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Biochemistry

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए निरंतर फ्लोरेसेंस-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/62949
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Summary

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ संभावित कैंसर दवा लक्ष्य हैं। यहां, डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ निषेध के लिए छोटे अणुओं का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह परख डीएनए मिथाइलेशन को प्रतिदीप्ति पीढ़ी में जोड़ने के लिए एक एंडोन्यूक्लिज़ का उपयोग करती है और वास्तविक समय में एंजाइम गतिविधि की निगरानी करने की अनुमति देती है।

Abstract

डीएनए मिथाइलेशन, एपिजेनेटिक जीन विनियमन का एक रूप, सामान्य सेलुलर फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं में, डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ (डीएनएमटी) नामक प्रोटीन डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न को स्थापित और बनाए रखते हैं। सामान्य डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न में परिवर्तन कैंसर के विकास और प्रगति से जुड़ा हुआ है, जिससे डीएनएमटी संभावित कैंसर दवा लक्ष्य बन जाते हैं। इस प्रकार, इन एंजाइमों के नए छोटे अणु अवरोधकों की पहचान और विशेषता बहुत महत्वपूर्ण है। यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसका उपयोग डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। निरंतर युग्मित कैनेटीक्स परख डीएनए मिथाइलेशन के प्रारंभिक वेगों को संभावित छोटे अणु अवरोधकों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में निर्धारित करने की अनुमति देता है। परख प्रतिदीप्ति पीढ़ी के लिए हेमिमिथाइलेटेड डीएनए सब्सट्रेट के मिथाइलेशन को जोड़ने के लिए मिथाइल-संवेदनशील एंडोन्यूक्लिज़ जीएलए आई का उपयोग करता है।

यह निरंतर परख एंजाइम गतिविधि को वास्तविक समय में निगरानी करने की अनुमति देता है। माइक्रोटिटर प्लेटों में छोटी मात्रा में परख का संचालन अभिकर्मकों की लागत को कम करता है। इस परख का उपयोग करते हुए, मनुष्यों में सबसे प्रचुर मात्रा में डीएनएमटी आइसोजाइम, डीएनएमटी 1 के अवरोधकों के लिए एक छोटी उदाहरण स्क्रीन आयोजित की गई थी। अत्यधिक प्रतिस्थापित एंथ्राक्विनोन प्राकृतिक उत्पाद, लैक्केइक एसिड ए, डीएनएएमटी 1 का एक शक्तिशाली, डीएनए-प्रतिस्पर्धी अवरोधक है। यहां, हम परख प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए दो सांद्रता में तीन संभावित छोटे अणु अवरोधकों की जांच करते हैं - एंथ्राक्विनोन या एंथ्राक्विनोन जैसे अणु एक से तीन प्रतिस्थापन के साथ। प्रारंभिक वेगों का उपयोग प्रत्येक अणु की उपस्थिति में देखी गई प्रतिशत गतिविधि की गणना करने के लिए किया जाता है। जांच किए गए तीन यौगिकों में से एक डीएनएमटी 1 गतिविधि के एकाग्रता-निर्भर निषेध को प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि यह डीएनएमटी 1 का एक संभावित अवरोधक है।

Introduction

डीएनए मिथाइलेशन एक महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक चिह्न है जो जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन संरचना को नियंत्रित करता है। मिथाइलेशन मुख्य रूप से सीपीजी डाइन्यूक्लियोटाइड्स में होता है - साइटोसिन के बाद गुआनोसिन; मिथाइल समूह को साइटोसिन की 5-स्थिति में जोड़ा जाता है। सही डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न, और इस प्रकार उचित जीन अभिव्यक्ति, उचित सेलुलर विकास और कार्य के लिए आवश्यक हैं। कई रोग अवस्थाएं सामान्य मिथाइलेशन पैटर्न 1,2,3 में परिवर्तन से जुड़ी हुई हैं। उदाहरण के लिए, कैंसर की शुरुआत और प्रगति और डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न में परिवर्तन के बीच एक लिंक है। आमतौर पर, कैंसर कोशिकाएं मेथिलसाइटोसिन के निम्न समग्र स्तर का प्रदर्शन करती हैं, जो जीनोम अस्थिरता में योगदान देती है। इसी समय, जीनोम में मौजूद मिथाइलसाइटोसिन ट्यूमर शमन जीन के प्रमोटर क्षेत्रों में केंद्रित है, जो इन महत्वपूर्ण प्रोटीनों के जीन साइलेंसिंग की ओर जाता है। विशेष रूप से, एपिजेनेटिक परिवर्तन गतिशील और प्रतिवर्ती हैं, ट्यूमरजेनिसिस से जुड़े डीएनए उत्परिवर्तन के विपरीत। इसने एपिजेनेटिक जीन विनियमन में शामिल प्रोटीन को दिलचस्प दवा लक्ष्य 2,4 बना दिया है।

