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Methodenartikel

Nukleosidtriphosphat-Hydrolasen-Assay in Toxoplasma gondii und Neospora caninum für das Hochdurchsatz-Screening mit einem Roboterarm

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DOI:

10.3791/62874

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22. Juli 2022

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1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Infektionen mit Toxoplasma gondii und Neospora caninum kommen bei Menschen und Tieren vor und führen zu ernsthaften gesundheitlichen Problemen. Die beiden Parasiten teilen sich ähnliche Nukleosidtriphosphat-Hydrolasen und spielen eine wichtige Rolle bei der Vermehrung und dem Überleben. Wir haben einen High-Standard-Assay der Enzyme etabliert, die den Einsatz von Roboterarmen erfordern.

Zusammenfassung

Protozoen-Parasiten infizieren den Menschen und viele warmblütige Tiere. Toxoplasma gondii, ein wichtiger Protozoen-Parasit, kommt häufig bei HIV-positiven Patienten, Empfängern von Organtransplantaten und schwangeren Frauen vor, was zu dem schweren Gesundheitszustand Toxoplasmose führt. Ein weiteres wichtiges Protozoen, Neospora caninum, das viele Ähnlichkeiten mit Toxoplasma gondii aufweist, verursacht bei Tieren schwere Krankheiten, ebenso wie Enzephalomyelitis und Myositis-Polyradikulitis bei Hunden und Kühen, die zu totgeborenen Kälbern führen. Alle diese wiesen ähnliche Nukleosidtriphosphat-Hydrolasen (NTPase) auf. Neospora caninum hat eine NcNTPase, während Toxoplasma gondii eine TgNTPase-I hat. Es wird angenommen, dass die Enzyme eine entscheidende Rolle bei der Vermehrung und dem Überleben spielen. Um Verbindungen und/oder Extrakte zu etablieren, die eine Protozoeninfektion verhindern, haben wir diese Enzyme für die Wirkstoffforschung ins Visier genommen. Der nächste Schritt bestand darin, einen neuartigen, hochsensitiven und hochgenauen Assay zu etablieren, indem ein konventioneller biochemischer Enzymassay mit einem Fluoreszenzassay kombiniert wurde, um den ADP-Gehalt zu bestimmen. Wir haben auch validiert, dass der neuartige Assay die Kriterien für die Durchführung eines Hochdurchsatz-Screenings (HTS) in den beiden Protozoen-Enzymen erfüllt. Wir führten HTS durch und identifizierten 19 Verbindungen und sechs Extrakte aus zwei synthetischen Wirkstoffbibliotheken bzw. einer Extraktbibliothek aus Meeresbakterien. In dieser Studie wurde eine detaillierte Erklärung zur Durchführung von HTS eingeführt, einschließlich Informationen über die Vorbereitung von Reagenzien, Geräten, Roboterarm usw.

Einleitung

Die Robotik hat sich als hochentwickeltes und leistungsfähiges Werkzeug etabliert, um bedeutende Durchbrüche in verschiedenen Bereichen jenseits der Industrie und der Fabrikationstechnik zu erzielen, wie z. B. Biochemie, Molekularbiologie und klinische Forschung, insbesondere HTS 1,2,3. Toxoplasma gondii ist ein wichtiger Parasit und ein einzelliger parasitärer Eukaryot4, der beim Menschen5 und vielen homöothermen Tieren4 ernsthafte Gesundheitsprobleme verursacht, was zu Infektionen führt, die zu Toxoplasmose führen, einer besonders schweren Erkrankung bei AIDS-Patienten6, Organtransplantierten7 und schwangeren Frauen8. Neospora caninum, die zum Stamm Apicomplexa9 gehört, infiziert hauptsächlich Hunde und Kühe6, was bei Hunden zu Enzephalomyelitis und Myositis-Polyradikulitisführt 10,11 und bei Kühen zu Aborten12,13. Darüber hinaus weist Neospora caninum morphologische und phylogenetisch große Ähnlichkeiten mit Toxoplasma gondiiauf 9,14. Zusätzlich verfügen sie über eine Nukleosidtriphosphathydrolase (NTPase; EC3.6.1.15)14. Die Enzyme unterscheiden sich deutlich von der herkömmlichen Ekto-ATPase14. Diese Parasiten erzeugen eine beträchtliche Menge an NTPase-Proteinen, 2%-8% des Gesamtproteins und spielen eine wichtige Rolle als ruhende Enzyme in ihrem Tachyzoitenstadium15. Es ist zu beachten, dass in dichten sekretorischen Granulaten diesekondensiert sind 16 und in die parasitophore Vakuole16 sezerniert werden. Als biochemischer enzymatischer Charakter wird die NTPase durch Dithiothreitol17 aktiviert. Es wird vorhergesagt, dass die Induktoren wie die Dithiolverbindung, ein nicht identifiziertes Enzym wie die Dithioldisulfid-Oxidoreduktase und ein weiteres die gleiche Natur aufweisen. Bei Parasiten wurden sie bisher nicht nachgewiesen. Das Enzym spielt jedoch eine wichtige Rolle bei der Freisetzung von Tachyzoit aus infizierten Wirtszellen17.

