Verbesserter Enzymschutzassay zur Untersuchung der Internalisierung von Staphylococcus aureus und der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie das Ausmaß der Internalisierung von Staphylococcus aureus und seine Überlebensfähigkeit in der menschlichen Wirtszelle sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen untersucht werden können.

Zusammenfassung

Staphylococcus aureus exprimiert Virulenzfaktoren, um seine Internalisierung in Eukaryotenzellen auszulösen und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu überleben. Dieser Artikel beschreibt einen Enzymschutztest, um das Ausmaß der S. aureus-Internalisierung und sein intrazelluläres Überleben in adhärenten nicht-professionellen phagozytären Zellen (NPPCs) sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen zu untersuchen. NPPCs werden in einer Multi-Well-Platte gezüchtet, bis sie 100% Konfluenz erreichen. S. aureus-Kulturen werden über Nacht im Zellkulturmedium gezüchtet. Die Bakteriensuspension wird entsprechend der Anzahl der Zellen pro Vertiefung verdünnt, um die Zellen bei einer kontrollierten Vielzahl von Infektionen zu impfen. Inokulierte Zellen werden für 2 h inkubiert, damit die Bakterien von den NPPCs internalisiert werden können, wonach Lysostaphin dem Kulturmedium hinzugefügt wird, um extrazelluläre Bakterien selektiv abzutöten. Lysostaphin ist im Kulturmedium für den Rest des Experiments vorhanden.

Zu diesem Zeitpunkt könnten die infizierten Zellen mit antimikrobiellen Verbindungen inkubiert werden, um ihre intrazellulären Aktivitäten gegen S. aureus zu bewerten. Als nächstes werden die Zellen dreimal gewaschen, um die Medikamente zu entfernen, und die intrazelluläre S. aureus-Last wird dann durch Kultivierung auf Agarplatten quantifiziert. Alternativ könnte Lysostaphin zur Untersuchung von Staphylokokken-Virulenzfaktoren, die am intrazellulären Überleben und der Zelltoxizität beteiligt sind, mit Proteinase K inaktiviert werden, um die Notwendigkeit von Waschschritten zu eliminieren. Dieser Tipp verbessert die Zuverlässigkeit der intrazellulären bakteriellen Belastungsquantifizierung, insbesondere wenn Zellen dazu neigen, sich von der Kulturplatte zu lösen, wenn sie sich aufgrund der Vermehrung des intrazellulären S. aureus stark infizieren. Diese Protokolle können mit praktisch allen Arten von adhärenten NPPCs und mit 3D-Zellkulturmodellen wie Organoiden verwendet werden.

Einleitung

Staphylococcus aureus ist sowohl ein lebensbedrohlicher Erreger als auch ein kommensales Bakterium der Haut und der Schleimhaut, das zwei Milliarden Menschen auf der ganzen Welt ^besiedelt1. Beim Menschen haben nasale Träger von S. aureus ein erhöhtes Infektionsrisiko mit ihrem eigenen Transportstamm; die multifaktoriellen Determinanten des S. aureus-Schleimhauttransports sind jedoch noch ^unklar1,2. Neben akuten Infektionen können Patienten auch chronische S. aureus-Infektionen entwickeln, die oft schwer zu heilen ^sind3. Ein besseres Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen während der Kolonisation und Infektion ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien und die Verbesserung des Patientenmanagements.

In vitro kann S. aureus seine Internalisierung in Wirtszellen auslösen, die das α5β1-Integrin4 exprimieren. Die dreigliedrige Interaktion zwischen den staphylokokkalen Fibronektin-bindenden Proteinen, die an der Zellwand von S. aureus, dem Fibronektin, verankert sind, und dem β1-Integrin, das an der Wirtszelloberfläche exprimiert wird, ist als Hauptweg der S. aureus-Internalisierung in NPPCs wie Keratinozyten, Osteoblasten, Fibroblasten und Epithel- und Endothelzellen ^bekannt4. Neuere Studien zeigen, dass S. aureus während der Nasenbesiedlung5,6 und der Infektion in menschlichen Zellen gefunden werden ^kann7. Die Rolle des intrazellulären Reservoirs bei der Pathogenese der S. aureus-Infektion bleibt jedoch unklar. Die Wirtszellen könnten als Schutz für S. aureus dienen, das sowohl vor dem ^Immunsystem8 als auch vor den meisten antimikrobiellen Verbindungen geschützt ^ist6,9.

