור פוליטטרפלואוראתילן שנוצר בצורת צוואר בקבוק כדי להפחית את זרימת הדם הכלילי9.
- הכניסו סטנט צוואר בקבוק לעורק הכלילי השמאלי (LAD) 14 יום לפני העברת הגן כדי לגרום לאיסכמיה כרונית של שריר הלב. לאחר מיקום הסטנט בצוואר הבקבוק, בדוק אם סטנט צוואר הבקבוק ממוקם כראוי, מה שמגביל את זרימת הדם הכלילית.
- הגדרת גודל הסטנט
- בחר את גודל הסטנט, 3.0/3.5/4.0 x 8 מ"מ, בהתאם לגודל העורק הכלילי העולה השמאלי באנגיוגרמה באמצעות תוכנת המדידה האוטומטית בתחנת העבודה האנגיוגרפית (וידאו 3)12.
- מיקום סטנט
- הניחו סליל לעורק הכלילי השמאלי והחליקו את סטנט צוואר הבקבוק אל ה-LAD, והניחו אותו באופן מרוחק לאלכסון הראשון.
- ניפוח הסטנט ללחץ נומינלי בעורק באמצעות in-deflator עם יחס סטנט ללומן של 1.3, המעגן את צוואר הבקבוק במקומו. לאחר 15 שניות נוספות, לרוקן את הסטנט ולמשוך את הציוד מהעורק.
הערה: ודא את המיקום הנכון של סטנט צוואר הבקבוק על ידי אנגיוגרמה.
4. הדמיית PET
הערה: יום לפני העברת הגנים, בצע מנוחה ומתח 15סריקות PET/CT רדיו-מים מסומנות O (דורש טכנאי סביבת בית חולים וטכנאים רדיולוגיים).
- הדמיית ייחוס
- בצע סריקות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) לפני מנוחה והדמיית מתח. השתמש במידע CT לתיקון הנחתה.
- 15הדמיית מים רדיו-מים עם תווית O
- בצע הדמיית מנוחה ומאמץ באמצעות בולוס 800 MBq 15H2O.
- הדמיית מאמץ
- בצע הדמיית מאמץ עם בולוס מים נוסף של 800 MBq 15 O-water לאחר דעיכה רדיואקטיבית מתאימה של 12דקות.
הערה: היפרמיה נגרמת על ידי אדנוזין (200 מיקרוגרם / ק"ג / דקה תוך ורידי), כפי שתואר קודם12.
- בצע הדמיית מאמץ עם בולוס מים נוסף של 800 MBq 15 O-water לאחר דעיכה רדיואקטיבית מתאימה של 12דקות.
5. העברת גנים
- מיפוי אלקטרואנטומי
- המשך למיפוי אלקטרואנטומי לאחר אנגיוגרמה כלילית ומדידות תפקודיות (אקוקרדיוגרפיה, הדמיית LV cine).
- החדרת קטטר מיפוי לחדר שמאל דרך מעטפת הירך בהנחיה פלואורוסקופית.
הערה: רשום כ 100-150 נקודות סביב החדר השמאלי עם קטטר מיפוי כדי ליצור את המפה האלקטרואנטומית.
- סיום המפה האלקטרואנטומית
- מחק את הנקודות החריגות כדי להבטיח מפה אלקטרואנטומית אמינה יותר של החדר השמאלי.
- עשו זאת על ידי בחירת Clip Planes של המפה ומחקו את הנקודות השונות מהנקודות המרכיבות את צורת החדר. לאחר מכן, בחר מסלולים עבור תצוגת המפה ומחק את הנקודות שעברו אופקית במהלך רישום הנקודות.
הערה: יש לוודא שהנקודות הנותרות מכסות את החדר השמאלי ולרשום נקודות נוספות במידת הצורך.
- זריקות העברת גנים
- החדרת קטטר הזרקה תוך שריר הלב לחדר שמאל דרך מעטפת הירך בהנחיה פלואורוסקופית. הגדר את אורך מחט ההזרקה ל -3 מ"מ.