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ (डीएनएमटी) डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न उत्पन्न करने और बनाए रखने के लिए जिम्मेदार प्रोटीन हैं। तीन उत्प्रेरक रूप से सक्रिय आइसोजाइम, DNMT1, DNMT3a, और DNMT3b, मनुष्यों में मौजूद हैं। विकास और भेदभाव के दौरान, डी नोवो मेथिलट्रांसफेरेज़, डीएनएमटी 3 ए और डीएनएमटी 3 बी, मिथाइलेशन पैटर्न स्थापित करते हैं। दोनों एंजाइम उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय डीएनएमटी 3 एल प्रोटीन को कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए बांध सकते हैं जो बढ़ी हुई गतिविधि 1,5 प्रदर्शित करते हैं। कोशिका विभाजन के बाद, बेटी कोशिकाओं में हेमिमिथाइलेटेड डीएनए होता है - डुप्लेक्स के केवल एक स्ट्रैंड में मेथिलसाइटोसिन युक्त डीएनए - क्योंकि नए संश्लेषित डीएनए मिथाइलेशन निशान से रहित होते हैं। डीएनएमटी 1 का प्रमुख कार्य इस हेमिमिथाइलेटेड डीएनए को मिथाइलेटेड करना है, इस प्रकार पूर्ण मिथाइलेशन पैटर्न 1,5 को फिर से स्थापित करना है।

डीएनएमटी गतिविधि और कैंसर के बीच संबंध अच्छी तरह से स्थापित हैं। डीएनएमटी 1 का ओवरएक्प्रेशन, या तो ट्रांसक्रिप्शनल या पोस्ट-ट्रांसलेशनल तंत्र द्वारा, कई सामान्य ऑन्कोजेनिकमार्गों 6,7,8,9 का परिणाम है। हाइपोमॉर्फिक एलील्स का उपयोग करके डीएनएमटी 1 गतिविधि को कम करने के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप एपीसी (मिन) चूहों में ट्यूमर गठन में कमी आई है। एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जो डीएनएमटी 1 को नष्ट करते हैं, सेल संस्कृति और माउस ट्यूमर मॉडल11,12 में नियोप्लासिया को रोकते हैं। इस प्रकार, डीएनएमटी 1 गतिविधि को रोकना एक आशाजनक कैंसर चिकित्सा दृष्टिकोण की तरह लगता है। हालांकि, DNMT3 आइसोजाइम जो भूमिका निभाते हैं, वे इतनी सीधी नहीं हैं। डीएनएमटी 3 ए उत्परिवर्तन तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया13 और मायलोडीस्प्लास्टिक सिंड्रोम14 में पाए जाते हैं। पहचाने गए उत्परिवर्तनों में से कम से कम एक को एंजाइम15 की डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि को कम करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, डीएनएमटी 3 बी स्तन कैंसर16 और कोलोरेक्टल कैंसर17 में अतिरंजित है। कार्सिनोजेनेसिस में विभिन्न डीएनएमटी आइसोजाइम विभिन्न भूमिका निभा रहे हैं, आइसोजाइम-विशिष्ट अवरोधकों की पहचान करना महत्वपूर्ण होगा। न केवल ये यौगिक चिकित्सीय के विकास के लिए उपयोगी होंगे, बल्कि आइसोजाइम-विशिष्ट अवरोधक कैंसर एटियलजि में प्रत्येक डीएनएमटी आइसोजाइम की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए एक अमूल्य उपकरण भी होंगे।