Der Lysostaphin-Schutzassay, der Anfang der ^1980er Jahre von Proctor10 beschrieben wurde, ermöglicht die Untersuchung von Bakterien- und Wirtsfaktoren, die an der Internalisierung von S. aureus-Isolaten beteiligt sind. Lysostaphin ist ein von Staphylococcus simulans produziertes Bakteriozin, das eine starke Aktivität gegen fast alle S. aureus-Isolate , einschließlich antibiotikaresistenter Stämme^{, aufweist11}. Lysostaphin wurde verwendet, um nur extrazelluläre S. aureus zu zerstören, um die Zählung nur lebensfähiger intrazellulärer Bakterien zu ^{ermöglichen12}. Diese Technik ist weit verbreitet und hat zur Entdeckung mehrerer Virulenzfaktoren von S. aureus beigetragen. Gentamycin, allein und in Kombination mit Lysostaphin, wird auch häufig verwendet, um intrazelluläre Bakterien zu untersuchen.

Eine aktuelle Studie zeigte jedoch, dass Gentamycin in eukaryotische Zellen eindringt und verinnerlichte Bakterien zeit- und konzentrationsabhängig ^erreicht13. Diese Studie zeigte auch, dass Lysostaphin nicht in eukaryotische Zellen gelangt, was bestätigt, dass ein Lysostaphin-basierter Enzymschutztest (EPA) der genaueste Assay zur Quantifizierung der intrazellulären S. aureus-Belastung durch Kultur ^ist13. Unabhängig davon, welche Verbindung zur Zerstörung extrazellulärer Bakterien (z. B. Lysostaphin oder Gentamycin) verwendet wird, sollte sie durch Waschen der Zellen entfernt werden, bevor intrazelluläre S. aureus auf Agarplatten plattiert wird. Sukzessive Waschungen können zur Ablösung von Zellen, insbesondere von schlecht haftenden Zellen (z. B. stark infizierten Zellen), führen, was zu einer Unterschätzung der intrazellulären S. aureus-Last führen würde. Dieser Artikel beschreibt detailliert, wie EPA verwendet werden kann, um die intrazelluläre S. aureus-Belastung zu quantifizieren und die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen mit einem In-vitro-Modell zu messen. Bemerkenswert ist, dass eine einfache Methode vorgeschlagen wurde, um die Zuverlässigkeit der intrazellulären Wägequantifizierung zu verbessern, indem intensive Wäschen vermieden werden.