- קריטריונים לזריקות תוך שריר הלב
- להנחות את העברות הגנים על ידי מערכת מיפוי אלקטרואנטומית ולמקד את הזריקות לאזורים קיימא אך היפוקינטיים של החדר השמאלי.
הערה: עבור כדאיות, השתמש במתח חד קוטבי מעל 5 mV כקריטריון. עבור היפוקינזיה, בחר קיצור ליניארי מקומי (LLS) נמוך ככל האפשר, לפחות מתחת ל -12% אך עדיף מתחת ל -6% 13.
- להנחות את העברות הגנים על ידי מערכת מיפוי אלקטרואנטומית ולמקד את הזריקות לאזורים קיימא אך היפוקינטיים של החדר השמאלי.
- זריקות תוך שריר הלב
- במהלך 30 שניות, הזריקו את החומר הווקטורי לנקודת הבחירה (שלב 5.4) ושמרו את מחט ההזרקה בתוך שריר הלב למשך 5 שניות נוספות לפני הנסיגה כדי למנוע זרימה חזרה לחדר השמאלי.
6. המתת חסד ואיסוף דגימות
הערה: לאחר מדידות האנגיוגרמה הכלילית ומקטע הפליטה המתוארות בשלבים 3.4.1 ו-3.5.2, בהתאמה, יש לתת 50 מ"ל אשלגן כלורי רווי לווריד לחזיר המורדם.
- קיבוע זילוח של הלב
- קצרו את הלב מחלל בית החזה. יש לשטוף במים. מניחים מחט 18 G מעל שסתום אבי העורקים ומחברים את המחט למשאבת זילוח. לחורר את הלב עם 750 מ"ל של 1% paraformaldehyde (PFA).
- אוסף דוגמאות
- פורסים את הלב לפרוסות בעובי 1 ס"מ בעזרת סכין מטבח חדה. אספו את הדגימות מאזור העברת הגנים ל-4% PFA וחנקן נוזלי.
הערה: כדי לקצור בקרות שליליות, אספו דגימת ביקורת מהדופן האחורית של החדר השמאלי.
- פורסים את הלב לפרוסות בעובי 1 ס"מ בעזרת סכין מטבח חדה. אספו את הדגימות מאזור העברת הגנים ל-4% PFA וחנקן נוזלי.
- איסוף רקמות בטיחות
- קצרו דגימות מרקמות מרוחקות, כגון הריאה, הכבד, הכליות, הטחול והשחלות. קח דגימות לתוך 4% PFA וחנקן נוזלי.
7. אחסון דוגמאות
- אחסנו את הדגימות לצביעה ב-4% PFA למשך 48 שעות ב-4°C.
הערה: יש להחליף את ה-PFA מדי יום בנוזל טרי.- לאחר 48 שעות, החליפו את ה-PFA ב-15% סוכרוז במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן לפחות 24 שעות לפני הטמעת הדגימות בקוביות פרפין. הצמדת דגימות קפואות מאוחסנות בטמפרטורה של -70°C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההצלחה של ניתוח איסכמיה יכולה להיות מאושרת באמצעות פרוטוקול זה על ידי אנגיוגרמה כלילית ועל ידי קביעת האזור ההיפוקינטי באמצעות אולטרסאונד טרנס-חזה (איור 1) לפני שממשיכים למסירת הגן. ניתן להעריך את מצב החסימה הכלילית על ידי אנגיוגרמה כלילית, והמיפוי האלקטרואנטומי מבטיח את האזורים האיסכמיים ותרדמת החורף.