साहित्य में कई डीएनएमटी अवरोधकों की सूचना दी गई है। ज्ञात डीएनएमटी अवरोधकों को दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: न्यूक्लियोसाइड और गैर-न्यूक्लियोसाइड। न्यूक्लियोसाइड इनहिबिटर आमतौर पर साइटिडीन एनालॉग होते हैं। इन यौगिकों को डीएनए में शामिल किया जाता है और सहसंयोजक रूप से डीएनएमटी को फंसाया जाता है। 5-एज़ासाइटिडीन और 5-एज़ा -2'-डीऑक्सीसाइटिडीन को मायलोडीस्प्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया 4,18 के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया है। इन यौगिकों की उच्च विषाक्तता, कम जैव उपलब्धता और रासायनिक अस्थिरता समस्याएं पेश करती हैं। चल रहे काम न्यूक्लियोसाइड अवरोधकों की अगली पीढ़ी की प्रभावकारिता की जांच कर रहे हैं; एसजीआई -110, 5-एज़ा -2'-डीऑक्सीसाइटिडीन से प्राप्त, एक उदाहरण19,20 है। न्यूक्लियोसाइड इनहिबिटर आइसोजाइम-विशिष्ट नहीं हैं और किसी भी डीएनएमटी आइसोजाइम का सामना करने को निष्क्रिय कर देंगे। इसलिए, न्यूक्लियोसाइड-डीमिथाइलेटिंग एजेंट के साथ उपचार के परिणामस्वरूप सभी डीएनएमटी आइसोजाइम 4,18 की कमी होती है। गैर-न्यूक्लियोसाइड अवरोधकों को उनके निरोधात्मक प्रभावों को बढ़ाने के लिए डीएनए में शामिल करने की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, ये अणु सीधे डीएनएमटी से जुड़ते हैं, जो आइसोजाइम-विशिष्ट अवरोध की संभावना पेश करते हैं। आज तक कई गैर-न्यूक्लियोसाइड अवरोधकों की खोज की गई है, जिनमें एसजीआई -1027 21, हाइड्रालज़िन22, प्रोकैनामाइड23, आरजी 108 और डेरिवेटिव24, और प्राकृतिक उत्पाद, (−)-एपिगैलोकैटेचिन 3-गैलेट (ईजीसीजी)25 और लैक्केइक एसिड ए26,27 शामिल हैं। आज तक खोजे गए अधिकांश गैर-न्यूक्लियोसाइड अवरोधक आइसोजाइम-चयनात्मक नहीं हैं या एक डीएनएमटी आइसोजाइम के लिए कमजोर प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, इन अणुओं की शक्ति में सुधार करने की आवश्यकता है, खासकर कोशिकाओं 4,18 में। इस प्रकार, अधिक शक्तिशाली, आइसोजाइम-चयनात्मक डीएनएमटी अवरोधकों को खोजने या विकसित करने की आवश्यकता है।

DNMTs के नए छोटे अणु अवरोधकों की खोज के लिए एक बाधा पारंपरिक रूप से DNMT गतिविधि28 की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली श्रमसाध्य परख है। परख आमतौर पर कई चरणों के साथ असंतुलित होते हैं। डीएनएमटी की एंजाइमेटिक गतिविधि अभी भी रेडियोधर्मी एस-एडेनोसिल मेथिओनिन (एसएएम) 29,30,31,32,33,34 का उपयोग करके नियमित रूप से परख की जाती है। डीएनए मिथाइलेशन के लिए गैर-रेडियोधर्मी परख भी विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, पाचन उत्पादों को अलग करने के लिए मिथाइल-संवेदनशील प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ और वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करने वाले परख35,36 वर्णित किए गए हैं। इस प्रकार के असंतुलित, मल्टीस्टेप परख दवा की खोज के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं हैं। 2000 के दशक के मध्य से, उच्च थ्रूपुट के साथ कई डीएनए मिथाइलेशनपरख विकसित किए गए हैं। डीएनएमटी 1 इनहिबिटर37 के लिए स्क्रीन करने के लिए एक शानदार निकटता परख का उपयोग किया गया था। मिथाइल-संवेदनशील प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ का उपयोग करने वाली एक और परख का उपयोग डीएनएमटी 3 ए इनहिबिटर 25,38 के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया था। जबकि दोनों परखों ने पारंपरिक डीएनए मिथाइलेशन परख की तुलना में उच्च थ्रूपुट के लिए अनुमति दी, परख को कई चरणों की आवश्यकता होती है और वास्तविक समय में मिथाइलेशन गतिविधि के अवलोकन की अनुमति नहीं देते हैं। हाल ही में, एक निरंतर कैनेटीक्स परख का वर्णन किया गया है जो एनएडीपीएच ऑक्सीकरण39 से जुड़े 340 एनएम पर स्पेक्ट्रोस्कोपिक परिवर्तन के लिए मिथाइलेशन प्रतिक्रिया के एक उत्पाद एस-एडेनोसिलहोमोसिस्टीन (एसएएच) के गठन को जोड़ता है। यह परख एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक संकेत उत्पन्न करने के लिए तीन युग्मन एंजाइमों का उपयोग करता है।

