Der Zebrafisch ist ein wichtiges Modell für das Verständnis der Nierenentwicklung. Hier wird ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll optimiert, um die Genexpression in Zebrafischlarven und Juvenilen während der Mesonephrosentwicklung nachzuweisen.
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Methodenartikel
In situ Hybridisierung in Zebrafischlarven und Jungfischen während der Mesonephrosentwicklung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Zebrafisch bildet in seinem Leben zwei Nierenstrukturen. Der Pronephros (embryonale Niere) bildet sich während der Embryonalentwicklung und beginnt 2 Tage nach der Befruchtung zu funktionieren. Der pronephros besteht aus nur zwei Nephronen und dient während des Larvenlebens als einzige Niere, bis aufgrund der zunehmenden Körpermasse mehr Nierenfunktion erforderlich ist. Um diesem höheren Bedarf gerecht zu werden, beginnt sich während der Metamorphose der Mesonephros (erwachsene Niere) zu bilden. Die neuen primären Nephrone verschmelzen mit dem Pronephros und bilden verbundene Lumen. Dann verschmelzen sekundäre Nephrone mit primären (und so weiter), um ein verzweigtes Netzwerk im Mesonephros zu schaffen. Die überwiegende Mehrheit der Forschung konzentriert sich auf den Pronephros aufgrund der Leichtigkeit der Verwendung von Embryonen. Daher besteht die Notwendigkeit, Techniken zu entwickeln, um ältere und größere Larven und Jungfische zu untersuchen, um die Entwicklung von Mesonephrosen besser zu verstehen. Hier ist ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll für die Genexpressionsanalyse für die Penetration von Sonden, das Waschen von Sonden und Antikörpern und das Bleichen von Pigmenten optimiert, um die Mesonephrose besser sichtbar zu machen. Die transgene Linie Tg(lhx1a-EGFP) wird verwendet, um Vorläuferzellen und die distalen Tubuli von naszierenden Nephronen zu markieren. Dieses Protokoll füllt eine Lücke in der Mesonephrosforschung. Es ist ein entscheidendes Modell, um zu verstehen, wie sich neues Nierengewebe bildet und in bestehende Nephrone integriert und Einblicke in regenerative Therapien gibt.
Einleitung
Der Zebrafisch-Embryo ist aufgrund seiner geringen Größe, Transparenz, verfügbaren Werkzeuge und seines Überlebens ohne Fütterung für bis zu fünf Tage ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Gewebeentwicklung1,2. Es hat wesentlich zum Verständnis der Nierenentwicklung und des Schutzes zwischen Zebrafischen und Säugetieren beigetragen3,4,5. Die Niere spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Flüssigkeitshomöostase, der Filterung des Blutes und der Ausscheidung von Abfällen6
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Protokoll
Die Verwendung von Zebrafischlarven und Jungfischen ist von der IUP IACUC genehmigt (Protokoll #02-1920, #08-1920). Details zum Lösungsinhalt sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Aufzucht von Larven
HINWEIS: Es dauert bis zu 21 Tage oder länger, um Larven und Jungtiere in das Stadium des Interesses zu bringen.
- Richten Sie erwachsene Zebrafische ein, um sich zu paaren, indem Sie am späten Nachmittag nach ihrer letzten Mahlzeit 1 männlichen und 1 weiblichen Fisch in einem Paarungsbecken hinzufügen.
HINWEIS: Nicht alle Fischpaare paaren sich. Beginnen Sie mit der Einrichtung von 2....
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Ergebnisse
Unter Verwendung der transgenen Linie Tg(lhx1a-EGFP) wurde gezeigt, dass dieses In-situ-Hybridisierungsprotokoll bei der Markierung von Nierenvorläuferzellen und verschiedenen Nephronstrukturen während der Mesonephrosentwicklung wirksam ist. Wie erwartet, ist auch das zentrale Nervensystem in dieser transgenen Linie markiert (nicht gezeigt). Das anfängliche mesonephrische Nephron bildet sich bei etwa 5,2 mm, dorsal zum Pronephros (Abbildung 2A), und der distale Tubulus dies.......
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Diskussion
Die hier beschriebene In-situ-Hybridisierungsmethode zielt darauf ab, die Entwicklung von Mesonephrosen zu untersuchen. Es kann jedoch angewendet werden, um die Entwicklung anderer Gewebe und Organe während der Metamorphose zu untersuchen, wie Darm, Nervensystem, Schuppen und Pigmentierung14. Sonden können für endogene Gene oder fluoreszierende Marker in transgenen Linien erzeugt werden.
Es ist wichtig, dass die Larven intakt bleiben, um die Organe und Gewebe i.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Finanzierung wurde von der Pennsylvania Academy of Science und dem Commonwealth of Pennsylvania Biologs sowie der Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology und dem Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence) bereitgestellt. Die transgene Tg(lhx1a-EGFP)- Leitung wurde von Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh) zur Verfügung gestellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-Fluorescein-Antikörper | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleichlösung | 0,8 % KOH, 0,9 % H2O2 in PBST | ||
| Blockierungsreagenz | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Zur Blockierungslösung verwenden, gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereiten |
| Zellsieb | Fisher Scientific | Tel.: 22-363-549 | 100 μ m |
| E3 Medium | 5 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM KCl, 0,0001 % Methylenblau | ||
| Wimpernmanipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Zur Manipulation von Larven verwenden |
| Fixierlösung | 4 % Paraformaldehyd, 1 % DMSO in PBS; Hitze bei 65 ° G; C während des Schüttelns, bis sich das Pulver aufgelöst hat, dann DMSO hinzufügen, nachdem es abgekühlt ist | ||
| Fluoresceinsondensynthese | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glasfläschchen | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry-Verkapselung | Argent | ||
| Hyb- Lösung | 50% Formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| Hyb+ Lösung | HYB-, 5 mg/mL Torula-RNA, 50 μg/ml Heparin | ||
| MAB (10X)1 | M Maleinsäure, 1,5 M NaCl, pH 7,5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0,1 % Tween-20 | ||
| Maleinsäure | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyd | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X)8 | % NaCl, 0,2 % KCl, 1,44 % Na2HPO4, 0,24 % KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0,1 % Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0,2 % Tween-20 | ||
| Pulverfutter | Mischen Sie je 2 g Spirulina und Hatchfry Encapsulon in 50 mL Wasser aus dem Fischsystem und schütteln Sie es gut | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Zur Permeabilisierung der Larven |
| verwenden Proteinase K Lösung | 20 μ g/ml, 1 % DMSO Endkonzentration in PBST | ||
| Spirulina mikrofeines Pulver Argent | |||
| SSC (20X)3 | M NaCl, 0,3 M Natriumacetat wasserfrei, pH 7, Autoklav | ||
| SSCT (0,2X) | Verdünnt aus 20X SSC, | ||
| SSCT (2X) | Verdünnt aus 20X SSC, 0,1% Tween-20 | ||
| Färbepuffer | 100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20 | ||
| Färbelösung | 200 μ g/mL Iodnitrotetrazoliumchlorid, 200 μ g/mL 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat Dinatriumsalz, in Färbepuffer | ||
| Stopplösung | 1 mM EDTA, pH 5,5, in PBST | ||
| Torula (Hefe) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricain | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Waschpuffer | 50% Formamid, 2X SSC, 0,1% Tween-20 |
Referenzen
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