ניתן לנתח את יעילות הטיפול הגנטי על-ידי מדידת המתח ההיקפי, מקטע הפליטה וזילוח שריר הלב ב-15H2O-PET (איור 3). ניתן לאסוף את דגימות הרקמה ישירות מאזור העברת הגנים על ידי השוואת הלב למפה האלקטרואנטומית. ניתן להעריך את ביטוי הטרנסגנים ואת האנגיוגנזה הטיפולית (איור 4) באמצעות ניתוח אימונוהיסטולוגי על-ידי ניתוח מספר התאים החיוביים לאחר צביעת בטא-גלקטוזידאז ועל-ידי ניתוח אזור נימי שריר הלב לאחר צביעת CD31. בנוסף, ניתן להעריך את בטיחות הטיפול הגנטי על ידי הדמיה אבחנתית (הערכת השתפכות קרום הלב על ידי אקוקרדיוגרפיה), אימונוהיסטולוגיה וניתוח הפצה.
איור 1: פרוטוקול המחקר. איסכמיה נגרמת 14 יום לפני העברת הגנים. 15הדמיית H2O-PET מבוצעת יום אחד לפני העברת גנים ולפני המתת חסד ואיסוף דגימות. זמן איסוף הדגימה תלוי בווקטור הנגיפי ובגן הטיפולי בו נעשה שימוש. בעת שימוש בווקטורים אדנו-ויראליים, השני 15H2O-PET הוא ביוםהחמישי , ואת הזמן של איסוף הדגימההוא ביום 6 , בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערך אנגיו-מעבדה. המכונות הדרושות להתערבויות כליליות: מכשיר אולטרסאונד, מכונת הנשמה ותחנת אנגיוגרפיה, משמאל לימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונה מייצגת של זן היקפי, ו-15H2O-PET ומפה אלקטרואנטומית מהלב האיסכמי. 15H2O-PET: צבע אדום מייצג את שטח הזילוח המקסימלי, וכחול מציין את אזור ההיפופרפוזיה. מפה אלקטרואנטומית: נקודות חומות במפה האלקטרואנטומית מייצגות את אתרי ההזרקה. הצבע האדום מציין אזורים היפוקינטיים בחדר השמאלי, ואילו הסגול מציין את אזור ההתכווצות הנורמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונה מייצגת של צביעות β-גלקטוזידאז ו-PECAM-1. β-גלקטוזידאז מבוטא בלבבות מותמרים של AdLacZ וניתן להשתמש בו כדי להראות ביטוי טרנסגנים. צביעת PECAM-1 משמשת לזיהוי נימי שריר הלב ולניתוח אזור הנימים. השורה התחתונה מייצגת את האזור המרוחק מהעברת הגנים. סרגל קנה מידה בכתמים β-גלקטוזידאז: 200 מיקרומטר. סרגל קנה מידה בכתמי PECAM-1: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה מבט על ציר קצר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 2: אנגיוגרמה כלילית של LAD לפני העברת גנים. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
סרטון 3: מדידת קוטר עורק יורד קדמי שמאלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן לשנות את נקודות הזמן של פרוטוקול זה בהתאם לווקטור הנגיפי בו נעשה שימוש. כמו כן, ניתן לבחור את הניתוחים האימונוהיסטולוגיים על פי הגן הטיפולי. ניתן גם להוסיף עוד נקודות זמן ונקודות קצה לפרוטוקול במידת הצורך.
פרוטוקול זה מורכב משלבים, שהם חיוניים להצלחה ובלתי אפשריים לתיקון לאחר מכן. ראשית, אם לא מצליחים לגרום לאיסכמיה מתאימה, יש להוציא את בעל החיים מהליכים וניתוחים נוספים. סטנדרטיזציה של השיטות וההדמיה היא קריטית כדי שהתוצאות יהיו דומות בין נקודות הזמן לבעלי החיים. שנית, יש לאסוף את הדגימות מאזור העברת הגנים המדויק ולעבד אותן בהצלחה כדי לבצע ניתוחים נוספים. כמו כן, פרוטוקול זה דורש היכרות מעמיקה עם פרוצדורות אנגיוגרפיות ושיטות הדמיה שונות. לדוגמה, אנגיוגרמה כלילית וזריקות ויראליות ללב פועם דורשות הכשרה מקיפה וכן ביצוע אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה נכונה. עם זאת, שיטות הדמיה אלה מודדות את תפקוד שריר הלב ואת הזלוף כדי לספק מידע חיוני למחקרים נוספים.
