Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten in definierten Proteoliposomen vor.

Zusammenfassung

Als Zentrum für oxidative Phosphorylierung und apoptotische Regulation spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit. Die richtige mitochondriale Funktion hängt von einem robusten Qualitätskontrollsystem ab, um die Proteinhomöostase (Proteostase) aufrechtzuerhalten. Der Rückgang der mitochondrialen Proteostase wurde mit Krebs, Alterung, Neurodegeneration und vielen anderen Krankheiten in Verbindung gebracht. Msp1 ist eine AAA+ ATPase, die in der äußeren mitochondrialen Membran verankert ist und die Proteostase aufrechterhält, indem sie falsch lokalisierte schwanzverankerte Proteine entfernt. Unter Verwendung von gereinigten Komponenten, die zu Proteoliposomen rekonstituiert wurden, haben wir gezeigt, dass Msp1 notwendig und ausreichend ist, um ein modellhaftes schwanzverankertes Protein aus einer Lipiddoppelschicht zu extrahieren. Unser vereinfachtes rekonstituiertes System überwindet mehrere der technischen Barrieren, die eine detaillierte Untersuchung der Membranproteinextraktion behindert haben. Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Generierung von Liposomen, zur Membranproteinrekonstitution und zum Msp1-Extraktionsassay zur Verfügung.

Einleitung

Die richtige zelluläre Funktion hängt von einem Prozess namens Proteostase ab, der sicherstellt, dass funktionelle Proteine in der richtigen Konzentration und zellulären Position sind¹. Versagen in der Proteostase führen zu einer beeinträchtigten Organellenfunktion und sind mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden^2,3,4. Membranproteine stellen einzigartige Herausforderungen an das Proteostasenetzwerk dar, da sie auf die richtige Membran ausgerichtet werden müssen, während die Aggregation aus den hydrophoben Transmembrandomänen (TMDs) vermie....

Protokoll

1. Liposomen-Vorbereitung

1. Kombinieren Sie Chloroform-Bestände von Lipiden in geeigneten Verhältnissen, um die äußere mitochondriale Membran nachzuahmen.
   1. Bereiten Sie 25 mg Lipidmischung vor. Wir verwenden eine zuvor etablierte Mischung von Lipiden, die mitochondriale Membranen nachahmen, bestehend aus einem molaren Verhältnis von 48:28:10:10:4 aus Hühnerei-Phosphatidylcholin (PC), Hühnerei-Phosphatidylethanolamin (PE), Rinderleberphosphatidyl-Inositol (PI), synthetischem 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-Serin (DOPS) und synthetischem 1',3'-Bis[1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerin (TOCL)^58,

Ergebnisse

Um die Ergebnisse richtig zu interpretieren, müssen das fleckenfreie Gel und der Western Blot zusammen betrachtet werden. Das fleckenfreie Gel sorgt für eine gleichmäßige Belastung aller Proben. Bei der Betrachtung des fleckenfreien Gels sind die Chaperone (GST-Calmodulin und GST-SGTA) in den Spuren INPUT (I) und ELUTE (E) sichtbar. Überprüfen Sie, ob die Intensität dieser Bänder in allen INPUT-Samples einheitlich ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Intensität in den ELUTE-Proben gleichmäßig ist. Der ELUTE ist 5x .......

Diskussion

Die richtige mitochondriale Funktion hängt von einem robusten Proteinqualitätskontrollsystem ab. Aufgrund inhärenter Grenzen in der Genauigkeit der TA-Protein-Targeting-Pfade sind falsch lokalisierte TA-Proteine eine ständige Stressquelle für Mitochondrien. Eine Schlüsselkomponente des mitochondrialen Proteostasenetzwerks ist Msp1, eine membranverankerte AAA + ATPase, die fehllokalisierte TA-Proteine aus dem OMM entfernt. Hier haben wir beschrieben, wie man Proteoliposomen herstellt, Msp1 und ein Modell-TA-Protein co-rek.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biobeads	Bio-Rad	1523920
Rinderleber-Phosphatidyl-Inositol	Avanti	840042C	PI
Hühnerei-Phosphatidylcholin	Avanti	840051C
PC Hühner-Ei-Phosphatidylethanolamin	Avanti	840021C	PE
ECL Select Western Blotting Detektionsreagenz	GE	RPN2235
Filterhalterungen	Avanti	610014
Glasfläschchen	VWR	60910L-1
Glutathion-Spin-Säule	Thermo Fisher	PI16103
Ziege Anti-Kaninchen	Thermo Fisher	NC1050917
Mini-Extruder	Avanti	610020
Polycarbonat-Membran	Avanti	610006	200 nM
PVDF-Membran	Thermo Fisher	88518	45 µ M
Rabbit anti-FLAG	Sigma-Aldrich	F7245
Synthetisches 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin	Avanti	840035C	DOPS
Synthetisches 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol	Avanti	710335C	TOCL
Spritze, 1 mL	Norm-Ject	53548-001
Spritze, 1 mL, gasdicht	Avanti	610017