Methodenartikel

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

DOI:

10.3791/62882

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28. September 2021

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1Department of Entomology, National Chung Hsing University, 2Department of Agricultural biology, Jeonbuk National University, 3Department of Agricultural Convergence Technology, Jeonbuk National University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

Zusammenfassung

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Entomopathogene Pilze (EPF) sind eines der mikrobiellen Bekämpfungsmittel für den integrierten Pflanzenschutz. Um lokale oder invasive Schädlinge zu bekämpfen, ist es wichtig, einheimische EPF zu isolieren und auszuwählen. Daher wurde in dieser Studie die Bodenködermethode in Kombination mit dem Insektenködersystem (Mehlwurm, Tenebrio molitor) mit einigen Modifikationen verwendet. Die isolierten EPF wurden dann dem Virulenztest gegen den landwirtschaftlichen Schädling Spodoptera litura unterzogen. Darüber hinaus wurden die potenziellen EPF-Stämme morphologischen und molekularen Identifizierungen unterzogen. Darüber hinaus wurden die Konidienproduktion und der Thermotoleranztest für die vielversprechenden EPF-Stämme durchgeführt und verglichen; Diese Daten wurden weiter in die Formel der effektiven Konidienzahl (ECN) für das Laborranking substituiert. Das Bodenköder-Mehlwurm-System und die ECN-Formel können verbessert werden, indem Insektenarten ersetzt und mehr Stressfaktoren für die Bewertung der Kommerzialisierung und Feldanwendung integriert werden. Dieses Protokoll bietet einen schnellen und effizienten Ansatz für die EPF-Selektion und wird die Forschung an biologischen Bekämpfungsmitteln verbessern.

Einleitung

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Derzeit werden entomopathogene Pilze (EPF) häufig bei der mikrobiellen Bekämpfung von landwirtschaftlichen, forstwirtschaftlichen und gartenbaulichen Schädlingen eingesetzt. Die Vorteile von EPF sind seine große Wirtsbreite, gute Umweltanpassungsfähigkeit, umweltfreundliche Natur und dass es mit anderen Chemikalien verwendet werden kann, um den Synergieeffekt für den integrierten Pflanzenschutz zu zeigen1,2. Für die Anwendung als Schädlingsbekämpfungsmittel ist es notwendig, eine große Anzahl von EPF entweder aus erkrankten Insekten oder der natürlichen Umgebung zu isolieren.

Die Pr....

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Protokoll

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HINWEIS: Das gesamte Flussdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Isolierung und Selektion potenzieller entomopathogener Pilze (EPF)

  1. Sammeln Sie die Bodenprobe
    1. Entfernen Sie 1 cm der Oberflächenerde und sammeln Sie dann den Boden innerhalb der 5-10 cm Tiefe mit einer Schaufel von jeder Probenahmestelle.
      HINWEIS:Probenahmestellen wären Berg-, Wald- oder dünn besiedelte Gebiete, um die Kontamination künstlich versprühter EPF-Stämme zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Bereiche für die Bodenprobenentnahme an der Oberfläche mit Unkraut bedeckt sind. Trockener Boden oder feuchter Boden....

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Ergebnisse

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Isolierung und Selektion potentieller entomopathogener Pilze (EPF)
Durch die Verwendung der Tenebrio molitor-vermittelten entomopathogenen Pilze (EPF) Bibliotheksbauweise würde die Anzahl der Pilze ohne insektentötende Aktivität ausgeschlossen; somit könnte die Isolationseffizienz und selektion von EPF stark erhöht werden. Bei der Anwendung dieser Methode wurden die Informationen über Probenahmestellen, Bodenproben und die Pilzkeimungsraten erfasst (T.......

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Diskussion

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Entomopathogene Pilze (EPF) wurden zur Insektenbekämpfung eingesetzt. Es gibt mehrere Methoden zum Isolieren, Auswählen und Identifizieren von EPF30,31,32. Im Vergleich der verschiedenen Arten von Insektenködermethoden wurden Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae häufig in Insektenködern gefunden6,12,13,14.

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass in dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch Grant 109-2313-B-005-048-MY3 des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar Bakteriologische QualitätBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGR001Geeignet für die meisten Zellkultur-/Molekular- und Biologieanwendungen.
AGAROSE, Biotechnologische QualitätBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001Für die DNA-Elektrophorese.
BioGreen Safe DNA Gel BufferBIOMANSDB001T
Messing KorkbohrerDoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450DFür Rekordstamm Koloniemorphologie
Inkubator mit konstanter TemperaturYihder Co., Ltd.LE-509RDPilzhaltung.
cubee Mini-ZentrifugeGeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image SystemTOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0,2 bis 2 µ L PipetteThermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1 bis 10 µ L PipetteThermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10 bis 100 µ L PipetteThermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100 bis 1000 µ L PipetteThermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2 bis 20 µ L PipetteThermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20 bis 200 µ L PipetteThermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH100
Genius Dry Bath IncubatorMajor ScienceMD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mLSIBATASABP-1195906Messen Sie das Volumen der Reagenzien.
HandzählerSDI NO.1055
HämozytometerbiomanAP-0650010Berechnen Sie die Anzahl der Sporen
ImpfschlaufeDoggerD8GA-23000
DeckelIDEAHOUSERS92004
Micro Cover GlassMUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD24241
Mikroskop-BildgebungssystemSAGE VISION CO.,LTDSGHD-3.6C
ObjektträgerDOGGERDG75001-07105
Mupid-2plus DNA-GelelektrophoreseADVANCEAD110
Nikon Optisches MikroskopSAGE VISION CO.,LTDEclipse CI-L
PlastikbecherIDEAHOUSECS60016
Presto Mini gDNA Hefe KitGeneaidGYBY300Genomisches DNA-Extraktionskit für Pilze
Sabouraud Dextrose-Bouillon (Sabouraud Liquid Medium)HiMedia Leading BioSciencesCompany M033Wird für die Kultivierung von Hefen, Schimmelpilzen und sauren Mikroorganismen verwendet.
Skalpellklinge Nr.23Swann-Morton310
Skalpellgriff Nr.4AGARWAL SURGICALSSSS -FOR-01-91
SchaufelSpeichern & SafeA -1580242 -00
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Sorvall Legend Micro 17 MikrozentrifugeThermo Scientific75002403
StahlpinzetteSIPEL ELECTRONIC SAGG-SA
Sterile PetrischaleBIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.1621Flache, zylindrische Behälter mit angepassten Deckeln, speziell für die Verwendung in der Mikrobiologie oder Zellkultur.
ThermoCell MixingBlockBIOERMB-101
Tween 80FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation164-21775
TwinGuard ULT GefrierschrankPanasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.MDF-DU302VX-80° C-Probe gelagert.
Vertikaler BodenschrankChih ChinBSC-3Pilz Betrieb Kultivierung.
Vortex Genie IIScientificSIG560
Aufbewahrungstaschen mit ReißverschlussSparen & SicherA -1248915 -00
100 bp DNA LadderGeneaidDL007-20
° C GefrierschrankFRIGIDAIREFrigidaireFFFU21M1QW-20°; C-Probe und experimentelle Reagenzien aufbewahrt.
2X SuperRed PCR Master MixTOOLSTE-SR01
50X TAE PufferBIOMANTAE501000

Referenzen

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  1. Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Flor....

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Schlagwörter

Bodenk der MethodeKonidienproduktionThermotoleranz AssayPathogenit tsscreeningmolekulare IdentifizierungSpodoptera liturabiologische Sch dlingsbek mpfung

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