מערכת הלב וכלי הדם של חזיר דומה לאדם בשל הדמיון האנטומי והפיזיולוגי שלה, ולכן, חזירים משמשים לעתים קרובות כדי מודל מכניקה מחלות לב וכלי דם ונהלים. עם זאת, זמן המעקב מוגבל לכ -6 חודשים בשל הצמיחה המהירה של החיה. לאחר 6 חודשים, הטיפול בבעל החיים הופך מאתגר, ואיכות ההדמיה מידרדרת.
כמו כן, חזירים עמידים במידה ניכרת לטרשת עורקים, מה שהופך את טרשת העורקים הנגרמת על ידי דיאטה למסובכת למודל בחזירים17. עם זאת, מודלים של איסכמיה כרונית פותחו כדי לחקות את המחלה המקורית. היתרון המשמעותי של מודל איסכמיה של סטנט צוואר בקבוק המשמש בפרוטוקול זה הוא שהחסימה ההדרגתית של הסטנט מייצגת מחלת עורקים כליליים טוב יותר מאשר חסימה פתאומית. בהשוואה למודל מכווץ האמרואידים, שיטה זו פחות פולשנית. שנית, מיקום סטנט צוואר בקבוק מלעורי הוא הליך מהיר לביצוע. שימוש במערכת המיפוי האלקטרואנטומי מאפשר לכוון את העברת הגן לשריר הלב הנכנס לתרדמת חורף, ולא לאזור האוטם, וזו תוצאה אפשרית כאשר משתמשים בהנחיית אולטרסאונד כדי לכוון את הזריקות. עם זאת, החיסרון של המיפוי האלקטרואנטומי הוא אורך ההליך. יתר על כן, מכיוון שלב החזיר רגיש מאוד להפרעות קצב חדריות, המיפוי יכול לגרום לפרפור חדרים במהלך הליך המיפוי. עם זאת, הפרעות קצב אלה הם דפיברילציה בקלות.
נקודות הקצה המשמשות במודל בעלי חיים גדול זה מזהות את אלה המשמשות בניסויים קליניים, ומשפרות את המעבר למרפאות. בנוסף, שיטות אלה ישימות למחקרים גדולים בבעלי חיים המעריכים את היעילות של טיפול גנטי בשריר הלב עם זמני מעקב שונים ונקודות קצה נלוות אחרות בנוסף לאלה המתוארות במודל זה. פרוטוקול זה עבר סטנדרטיזציה לאחר ניסיון רב של ניסויים גדולים בבעלי חיים. בעתיד, פרוטוקול זה חל על הערכת הבטיחות והיעילות של טיפול גנטי בשריר הלב לפני תרגומו למרפאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות למריה הדמן, טאינה לאיטינן, טומי לאיטינן, פקה פוטיינן, אניקה וירן וסברי סורמונן על הסיוע ואישור 15הדמיות O-PET בבית החולים האוניברסיטאי קופיו; והייקי קארהונן (Heikki Karhunen), מינה טורונן (Minna Törrönen) ורייקה ונליינן (Riikka Venäläinen) מהמרכז הלאומי לחיות מעבדה על עזרתם בעבודת בעלי חיים.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהאקדמיה הפינית, ERC ומענק CardioReGenix EU Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
- Naghavi, M., et al. Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Davies, A., et al. Management of refractory angina: An update. European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Hammond, H. K., et al. Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).
- Hartikainen, J., et al. Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up. European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).
- Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology. Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).
- Roth, D. M., et al. Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium. The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).
- White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion. Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).
- Liu, C. -B., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia. Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).
- Rissanen, T. T., et al. The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).
- Greenberg, N. L., et al. Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility. Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).
- Grönman, M., et al. Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction. Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).
- Tarkia, M., et al. Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs. Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).
- Gyöngyösi, M., Dib, N. Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).
- Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine. Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).
