Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Zusammenfassung

Der Funktionsverlust der Melanozyten führt zu Vitiligo, was die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Derzeit gibt es keine wirksame Langzeitbehandlung für Vitiligo. Daher ist es unerlässlich, eine bequeme und wirksame Behandlung für Vitiligo zu entwickeln. Die Technologie der regenerativen Medizin zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten scheint eine vielversprechende neuartige Behandlung der Vitiligo zu sein. Dies beinhaltet die direkte Umprogrammierung der Hautzellen des Patienten in funktionelle Melanozyten, um den Verlust von Melanozyten bei Patienten mit Vitiligo zu lindern. Diese Methode muss jedoch zuerst an Mäusen getestet werden. Obwohl die direkte Reprogrammierung weit verbreitet ist, gibt es kein klares Protokoll für die direkte Reprogrammierung in Melanozyten. Darüber hinaus ist die Anzahl der verfügbaren Transkriptionsfaktoren überwältigend.

Hier wird ein konzentriertes Lentivirus-Verpackungssystemprotokoll vorgestellt, um Transkriptionsfaktoren zu erzeugen, die für die Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten ausgewählt wurden, einschließlich Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2. Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden mit dem konzentrierten Lentivirus für all diese Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung der MEFs in induzierte Melanozyten (iMels) in vitro infiziert. Darüber hinaus wurden diese Transkriptionsfaktoren gescreent und das System für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten optimiert. Die Expression der charakteristischen Melaninmarker in iMels auf Gen- oder Proteinebene war signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten eine erfolgreiche neue therapeutische Strategie für Vitiligo sein könnte und den Mechanismus der Melanozytenentwicklung bestätigt, der die Grundlage für eine weitere direkte Reprogrammierung von Fibroblasten in Melanozyten in vivo bilden wird.

Einleitung

Vitiligo ist eine Hautkrankheit, die die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Aus verschiedenen Gründen, einschließlich metabolischer Anomalien, oxidativem Stress, Bildung von Entzündungsmediatoren, Zellablösung und Autoimmunreaktion, gehen die funktionellen Melanozyten verloren und die Sekretion von Melanin wird gestoppt, was zur Entwicklung von Vitiligo ^1,2 führt. Dieser Zustand tritt häufig auf und ist besonders problematisch im Gesicht. Die Hauptbehandlung ist die systemische Verwendung von Kortikosteroiden und Immunmodulatoren. Phototherapie kann für syste....

Protokoll

Diese Arbeit wurde vom Laboratory Animal Management and Use Committee an der Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010) genehmigt. Die Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Standards durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) festgelegt wurden. Es gab keine Experimente mit Menschen, so dass diese Arbeit keine Genehmigung der Ethikkommission für Humanforschung benötigte. Weitere Informationen zu Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle .

1. Aufbau eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems für Transkripti....

Ergebnisse

Dieser Artikel enthält die Protokolle eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems zur Herstellung von Lentiviren von Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten und Protokolle für das Screening auf Transkriptionsfaktoren und die direkte Reprogrammierung von Melanozyten aus MEFs.

Der Erfolg der konzentrierten Lentivirusproduktion wurde durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP (Abbildung 1A) oder durch Durchflusszytometrie (Abbildung .......

Diskussion

Die Qualität des Virus ist entscheidend für den Erfolg der direkten Reprogrammierung auf Melanozyten in diesem Protokoll. Die Methode zum Verpacken und Konzentrieren von Viren in diesem Protokoll ist einfach und leicht zu wiederholen und stützt sich nicht auf ein anderes konzentriertes Hilfsreagenz. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors erfolgreich befolgt werden. Um die Qualität des konzentrierten Virus zu gewährleisten, bedürfen die folgenden Punkte besonderer Aufmerksamkeit. Einer ist der Zellstatus von HEK-293T.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Gelagert bei -20 &°; C
0,45 μ M Filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen	Falcon	352052
95%/100% Ethanol	LANBAO	210106	Gelagert bei RT
Adenine	Sigma	A2786	Stammkonzentration 40 mg/mL Endkonzentration 24 &μm; g/mL
Alexa Fluor 555 Ziege Anti-Maus IgG2a	Invitrogen	A21137	Verdünnung von 1:500 zur Verwendung von
Antibiotika (Pen/Streptokokken)	Gibco	15140-122	Gelagert bei -20 ° C
Anti-TRP1/TYRP1 Antikörper	Millipore	MABC592	Wirt/Isotyp: Maus IgG2a Speziesreaktivität: Maus/Mensch Verdünnung von 1:200 zur Verwendung von
Anti-TRP2/DCT Antikörper	Abcam	ab74073	Wirt/Isotyp: Kaninchen IgG Speziesreaktivität: Maus/Mensch Verdünnung von 1:200 zur Verwendung von
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stammkonzentration 10 mM Endgültig Konzentration 3 μ M
Choleratoxin	Sigma	C8052	Stammkonzentration 0,3 mg/ml Endkonzentration 20 pM
Cy3 Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Verdünnung von 1:500 zur Verwendung von
DMEM (hoher Glukose)	HyClone	SH30243,01	Lagerung bei 4 ° C
DMSO	Sigma	D2650	Gelagert bei RT
FBS	Gibco	10270-106	Gelagert bei -20 &Grad; C Vor Gebrauch hitzeinaktiviert
Gelatine	Sigma	G9391	Gelagert bei RT
GFP-PURO Plasmide (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Gelagert bei -20 &Grad; C
Hämatoxylin	Abcam	ab220365	Gelagert bei RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stammkonzentration 100 μ M Endkonzentration 0,1 μ M
Hydrocortison	Sigma	H0888	Stammkonzentration 100 & Mikro; g/mL Endkonzentration 0,5 &μ; g/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Gelagert bei RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfektionsreagenz, gelagert bei 4 &°; C
Masson-Fontana Färbeset	Solarbio	G2032	Gelagert bei 4 > C
Neutraler Balsam	Solarbio	G8590	Gelagert bei 4 &Grad; C
Paraformaldehyd	Sigma	P6148	Gelagert bei RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Gelagert bei RT
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (TPA)	Sigma	P8139	Stammkonzentration 1 mM Endkonzentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	kationisches polymeres Transfektionsreagenz; Bestandskonzentration 8 μ g/µ L Endkonzentration 4 ng/µ L
Puromycin	Gibco	A11138-03	Gelagert bei -20 &Grad; C
Rekombinantes humanes bFGF	Invitrogen	13256-029	Stammkonzentration 4 μ g/mL Endkonzentration 10 ng/ml
rekombinantes Humaninsulin	Sigma	I3536	Stammkonzentration 10 mg/ml Endkonzentration 5 µ g/mL
Rekombinante humane SCF	R& T & D	255-SC-010	Bestandskonzentration 200 μ g/mL Endkonzentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Gelagert bei 4 ° C
Xylol	Sigma	1330-20-7	Gelagert bei RT