हमने एक प्रतिदीप्ति-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख विकसित की है जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध युग्मन एंजाइम का उपयोग करती है और वास्तविक समय में डेटा उत्पन्न कर सकती है (चित्रा 1)। एक हेयरपिन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जिसमें तीन मिथाइलसाइटोसिन होते हैं, का उपयोग सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है। सब्सट्रेट डीएनए में 5 ' अंत पर एक फ्लोरोफोरे और 3 ' अंत पर एक बुझाने वाला होता है। हेमिमिथाइलेटेड सीपीजी साइट का मिथाइलेशन एंडोन्यूक्लिज़ जीएलए आई के लिए दरार साइट उत्पन्न करता है - पूरी तरह से मिथाइलेटेड जीसीजीसी। उत्पाद ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का जीएलए आई दरार बुझाने वाले से फ्लोरोफोरे को जारी करता है और वास्तविक समय में प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है। परख का उपयोग डीएनएमटी के किसी भी आइसोफॉर्म की गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, डीएनएमटी 1 के साथ उच्च गतिविधि देखी जाती है क्योंकि यह आइसोजाइम अधिमानतः हेमिमिथाइलेटेड डीएनए 1,5 को मिथाइलेटेड करता है। यदि डीएनएमटी 1 से ऑटोइनहिबिटरी रेप्लिकेशन फॉसी टारगेटिंग सीक्वेंस (आरएफटीएस) डोमेन को हटा दिया जाता है तो और भी मजबूत गतिविधि देखी जाती है। एन-टर्मिनल नियामक क्षेत्र में पाया जाने वाला यह डोमेन उत्प्रेरक साइट को बांधता है और डीएनए बाइंडिंग को रोकता है। पहले ~ 600 अमीनो एसिड को हटाने से एक कटा हुआ एंजाइम होता है जो पूर्ण लंबाई वाले एंजाइम (के कैट / के एम में ~ 640 गुना वृद्धि) की तुलना मेंकाफी अधिक सक्रियहोता है। एंजाइम का यह सक्रिय रूप, जिसे आरएफटीएस-कमी डीएनएमटी 1 (एमिनो एसिड 621-1616) के रूप में जाना जाता है, इसकी बढ़ी हुई उत्प्रेरक शक्ति के कारण अवरोधकों की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है। यह पेपर संभावित छोटे अणु अवरोधकों की जांच के लिए परख में आरएफटीएस-कमी डीएनएमटी 1 का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित निरंतर परख का उपयोग करके, प्रारंभिक वेग कुछ छोटे अणुओं की उपस्थिति और अनुपस्थिति में निर्धारित किया जाता है। एकाग्रता-निर्भर डीएनएमटी 1 अवरोध की तलाश के लिए प्रत्येक संभावित अवरोधक की दो सांद्रता में जांच की जाती है। प्रत्येक मामले में छोटे अणुओं की उपस्थिति में देखी गई प्रतिशत गतिविधि की गणना की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: डीएनए मिथाइलेशन परख। 5'छोर पर फ्लोरोफोरे और 3' छोर पर एक बुझाने वाले के साथ एक हेमिमिथाइलेटेड हेयरपिन डीएनए का उपयोग सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है। डीएनएमटी 1 एस-एडेनोसिलमेथियोनिन से नॉनमिथाइलेटेड सीपीजी साइट तक मिथाइल समूह के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है, जिससे एस-एडेनोसिलहोमोसिस्टीन और पूरी तरह से मिथाइलेटेड डीएनए उत्पन्न होता है। डीएनए उत्पाद में एंडोन्यूक्लिज़ जीएलए आई के लिए दरार साइट होती है, जो पूरी तरह से मिथाइलेटेड जीसीजीसी साइटों को छोड़ देती है। उत्पाद डीएनए की दरार 3' बुझाने वाले से 5 'फ्लोरोफोरे जारी करती है, जिससे प्रतिदीप्ति उत्पन्न होती है। संक्षिप्तरूप: एफएल = फ्लोरोफोरे; क्यू = बुझाने वाला; डीएनएमटी 1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1; एसएएम = एस-एडेनोसिलमेथिओनिन; एसएएच = एस-एडेनोसिलहोमोसिस्टीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. स्क्रीन के लिए परख समाधान तैयार करें

नोट: इस परख में उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट्स की सांद्रता को अनुकूलित किया जा सकता है। आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएएमटी 1 के लिए, हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट और एसएएम के लिए प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित केएम मान क्रमशः 1-2 एनएम और2 μM हैं।

  1. बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में परीक्षण की जा रही प्रत्येक परख स्थिति का 600 μL तैयार करें।
    नोट: आवश्यक परख समाधान की कुल मात्रा आयोजित की जा रही प्रतिकृतियों की संख्या पर निर्भर करती है। प्रत्येक परख शर्त इस प्रोटोकॉल के लिए तीन प्रतियों में चलाई गई थी।
    1. 1xबफर की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में ddH 2 O और 5x मिथाइलेशन बफर (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 500 mM पोटेशियम ग्लूटामेट, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 25% ग्लिसरॉल) जोड़ें। 20 μM यौगिक वाले परखों के लिए, ddH 2 O और120μL 5x बफर के 472 μL जोड़ें। 50 μM यौगिक वाले परखों के लिए, ddH2O का 470 μL और 5x बफर का 120 μL जोड़ें।
    2. प्रत्येक नमूने में 20 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का 3.15 μL जोड़ें।
    3. प्रत्येक नमूने में 3.15 μM हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट का 2 μL और 4.75 mM SAM का 1.33 μL जोड़ें।
      नोट: परख समाधान मिश्रण में सब्सट्रेट्स की एकाग्रता वांछित अंतिम सांद्रता 1.05 गुना है।
    4. उपयुक्त नमूनों में 21 μM (1.26 μL 10 mM) या 52.5 μM (10 mM का 3.15 μL) की अंतिम सांद्रता में अवरोधक जोड़ें। नियंत्रण नमूने में डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की बराबर मात्रा जोड़ें।
      नोट: स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले अवरोधक की एकाग्रता विविध हो सकती है। अधिकतम अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता ≤5% (v / v) होनी चाहिए। 5% (v/v) तक DMSO सांद्रता का परख26 में देखी गई गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।
  2. 3 सेकंड के लिए भंवर (3,000 आरपीएम) द्वारा समाधान मिलाएं। टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज (1,200 × ग्राम) में कुछ सेकंड के लिए नमूने को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समाधान ट्यूब के निचले भाग में एकत्र किया गया है।
  3. प्रत्येक परख समाधान का एलिकोट 95 μL एक काले आधे क्षेत्र 96-वेल प्लेट में लगातार 6 कुओं में (चित्रा 2)।
    नोट: ये स्क्रीनिंग परख दो बैचों में किए गए थे। सबसे पहले, 20 μM अवरोधक नमूने (4 कुल स्थितियां) की जांच की गई, इसके बाद 50 μM अवरोधक नमूने (4 कुल स्थितियां) थे।