Toxoplasma gondii weist zwei NTPase-Isoformen18 auf: das Typ-I-Enzym TgNTPase-I und das Typ-II-Enzym TgNTPase-II18. Ersteres verwendet bevorzugt Triphosphatnukleoside als Substrat18. Letzteres hydrolysiert sowohl Triphosphat- als auch Diphosphatnukleoside18. Die Homologie beträgt 97% in den Aminosäuregehalten18. Neospora caninum hat auch einen Ortholog der TgNTPase-I namens NcNTPase19. Die Homologie beträgt 73% in den Aminosäuregehalten19. Prof. Asai und Prof. Harada erzeugten Rekombinanten beider NTPase mit Hilfe von E. coli. und veränderten die konstitutiv aktiven Mutanten dieser Mutanten, wie bereits berichtetwurde 20. Sie haben den beiden aktiven Mutanten freundlicherweise ein Geschenk gemacht. Beide Enzyme können ATP in vitro in ADP umwandeln 20. Vor kurzem haben wir die Aktivität der NTPase anhand des ADP-Gehalts gemessen, der von den Enzymen hydrolysiert wird. Schließlich ist es uns gelungen, den High-Standard-Assay durch den Prozess der Bestimmung des ADP-Gehalts mit einer Kombination aus Fluoreszenz und enzymatischer Reaktion zu etablieren, wie bereits berichtet21,22. Wir haben auch ein Hochdurchsatz-Screening (HTS)22 durchgeführt.

Diese Studie stellt detaillierte Verfahren eines neuartigen hochpräzisen und dynamischen Assays21 vor und eine detaillierte Erklärung, wie Reagenzien zur Messung der Enzymaktivität und zur Entwicklung der Fluoreszenzintensität mit einem Roboterarm für HTS hergestellt werden.

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Protokoll

1. Expression und Aufreinigung der rekombinanten TgNTPase-I und NcNTPase

  1. Bereiten Sie das Expressionsplasmid vor und führen Sie es in die E. coli ein. Stamm BL21.
    HINWEIS: Detaillierte Informationen zu Konstrukten und Verfahren wurden in einem früheren Bericht14 gezeigt. In dieser Studie wurden sowohl TgNTPase-I- als auch NcNTPase-konstitutiv aktive Mutanten freundlicherweise von Prof. Asai und Prof. Harada zur Verfügung gestellt.

2. Vorbereitung und Platzierung der biofluoreszierenden Reaktionslösung auf der Platte

  1. Bereiten Sie 2x Biofluoreszenz-Reaktionslösung wie in Tabelle 1 beschrieben für 2 ml Mastermix für einen 400-Well-Assay im 384-Well-Format vor.
  2. Herstellung von Stammlösungen mit destilliertem Wasser (DW) für jede angegebene Konzentration mit Ausnahme von Resazurin und N-Ethylmaleimid. Die verbleibenden zwei Reagenzien werden mit DMSO in der entsprechenden Konzentration gelöst. Lagern Sie dann die Reagenzien bei -30 °C, bis die Experimente durchgeführt werden können.
  3. Geben Sie 15 μl 2x Biofluoreszenz-Reaktionslösung in jede der 368 Vertiefungen (384-Well-Format).
    HINWEIS: Die erste Platte dient als Reservoir, um genügend Reagenz für die zweimalige Durchführung von Experimenten zu haben.

3. Geben Sie die Testverbindungen oder Extrakte auf den Boden jeder Vertiefung in der Assay-Platte

  1. Geben Sie 0,5 μl jeder Verbindung mit einem Roboterarm von der Mutterplatte der Bibliothek auf den Boden der Platte, einschließlich der Testverbindungen.
  2. Fügen Sie 0,5 μl DMSO sowohl zur Negativ- als auch zur Positivkontrolle hinzu.

4. Vorbereitung des Enzymreaktionsgemisches und Beginn der Reaktion

  1. Die Enzymreaktionslösung wird wie in Tabelle 2 angegeben hergestellt.
  2. Geben Sie NTPase (Endkonzentration beträgt 0,0002 μg/ml) zu 50 mL des Enzymreaktionsgemisches, mischen Sie es schnell und geben Sie es in ein Kunststoffreservoir.
  3. Fahren Sie fort, mit dem Roboterarm gleichzeitig 4,5 μl in jede Vertiefung zu injizieren, mit Ausnahme der negativen Kontrollleitung.
  4. Geben Sie die gleiche Menge des Enzymreaktionsgemisches mit PBS anstelle des Enzyms, dem die gleichzeitige Injektion vorausging.
  5. Stellen Sie die Platte für 10 min bei 37 °C in einen Inkubator.