Protokoll

1. Kultur menschlicher Epithelzellen

1. Bereiten Sie ein komplettes Kulturmedium mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) hoher Glukose mit Phenolrot vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) ohne Antibiotika.
2. Züchtung von A549-Epithelzellen im vollständigen Kulturmedium bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2. Stellen Sie sicher, dass ein Kulturgefäß von geeigneter Größe verwendet wird, um genügend Zellen für nachfolgende Schritte zu haben (siehe Schritt 1.10).
   HINWEIS: Ein 75 ^cm2 (T-75) Kolben reicht aus, um zwei 24-Well-Platten zu säen und die Zellen zu subkulturieren.
3. Bereiten Sie zwei Tage vor der Infektion eine einzelne 24-Well-Platte vor.
4. Entfernen und entsorgen Sie das verbrauchte Kulturmedium aus dem T-75-Kolben und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
5. 5 ml Trypsin-EDTA zugeben und die Zellen für 5 min bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2 inkubieren.
6. Fügen Sie 5 ml komplettes Kulturmedium hinzu und übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen.
7. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 300 × g.
8. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 10 ml frischem Gesamtkulturmedium resuspendieren.
9. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler (oder einer Zählkammer).
10. Verdünnen Sie die Zellen in einem vollständigen Kulturmedium, um 30 ml Zellsuspension in einer Konzentration von 2,0 × ¹⁰⁵ Zellen / ml herzustellen.
11. 1 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte geben, was einer Zelldichte von etwa 1,0 × ¹⁰⁵ Zellen/cm² für eine Bohrlochfläche von 2 cm² entspricht.
12. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2 , bis sie 100% Konfluenz erreichen.
    HINWEIS: Zusätzlich zu den zu prüfenden Bedingungen sollten drei Vertiefungen für die Zellzählung am Tag der Infektion reserviert werden (siehe Schritt 3.1.4). Je nach Anzahl der zu prüfenden Bedingungen können bis zu zwei 24-Well-Platten gleichzeitig vorbereitet werden. Die im Protokoll angegebenen Volumina sollten entsprechend erhöht werden.

2. Kultur von S. aureus-Stämmen

1. Bereiten Sie zwei Tage vor der Infektion ein komplettes Infektionsmedium mit DMEM hoher Glukose ohne Phenolrot vor, ergänzt mit 10% FBS ohne Antibiotika.
2. Auftauen S. aureus-Stämme, die auf Agarplatten getestet werden sollen.
3. Die Agarplatten für 18-24 h bei 36 ± 1 °C inkubieren.
4. Am Tag vor der Impfung wird eine Kolonie des S. aureus-Stammes geimpft, die in 10 ml vollständigem Infektionsmedium getestet werden soll.
5. Inkubieren Sie die Bakterien für 18-24 h bei 36 ± 1 °C mit Schütteln bei 160 U / min. Verwenden Sie 50 ml Röhrchen, die bei 45 ° gehalten werden, um zu vermeiden, dass sich die Bakterien absetzen.
   HINWEIS: Bevor Sie mit einem neuen Stamm beginnen, wird empfohlen, seine Lysostaphin-Suszeptibilität unter den gleichen Kulturbedingungen zu überprüfen, die für weitere Experimente verwendet werden (Medien, Bakterienbelastungen und Lysostaphinkonzentration und Inkubationszeit). Es ist auch wichtig, die Bakterienbelastung zu bestimmen, die einem _OD600nm von 0,5 entspricht, da sie von einem Stamm zum anderen leicht variieren kann. Die Kulturbedingungen von Bakterienstämmen könnten entsprechend dem experimentellen Ziel angepasst werden.