Figure 2
चित्रा 2: परख प्लेट सेटअप। प्रत्येक परख समाधान को काले 96-वेल प्लेट में छह कुओं में विभाजित किया जाता है: डीएमएसओ नियंत्रण (नीला), यौगिक 1 (हरा), यौगिक 2 (लाल), और यौगिक 3 (पीला)। आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 और जीएलए आई दोनों को तीन कुओं में जोड़ा जाएगा। एक नियंत्रण के रूप में, Gla I अकेले अन्य तीन कुओं में जोड़ा जाएगा। संक्षेप: आरएफटीएस = प्रतिकृति फॉसी लक्ष्यीकरण अनुक्रम; डीएनएमटी 1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1; डीएमएसओ = डाइमिथाइलसल्फोक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. स्क्रीन के लिए एंजाइम समाधान तैयार करें

नोट: आरएफटीएस-कमी डीएनएमटी 1 को ई कोलाई में व्यक्त किया जा सकता है और समरूपता के लिए शुद्ध किया जा सकता है। आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं को पहले41 वर्णित किया गया है। आवश्यक एंजाइम की मात्रा आयोजित किए जा रहे परखों की संख्या पर निर्भर करती है। यहां, प्रत्येक सेट में चार अलग-अलग परख किए जा रहे हैं; प्रत्येक परख तीन प्रतियों में पूरा किया जाता है।

  1. बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्रत्येक एंजाइम समाधान का 75 μL तैयार करें।
    नोट: दो एंजाइम समाधान की आवश्यकता होगी। एक समाधान में DNMT1 और Gla I शामिल होंगे; दूसरे में केवल Gla I होगा।
    1. 1xबफर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में ddH 2 O और 5x मिथाइलेशन बफर (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 500 mM पोटेशियम ग्लूटामेट, 5 mM DTT, 25% ग्लिसरॉल) जोड़ें। Gla I एंजाइम समाधान के लिए, 5x बफर के 15 μL और 58.8 μL ddH2O जोड़ें। DNMT1 + Gla I एंजाइम समाधान के लिए, 5x बफर के 15 μL और 58.2 μL ddH2O जोड़ें।
    2. 0.16 U/μL की अंतिम सांद्रता के लिए प्रत्येक घोल में 10 U/μL Gla I का 1.2 μL जोड़ें।
    3. DNMT1+ Gla I समाधान में 40 nM की अंतिम सांद्रता के लिए 5 μM RFTS-कमी DNMT1 का 0.6 μL जोड़ें।
  2. समाधान ों को मिलाने के लिए धीरे से टैप करें। टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज (1,200 × ग्राम) में कुछ सेकंड के लिए नमूने को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समाधान ट्यूब के निचले भाग में एकत्र किया गया है।
  3. शंक्वाकार-तल वाली 96-वेल प्लेट में 6 कुओं में प्रत्येक एंजाइम समाधान का एलिकोट 12 μL (चित्रा 3)।

Figure 3
चित्रा 3: एंजाइम प्लेट सेटअप। Gla I (ग्रे) और DNMT1 + Gla I (नीला) समाधान प्रत्येक को 96-वेल प्लेट में छह कुओं में विभाजित किया गया है। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, एंजाइम को एक साथ परख समाधानों की एक पंक्ति में जोड़ा जा सकता है। प्रत्येक परख स्थिति (छह कुओं) के लिए, तीन कुओं को DNMT1 + Gla I प्राप्त होगा, और तीन कुओं को अकेले Gla I प्राप्त होगा। संक्षिप्त नाम: DNMT1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. परख चलाएं और डेटा का विश्लेषण करें।