5. Durchführung von Echtzeitmessungen enzymatischer Aktivitäten mit einem Mikroplatten-Reader

  1. Nach 10 Minuten Inkubation gleichzeitig 5 μl 2x Biofluoreszenz-Reaktionslösung sofort mit dem Roboterarm in jede Vertiefung geben.
  2. Halten Sie den Roboterarm vorübergehend an, um die Lösung in jeder Spitze über der Stelle zu halten, an der die Platte platziert werden soll.
  3. Sobald die Assay-Platte an Ort und Stelle ist, starten Sie den Roboterarm neu.
    HINWEIS: Um eine Sättigung des erzeugten ADP zu vermeiden, messen Sie sofort die Fluoreszenzintensität.
  4. Drehen Sie die Platte schnell herunter (200 x g für 1 min) und legen Sie die Platte in den Tellerleser.
  5. Starten Sie die Echtzeitmessung der Fluoreszenz bei 540 nm/590 nm (Anregung/Emission) jede Minute für 1 h.

6. Analyse der Ergebnisse

  1. Berechnung der Werte als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus den angezeigten und replizierten Stichproben in jeder Versuchsgruppe; Replizieren Sie Experimente, um Konsistenz zu gewährleisten.
  2. Führen Sie die statistische Signifikanz mit dem t-Test eines Schülers durch.
  3. Berechnen Sie Werte als statistisch signifikant, wenn die P-Werte P < 0,05 sind.
  4. Berechnen Sie das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis (S/B), das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) und den Z'-Faktor mit den folgenden Formeln:
    S/B = Durchschnittlicher Ligand/Durchschnittliches Vehikel
    S/N = (Durchschnittlicher Ligand - Durchschnittliches Fahrzeug)/Fahrzeug mit Standardabweichung
    Z'-Faktor = 1 - (3 x Standardabweichung Ligand + Standardabweichung Fahrzeug)/(Durchschnittlicher Ligand - Durchschnittliches Fahrzeug)
  5. Stellen Sie sicher, dass der S/B-, S/N- und Z'-Faktor größer als 3, 10 bzw. 0,5 ist.
    HINWEIS: Bestätigen Sie, ob jeder Versuch das allgemeine Kriterium erfüllt, das für die Durchführung von HTS ausreicht, wie in den vorherigen Berichten23,24 angegeben.

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Ergebnisse

Ein Prinzip des Assays ist in der ergänzenden Abbildung 1 zusammengefasst und basiert auf einem früheren Bericht12,18. Der Assay wurde in einem 384-Well-Format entwickelt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die äußersten rechten und linken Linien wurden auf der Platte vermieden. Die beiden Linien neben der linken und rechten Linie wurden dann als Negativ- bzw. Positivkontrolle mit oder ohne Enzym verwendet (n = 16). Dad...

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Diskussion

Es ist uns gelungen, einen neuartigen High-Dynamic-Range- und -Accuracy-Assay mit einer Kombination aus einem klassischen Enzymassay und einem Fluoreszenzassay für ADP zu etablieren, das das Endprodukt durch ATPase ist, einschließlich Tg und NcATPase 22. Für die Durchführung von HTS ist es wichtig, dass der Assay bessere Werte für S/B, S/N und Z'-Faktor aufweist als ein klassischer Enzymassay15,22. Darüber...

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Offenlegungen

Die Autoren haben kein finanzielles Interesse an dieser Studie.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise von der Platform for Drug Discovery, Informatics and Structural Life Science, einem Grant-in-Aid for Scientific Research (C) der Japan Society for Promotion of Science (JSPS-21K06566), unterstützt. Die Autoren danken Asai (Keio University School of Medicine) und Harada (Kyoto Institute of Technology) sowie Stephen Stratton herzlich für die Schenkung von zwei rekombinanten NTPase-aktiven Mutanten bzw. für seinen Beitrag zur Erstellung dieses Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12 Stage-Workstations EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRoboterarm Pippe-System
384 Well-SpitzenBiotech Co., Ltd.Maßgeschneiderte
ADP-HexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOrientalische Hefe, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika GmbHDi-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P DehydrogenaseOrientalische Hefe, Co, Ltd.306-50143
GlukoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 Well Mikroplatte nicht bindend flach Well Schwarz#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOrientalische Hefe, Co., Ltd.44332000
N-EthylmaleimidWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSMultimode-Mikroplatten-Reader
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low Profile ReservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.Artikel-Nr.: 35501-02

Referenzen

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