3. Infektionstest mit S. aureus

1. Bestimmung der Zelldichte und Lebensfähigkeit
   1. Entfernen und entsorgen Sie das verbrauchte Kulturmedium aus den drei Vertiefungen, die für die Zählung von A549-Zellen vorgesehen sind.
   2. 1 ml vollständiges Infektionsmedium mit 5 μg/ml Hoechst 33342 und 1 μg/ml Propidiumiodid enthält.
      HINWEIS: Hoechst 33342 ist ein bekanntes Mutagen und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Propidiumiodid, ein potenzielles Mutagen, muss mit Sorgfalt behandelt und gemäß den geltenden Vorschriften sicher entsorgt werden.
   3. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2.
   4. Zählen Sie die Zellzahl und berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit mit einem Schwingfeld-Fluoreszenzmikroskop.
      HINWEIS: Wenn kein Fluoreszenzmikroskop verfügbar ist, kann die Zelldichte und Lebensfähigkeit mit Trypanblaufärbung unter Verwendung einer Zellzählkammer berechnet werden.
2. Herstellung der Bakteriensuspension
   1. 25 ml vollständiges Infektionsmedium in ein Röhrchen geben und bei 36 ± 1 °C vorwärmen.
   2. Stellen Sie die S. aureus Suspension mit einem Zelldichtemessgerät auf _anOD600nm von 0,5 in einem vollständigen Infektionsmedium ein.
   3. Bereiten Sie 20 ml Bakteriensuspension für die Zellimpfung vor, indem Sie die 0,5 _OD600nm im vollständigen Infektionsmedium verdünnen, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 1 entsprechend der Anzahl der Zellen pro Vertiefung zu erreichen.
      HINWEIS: Der MOI entspricht der Anzahl der Bakterien, die pro Zelle in jeder Vertiefung hinzugefügt werden. Um beispielsweise einen MOI von 1 mit 1,0 × ¹⁰⁶ Zellen pro Vertiefung zu erreichen, wird eine Bakteriensuspension bei 2,0 × ¹⁰⁶ KBE/ml hergestellt, so dass ¹⁰⁶ KBE in einem Volumen von 500 μL zugegeben werden können (siehe Schritt 3.3.3). Der MOI kann entsprechend den zu testenden Zelltypen und Bakterienstämmen angepasst werden.
   4. Verwenden Sie einen automatischen Spiralplattenschneider, um die S. aureus-Last der verdünnten Bakteriensuspension zu bestimmen, die für den Zellimpfungsschritt verwendet werden soll.
   5. Die Agarplatten für 18-24 h bei 36 ± 1 °C inkubieren.
   6. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien mit einem Koloniezähler, um den genauen MOI für jeden getesteten Stamm zu berechnen.
      HINWEIS: Wenn kein automatischer Spiralplattenschneider verfügbar ist, kann die Bakterienbelastung durch serielle Verdünnung auf einer Agarplatte bestimmt werden. Weitere Informationen finden Sie im bakteriologischen ^{Analysehandbuch14}.
3. Zellimpfung
   1. Beobachten Sie jede Vertiefung der 24-Well-Platte durch Mikroskopie mit geringer Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und wie erwartet wachsen.
   2. Entfernen und entsorgen Sie das verbrauchte Zellkulturmedium von der 24-Well-Platte.
   3. 500 μL der Bakteriensuspension zur Impfung in jede Vertiefung mit 100% konfluenten Zellen geben.
   4. Inkubieren Sie die Zellen für 2 h bei 36 ± 1 °C und 5% _CO2.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, für jede zu prüfende Bedingung drei Vertiefungen der Platte zu verwenden (dreifach) und mindestens drei unabhängige Experimente durchzuführen. Die Verzögerung der Inkubation kann entsprechend dem experimentellen Ziel angepasst werden.