  1. प्लेट रीडर को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें। परख समाधान युक्त काली प्लेट डालें। प्लेट को हिलाएं (5 सेकंड के लिए 425 सीपीएम पर डबल ऑर्बिटल) और 485 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 528 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ प्रतिदीप्ति पढ़ें। प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, उचित तरंग दैर्ध्य कटऑफ वाले फिल्टर का उपयोग प्रतिदीप्ति रीडिंग के लिए किया जा सकता है।
  2. परख प्लेट को हटा दें। प्रत्येक कुएं में 5 μL एंजाइम घोल जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    नोट: मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें ताकि नमूने की एक पंक्ति एक साथ शुरू की जा सके।
  3. प्लेट को प्लेट रीडर में डालें। 30 मिनट के लिए हर 53 सेकंड में फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करें। प्रत्येक पढ़ने से पहले प्लेट (4 सेकंड के लिए 425 सीपीएम पर डबल ऑर्बिटल) को हिलाएं।
  4. प्रत्येक स्थिति के लिए औसत तीन प्रतियों जीएलए आई नियंत्रण परख। आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 की उपस्थिति में प्राप्त तीन प्रतियों के निशान से औसत जीएलए आई-युक्त नियंत्रण प्रतिक्रिया ट्रेस को घटाएं। सही प्रतिकृतियों के लिए माध्य की औसत और मानक त्रुटि निर्धारित करें।
  5. औसत सही प्रतिक्रिया ट्रेस को प्लॉट करें और प्रारंभिक वेग निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक रैखिक भाग को एक रेखा में फिट करें।
  6. एक यौगिक की उपस्थिति में देखे गए वेग को डीएमएसओ युक्त नियंत्रण प्रतिक्रिया में देखे गए वेग से विभाजित करके और 100 से गुणा करके प्रतिशत गतिविधि निर्धारित करें।

4. अतिरिक्त परख नियंत्रण - एंजाइमों का अनुक्रमिक जोड़

  1. बर्फ पर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 550 μL परख समाधान तैयार करें। 5x मिथाइलेशन बफर का 110 μL, 3.15 μM हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट का 3.88 μL, 47.5 mM SAM का 6.43 μL, 20 mg/mL BSA का 3.06 μL, और ddH2O का 426.6 μL जोड़ें।
  2. 3 सेकंड के लिए भंवर (3,000 आरपीएम) द्वारा घोल मिलाएं। टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज (1,200 × ग्राम) में कुछ सेकंड के लिए नमूने को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समाधान ट्यूब के निचले भाग में एकत्र किया गया है।
  3. एक काले आधे क्षेत्र की 96-वेल प्लेट में लगातार 6 कुओं में परख समाधान का एलिकोट 90 μL।
  4. बर्फ पर DNMT1 एंजाइम समाधान तैयार करें। एक ट्यूब में 5x मिथाइलेशन बफर का 4 μL, 5 μM RFTS-कमी DNMT1 का 0.76 μL और ddH 2 O का15.24μL जोड़ें। 5x मिथाइलेशन बफर के 4 μL और ddH2O के 16 μL को दूसरी ट्यूब में जोड़ें।
  5. समाधान ों को मिलाने के लिए धीरे से टैप करें। टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज (1,200 × ग्राम) में कुछ सेकंड के लिए नमूने को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समाधान ट्यूब के निचले भाग में एकत्र किया गया है।
  6. काले आधे क्षेत्र 96-वेल प्लेट में तीन कुओं में DNMT1 युक्त घोल का 5 μL जोड़ें। अन्य तीन कुओं में बफर नियंत्रण समाधान के 5 μL जोड़ें।
  7. माइक्रोटिटर प्लेट को प्लेट रीडर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। प्लेट को हिलाएं (3 सेकंड के लिए 425 सीपीएम पर डबल ऑर्बिटल) और 485 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 528 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ प्रतिदीप्ति पढ़ें। शेक को दोहराएं और 30 मिनट के लिए हर 60 सेकंड पढ़ें।
  8. जबकि परख प्लेट प्लेट रीडर में है, बर्फ पर जीएलए आई समाधान तैयार करें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5x मिथाइलेशन बफर का 8 μL, 10 U/μL Gla I का 0.64 μL और ddH2Oका 31.4 μL जोड़ें। घोल को मिलाने के लिए धीरे से टैप करें। टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज (1,200 × ग्राम) में कुछ सेकंड के लिए नमूने को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समाधान ट्यूब के निचले भाग में एकत्र किया गया है।
  9. Gla I घोल का 6 μL एक शंक्वाकार-तल वाली 96-वेल प्लेट में 6 कुओं में विभाजित करता है।
  10. प्रारंभिक 30 मिनट पढ़ने के बाद, प्लेट रीडर से काली प्लेट को हटा दें। सभी 6 कुओं में 5 μL Gla I घोल जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    नोट: एक मल्टीचैनल पाइप का उपयोग करें ताकि सभी कुओं को एक साथ शुरू किया जा सके।
  11. काली प्लेट को प्लेट रीडर में वापस रखें। 35 मिनट के लिए हर 35 सेकंड में फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करें। प्रत्येक पढ़ने से पहले प्लेट (3 सेकंड के लिए 425 सीपीएम पर डबल ऑर्बिटल) को हिलाएं।