4. Quantifizierung intrazellulärer Bakterien mit verbessertem Enzymschutzassay (iEPA)
   1. 7 ml 4x Lysepuffer mit 3,5 ml 2% Triton X-100 in sterilem Wasser und 3,5 ml Trypsin-EDTA zubereiten.
   2. Eine Lysostaphin-Stammlösung mit 10 mg/ml in Acetatpuffer und aliquot 25 μL in Kryovialen herstellen. Bei -80 °C bis zu 6 Monate lagern.
   3. 250 μL einer frischen Lysostaphin-Arbeitslösung bei 1 mg/ml durch Mischen von 25 μL der Lysostaphin-Stammlösung (10 mg/ml) und 225 μL 0,1 M Tris-HCl herstellen. Bei 4 °C bis zu 48 h lagern.
   4. Bereiten Sie 6,25 ml vollständiges Infektionsmedium, ergänzt mit Lysostaphin, vor, indem Sie 6 ml vollständiges Infektionsmedium zu 250 μL der Lysostaphin-Arbeitslösung hinzufügen.
   5. Geben Sie 250 μL komplettes Infektionsmedium, ergänzt mit Lysostaphin, in jede Vertiefung und rühren Sie die Platte vorsichtig, indem Sie die Platte von Hand schwenken.
   6. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2 , damit das Lysostaphin die extrazellulären Bakterien abtötet.
   7. Am Ende der Inkubationszeit werden 10 μL Proteinase K bei 20 mg/ml in jede Vertiefung gegeben, um das Lysostaphin zu inaktivieren.
   8. Inkubieren Sie die Zellen für 2 min bei Raumtemperatur.
   9. Fügen Sie 250 μL 4x Lysepuffer hinzu, um die Zellen durch osmotischen Schock zu lysieren.
   10. Inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei 36 ± 1 °C.
   11. Mischen Sie gründlich, indem Sie zehnmal über den Boden des Brunnens nach oben und unten pipettieren, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig lysiert und homogenisiert sind.
   12. Verwenden Sie eine automatische Spiralplatte, um die S. aureus-Last jedes Bohrlochs zu bestimmen.
   13. Die Agarplatten für 18-24 h bei 36 ± 1 °C inkubieren.
   14. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien mit einem Koloniezähler, um die intrazelluläre S. aureus-Last jedes Bohrlochs zu berechnen.
5. Messung der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen mit Enzymschutzassay (EPA)
   1. Bereiten Sie 25 ml 1x Lysepuffer mit 3,125 ml 2% Triton X-100 in sterilem Wasser, 6,25 ml Trypsin-EDTA und 15,625 ml sterilem Wasser vor.
   2. 250 μL einer frischen Lysostaphin-Arbeitslösung bei 1 mg/ml durch Mischen von 25 μL einer Lysostaphin-Stammlösung (10 mg/ml) und 225 μL 0,1 M Tris-HCl herstellen.
   3. Bereiten Sie 25 ml vollständiges Infektionsmedium vor, das mit Lysostaphin ergänzt wird, indem Sie 24,75 ml vollständiges Infektionsmedium zu 250 μL der Lysostaphin-Arbeitslösung hinzufügen.
   4. Bereiten Sie für jede zu prüfende antimikrobielle Verbindung 3,1 ml vollständiges Infektionsmedium, ergänzt mit Lysostaphin und der antimikrobiellen Verbindung, in der zu untersuchenden Konzentration vor.
   5. Entfernen und entsorgen Sie das verbrauchte Zellkulturmedium von der 24-Well-Platte.
   6. Fügen Sie 1 ml vollständiges Infektionsmedium hinzu, das mit Lysostaphin ergänzt wird.
   7. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2 , damit das Lysostaphin die extrazellulären Bakterien abtötet.
   8. Entfernen und entsorgen Sie das mit Lysostaphin ergänzte Medium von der 24-Well-Platte.
   9. Füllen Sie drei Vertiefungen mit 1 ml Medium, ergänzt mit Lysostaphin plus der zu testenden antimikrobiellen Verbindung.
   10. Wiederholen Sie Schritt 3.5.9 für jede zu prüfende antimikrobielle Verbindung.
   11. Füllen Sie für die Kontrollbedingung drei Vertiefungen mit 1 ml Medium, ergänzt mit Lysostaphin ohne antimikrobielle Verbindung.
   12. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 36 ± 1 °C in 5% _CO2.
   13. Am Ende der Inkubationszeit das verbrauchte Medium entnehmen und entsorgen und jeweils dreimal mit sterilem DPBS mit _CaCl2 und _MgCl2 vorsichtig waschen.
   14. Fügen Sie 1 ml 1x Lysepuffer zu jeder Vertiefung hinzu, um die Zellen durch osmotischen Schock zu lösen und zu lysieren.
   15. Inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei 36 ± 1 °C.
   16. Mischen Sie gründlich, indem Sie zehnmal im gesamten Brunnen auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig lysiert und homogenisiert sind.
   17. Verwenden Sie eine automatische Spiralplatte, um die S. aureus-Last jedes Bohrlochs zu bestimmen.
   18. Die Agarplatten für 18-24 h bei 36 ± 1 °C inkubieren.
   19. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien mit einem Koloniezähler, um die intrazelluläre S. aureus-Last jedes Bohrlochs zu berechnen.
       ANMERKUNG: Die intrazelluläre Aktivität jeder antimikrobiellen Verbindung sollte entsprechend der Bakterienbelastung der Kontrollbedingung berechnet werden. Es ist auch wichtig, die Zytotoxizität aller antimikrobiellen Verbindungen zu überprüfen, um nachzuweisen, dass die beobachteten Unterschiede zwischen der Kontrolle und den Verbindungen nicht auf den Zelltod zurückzuführen sind.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der S. aureus-Internalisierung durch A549-Epithelzellen sind in Abbildung 1A dargestellt. A549-Zellen wurden mit S. aureus SF8300 WT und SF8300 ΔfnbA/B, denen die Fibronektin-bindenden Proteine A und B fehlen, bei einem MOI von 1 für 2 h geimpft. Um extrazelluläre S. aureus zu zerstören, wurde dem Kulturmedium Lysostaphin zugesetzt und die Zellen wurden für 1 h inkubiert. Als nächstes wurde Lysostaphin entweder durch Waschen für EPA entfernt oder mit Proteinase K für iEPA inaktiviert. Dann wurden die Zellen im Lysepuffer gestört und die Bakterienlast wurde durch Kultur quantifiziert. Bei Verwendung von EPA betrugen die mittleren intrazellulären Belastungen 4,46 bzw. 0,49 Log CFU/ml für SF8300 WT bzw. SF8300 ΔfnbA/B (Abbildung 1A, grüne Balken). Unter Verwendung von iEPA betrugen die mittleren intrazellulären Belastungen 4,53 bzw. 0,56 Log CFU/ml für SF8300 WT bzw. SF8300 ΔfnbA/B (Abbildung 1A, rote Balken). Es ist interessant festzustellen, dass sowohl EPA als auch iEPA ähnliche Ergebnisse zeigten, was durch die Leichtigkeit der Durchführung der Wäschen erklärt werden kann, wenn die Zellen in gutem Zustand sind, und weil die S. aureus-induzierte Zytotoxizität in diesen experimentellen Umgebungen sehr niedrig ist (Daten nicht gezeigt).