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Representative Results

सक्रिय DNMT1 इस विश्लेषण के लिए एक शर्त है। आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 को ई.कोलाई में व्यक्त किया गया था और पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं के बाद समरूपता के लिए शुद्ध कियागया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि शुद्ध एंजाइम सक्रिय था, डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि36 की जांच के लिए एक असंतुलित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित परख का उपयोग किया गया था। यह परख एक 32 बेस जोड़ी डुप्लेक्स डीएनए का उपयोग करती है जिसमें एक एकल हेमिमिथाइलेटेड सीपीजी होता है जो एसएयू 3 ए 1 दरार साइट में स्थित होता है। Sau3A1 हेमिमिथाइलेटेड सब्सट्रेट डीएनए को छोड़ सकता है; हालांकि, जब डीएनए पूरी तरह से मिथाइलेटेड होता है तो दरार अवरुद्ध हो जाती है। आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 को 1 एसएम डीएनए और 0.5 एमएम एसएएम वाले परख में जोड़ा गया था, और एलिकोट को हटा दिया गया था और 30 मिनट से अधिक फ्लैश-जमे हुए थे। नमूने बाद में Sau3A1 के साथ पच गए, और उत्पादों को जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया गया। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्रतिक्रिया का समय बढ़ने पर डीएनए दरार से सुरक्षित है, यह दर्शाता है कि आरएफटीएस-कमी डीएनएएमटी 1 हेमिमिथाइलेटेड डीएनए को मिथाइलेटेड कर रहा है। मूल रूप से परख में मौजूद 1 μM सब्सट्रेट डीएनए में से अधिकांश को 30 मिनट के समय पाठ्यक्रम में उत्पाद में परिवर्तित कर दिया गया है।

इस पेपर में वर्णित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित परख वास्तविक समय में डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि के अवलोकन को प्रतिदीप्ति में वृद्धि के रूप में अनुमति देती है। इस परख की सफलता की कुंजी एंडोन्यूक्लिज़ जीएल आई की मिथाइल संवेदनशीलता है। जीएलए आई हेमिमिथाइलेटेड सब्सट्रेट डीएनए को कुशलतापूर्वक नहीं छोड़ता है, लेकिन पूरी तरह से मिथाइलेटेड उत्पाद डीएनए को छोड़ देगा (चित्रा 1)। बुझने वाले से फ्लोरोफोरे को छोड़ने और प्रतिदीप्ति में वृद्धि उत्पन्न करने के लिए हेयरपिन डीएनए की दरार की आवश्यकता होती है। यह प्रदर्शित करने के लिए कि एंजाइम अपेक्षा के अनुसार काम कर रहे हैं, एक नियंत्रण प्रतिक्रिया आयोजित की गई थी जिसमें एंजाइम, आरएफटीएस-कमी डीएनएमटी 1 और जीएलए आई, समवर्ती के बजाय क्रमिक रूप से जोड़े गए थे। यदि युग्मित परख सही ढंग से काम कर रही है, तो डीएनएमटी 1 के अतिरिक्त प्रतिदीप्ति को प्रभावित नहीं करना चाहिए, क्योंकि डीएनए सब्सट्रेट के मिथाइलेशन से आंतरिक रूप से बुझे हुए हेयरपिन डीएनए की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है। हालांकि, मिथाइलट्रांसफेरेज़ युक्त परखों में जीएल आई के बाद के जोड़ के परिणामस्वरूप पूरी तरह से मिथाइलेटेड हेयरपिन डीएनए की दरार के कारण प्रतिदीप्ति उत्पादन होना चाहिए। हेमिमिथाइलेटेड हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति होती है (चित्रा 5); इन परखों में 20 एनएम हेयरपिन डीएनए और 500 एसएम एसएएम शामिल थे। आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 या बफर को परख में जोड़ा गया था, और प्रतिदीप्ति का 30 मिनट के लिए पालन किया गया था।