Die Ergebnisse der intrazellulären Aktivität von Vancomycin, Rifampicin und Levofloxacin gegen S. aureus sind in Abbildung 1B dargestellt. Um die intrazelluläre Aktivität dieser Antibiotika zu messen, wurden HaCaT-Zellen mit S. aureus ATCC 29213 bei einem MOI von 1 für 2 h geimpft. Die Zellen wurden 24 h lang mit Lysostaphin, mit oder ohne die zu testenden antimikrobiellen Verbindungen, inkubiert. Als nächstes wurden Lysostaphin und die antimikrobiellen Verbindungen durch Waschen entfernt. Die Zellen wurden im Lysepuffer gestört und die Bakterienlast wurde durch Kultur quantifiziert. Die mittleren intrazellulären Belastungen betrugen 4,57, 4,51, 3,03 und 2,91 log CFU/ml für die Kontrolle, Vancomycin (50 μg/ml), Rifampicin (7 μg/ml) bzw. Levofloxacin (10 μg/ml) (Abbildung 1B).

Abbildung 1: Intrazelluläre Staphylococcus aureus-Belastung in Epithelzellen. (A) Enzymschutzassay (grüne Balken) und verbesserter Enzymschutzassay (rote Balken) in A549-Zellen, die mit S. aureus SF8300 WT und ΔfnbA/B infiziert sind. (B) Intrazelluläre Aktivität antimikrobieller Verbindungen in HaCaT-Zellen, die mit S. aureus infiziert sind ATCC 29213. Balken stellen die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten dar, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichungen dar. p < 0,0001. Abkürzungen: Strg = Kontrolle; cfu = koloniebildende Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die hier beschriebenen Assays sind wertvoll für die Untersuchung des Ausmaßes der Internalisierung und des intrazellulären Überlebens von S. aureus in NPPCs sowie der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen6,15,16. Einige Schritte in beiden Assay-Protokollen können kritisch sein. Der Gesundheitszustand und die Dichte der Zellen müssen zwischen unabhängigen Experimenten perfekt kontrolliert und konsistent sein. Das bakterielle Inokulum muss sorgfältig standardisiert werden, um einen echten MOI zu erhalten, der dem angestrebten theoretischen MOI nahe kommt. Im Allgemeinen muss darauf geachtet werden, dass beim Pipettieren keine der Zellen abgenommen wird. Die Waschungen zur Entfernung von Lysostaphin und Antibiotika sind kritische Schritte in der EPA. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Proteinase K diesen Schritt verbessert, wenn kein Antibiotikum verwendet wird (siehe unten). Zu guter Letzt sollten die Zellen in jedem Bohrloch vollständig abgelöst und nach der Inkubation mit dem Lysepuffer gründlich homogenisiert werden, um die intrazelluläre S. aureus-Last zuverlässig zu quantifizieren.

In einigen Fällen können Probleme auftreten, und mehrere Punkte müssen zuerst überprüft werden. Bei mangelnder Reproduzierbarkeit ist zu beachten, dass S. aureus Klumpen bilden kann, was die Quantifizierung durch Absorption ungenau macht. Die Verklumpung von Bakterien kann durch Zentrifugations- und Waschschritte erhöht werden, wenn das Kulturmedium ersetzt werden soll (z.B. zur Eliminierung eines sezernierten Proteins). Die Bakteriensuspension sollte schnell verwendet werden, da Bakterien bei Raumtemperatur weiter wachsen. Die Wirksamkeit von Lysostaphin könnte aufgrund falscher Lagerbedingungen, eines suboptimalen pH-Werts für die Enzymaktivität in den Kulturmedien, der Variabilität der enzymatischen Aktivität zwischen Chargen und Anbietern und der fehlenden Lysostaphinsensitivität einiger Stämme unter spezifischen Wachstumsbedingungen abnehmen. Phenolrot könnte eine leichte bakteriostatische Wirkung haben, insbesondere wenn das Kulturmedium im Vergleich zu den typischen Brühen, die für den Bakterienanbau verwendet werden, relativ nährstoffarm ist. Daher ist es ratsam, ein Zellkulturmedium ohne Phenolrot zu verwenden, das auch fluoreszenzmikroskopische Beobachtungen verbessert, indem es das Hintergrundrauschen reduziert.

Obwohl diese Methode ein wertvolles Werkzeug ist, um das intrazelluläre Schicksal verschiedener Stämme zu untersuchen, sollten einige Grenzen der Methode berücksichtigt werden. Die Verwendung eines sehr hohen MOI kann die Internalisierungsfähigkeit von NPPCs überlasten und die Unterschiede zwischen den verschiedenen getesteten Stämmen ausgleichen. Das Ausmaß der Internalisierung der zytotoxischen Stämme kann unterschätzt werden, da Lysostaphin (oder Antibiotika) schnell S. aureus zerstört, das von beschädigten Zellen freigesetzt wird. Daher sind Experimente mit verlängerter Dauer (d.h. zur Untersuchung des intrazellulären Überlebens oder der intrazellulären Aktivität von Antibiotika) leichter mit Stämmen mit geringer Zytotoxizität einzurichten. Daher sollten die Inkubationszeit und der MOI genau an die Stammvirulenz, den Zelltyp und das experimentelle Ziel angepasst werden.

Die hier beschriebene Methode unter Verwendung von Lysostaphin ist zuverlässiger als diejenigen, die auf Gentamicin basieren, da Gentamicin im Gegensatz zu Lysostaphin dazu neigt, von Wirtszellen internalisiert zu ^werden13. Der andere Vorteil ist die Möglichkeit, das Lysostaphin zu inaktivieren. Eine Hemmung der Lysostaphinaktivität wurde von Kim et ^al.13 unter Verwendung von EDTA zur Chelatierung von Zinkionen oder 1,10-Phenanthrolin berichtet; Intensive Wäschen sind jedoch immer noch erforderlich, um das Enzym vor der Beschichtung der Bakterien zu entfernen. Hier ermöglicht die Proteinase K eine schnelle Inaktivierung von Lysostaphin. Wir beobachteten, dass Zellen dazu neigen, sich von der Kulturplatte zu lösen, wenn sie sich aufgrund der Vermehrung des intrazellulären S. aureus stark infizieren. Durch das Überspringen des letzten Waschschritts vereinfachte die iEPA-Methode die technische Handhabung erheblich und ermöglichte die Rückgewinnung der verinnerlichten Bakterien in lose anhaftenden oder bereits abgetrennten Zellen.

Die konzentrierteren Reagenzien und Puffer, die in iEPA verwendet werden, trugen auch dazu bei, den Pipettieraufwand zu reduzieren und den Verlust von Zellen zu minimieren. Darüber hinaus kann iEPA mit Zellen in Suspension sowie mit schwer zu waschenden Organoiden verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Enzymschutzassays die Untersuchung des Ausmaßes der Internalisierung und des intrazellulären Schicksals von S. aureus sowie der intrazellulären Aktivität von antimikrobiellen Arzneimitteln mit verschiedenen In-vitro-Modellen ermöglichen. Es sollten Verbesserungen vorgenommen werden, um die Beziehung zwischen Internalisierung und Zytotoxizität besser zu charakterisieren, um die Bedeutung der Entwicklung von Medikamenten, die in der Lage sind, S. aureus in der Zelle zu erreichen, besser zu verstehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Well-Platte	CORNING-FALCON	353047
A549 Zelllinie	ATCC	CCL-185
Acetat-Pufferlösung pH 4,6	Fluka	31048	Wird zur Herstellung von Lysostpahin-Stammlösung mit 10 mg/ml in 20 mM Natriumacetat verwendet.
AMBICIN (rekombinantes Lysostaphin)	AMBI	LSPN-50	Lyophilisiertes rekominantes Lysostaphin. Einfrieren bei -80 Grad; C für Langzeitlagerung.
COS - Kolumbien-Agar + 5% Schafsblut	Biomerieux	43049	Jede Agarplatte, die für die Züchtung von Staphylokokken geeignet ist, kann stattdessen verwendet werden.
Densitometer WPA CO8000	Biochrom GmbH	80-3000-45	Zelldichtemessgerät
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Mittlere, hohe Glukose mit Phenolrot	Sigma-Aldrich	D6429
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Mittel, hohe Glukose ohne Phenolrot	Sigma-Aldrich	D1145
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit MgCl2 und CaCl2, sterilfiltriertem	Sigma-Aldrich	D8662
Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, sterilfiltriert	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral verdünnt	Interscience	414000	Automatischer Verdünner und Spiralplater
Fötales Rinderserum	Gibco	10270-106
HaCaT-Zelllinie	Service für Zelllinien (CLS)	300493
Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat, 10 mg/ml Lösung in Wasser	Fisher scientific	11534886
Propidiumiodid, 1,0 mg/ml Lösung in Wasser	Invitrogen	P3566
Proteinase K, rekombinant 20 mg/mL	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, Los 901727
Scan 4000	Interscience	438000	Automatischer Koloniezähler
Steriles Wasser	OTEC	600500
T-75 Kulturflasche	CORNING-FALCON	353136
TC20 Automatisierter Zellzähler	Biorad	1450102	Automatischer Zellzähler
Tris 1 M pH 8,0	Invitrogen	AM9855G	Wird zur Herstellung von Lysostaphin Arbeitslösung in einer Dosis von 1 mg/ml in 0,1 M Tris-HCl verwendet.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin - EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich	T3924	0,05 % Schweinetrypsin und 0,02 % EDTA in Hanks″ Ausgewogene Salzlösung mit Phenolrot
Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop	Nikon	Ti2