जैसा कि चित्र 5 में देखा गया है, युग्मन एंजाइम की अनुपस्थिति में आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 से प्रतिदीप्ति अप्रभावित है (नीले रंगों में 10 एनएम आरएफटीएस-कमी डीएनएमटी 1 होता है जबकि लाल रंग बफर नियंत्रण होते हैं)। इस प्रकार, डीएनएमटी 1 द्वारा हेमिमिथाइलेटेड सीपीजी साइट का मिथाइलेशन फ्लोरेसेंस सिग्नल को काफी हद तक नहीं बदलता है। हालांकि, जब जीएलए आई को सभी कुओं में जोड़ा गया था, तो मजबूत प्रतिदीप्ति उत्पादन केवल उन परखों में देखा गया था जिनमें आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 (चित्रा 5) शामिल थे। इससे पता चलता है कि डीएनएमटी 1 द्वारा हेमिमिथाइलेटेड सब्सट्रेट डीएनए के मिथाइलेशन को जीएलए आई दरार और प्रतिदीप्ति की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस नियंत्रण परख में देखी गई प्रतिदीप्ति में वृद्धि जीएलए आई की गतिविधि को दर्शाती है क्योंकि एंजाइमों को क्रमिक रूप से जोड़ा गया था। वैकल्पिक रूप से, इन प्रतिक्रिया मिश्रणों को जीएलए आई के साथ पचाया जा सकता है, और परिणामस्वरूप ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को दरार की कल्पना करने और यह सुनिश्चित करने के लिए वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जा सकता है कि एंजाइम अपेक्षा के अनुसार काम कर रहे हैं।

DNMT1 के प्रारंभिक वेगों को सीधे निर्धारित करने के लिए इस युग्मित परख का उपयोग करने के लिए, दोनों एंजाइमों, RFTS-कमी DNMT1 और Gla I को एक साथ जोड़ने की आवश्यकता है। जब तक उत्पाद डीएनए के जीएलए आई दरार की दर डीएनएएमटी 1 द्वारा डीएनए मिथाइलेशन की दर से तेज है, तब तक उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि को प्रतिबिंबित करेगा। यह सुनिश्चित करने के लिए कि DNMT1 गतिविधि दर-सीमित है, DNMT1 की एकाग्रता अन्य सभी परख स्थितियों को स्थिर रखते हुए भिन्न हो सकती है। प्रतिदीप्ति उत्पादन की दर DNMT1 की एकाग्रता के समानुपाती होनी चाहिए। यह पहले40 में उपयोग की जाने वाली शर्तों के तहत आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 के लिए दिखाया गया है। डीएनएमटी गतिविधि की जांच करने के लिए इस युग्मित परख का उपयोग करते समय, प्रतिक्रिया के अलावा एक जीएलए आई युक्त नियंत्रण प्रतिक्रिया की जाती है जिसमें डीएनएमटी 1 और जीएलए आई (चित्रा 6 ए) दोनों शामिल होते हैं। जीएलए आई नियंत्रण के कई कार्य हैं। डीएनएमटी युक्त प्रतिक्रिया ट्रेस से जीएलए आई नियंत्रण प्रतिक्रिया ट्रेस को घटाने से हेमिमिथाइलेटेड डीएनए सब्सट्रेट और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दोनों की धीमी दरार के लेखांकन की अनुमति मिलती है। उत्पन्न सही प्रतिक्रिया निशान डीएनएमटी 1 की डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि को दर्शाते हैं। सही प्रतिक्रिया ट्रेस के प्रारंभिक रैखिक भाग को फिट करने से प्रारंभिक वेग (चित्रा 6 बी) के निर्धारण की अनुमति मिलती है। 10 एनएम हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट और 10 μM SAM के साथ, 113 ± 2 RFU / min का प्रारंभिक वेग प्राप्त किया गया था।

प्रतिस्थापित एंथ्राक्विनोन को पहले डीएनएमटी 1 की गतिविधि को रोकने के लिए दिखाया गया है। प्राकृतिक उत्पाद, लैक्केइक एसिड ए, एक अत्यधिक प्रतिस्थापित एंथ्राक्विनोन, डीएनएमटी 127 का एक शक्तिशाली, डीएनए-प्रतिस्पर्धी अवरोधक है। सरल संरचनाओं वाले कुछ यौगिक, एंथ्राक्विनोन कोर पर एक या दो प्रतिस्थापन, जिनमें से एक भारी सुगंधित प्रतिस्थापन है, को डीएनए-प्रतिस्पर्धीतरीके से डीएनएएमटी 1 को रोकने के लिए भी दिखाया गया है। यहां, जीएलए आई-युग्मित परख में आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 गतिविधि को रोकने के लिए तीन प्रतिस्थापित एंथ्राक्विनोन या एंथ्राक्विनोन जैसे अणुओं की क्षमता की जांच इन स्क्रीनिंग परखों का संचालन करने के उदाहरण के रूप में की गई थी। इन यौगिकों में एक से तीन प्रतिस्थापन होते हैं, सभी एंथ्राक्विनोन कोर के एक तरफ (तालिका 1)। इन परखों के लिए उपयोग की जाने वाली सब्सट्रेट सांद्रता (10 एनएम डीएनए और 10 एसएम एसएएम) प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए केएम की तुलना में ~ 5 गुना अधिक है। परख में उत्पन्न संकेत सीधे सब्सट्रेट डीएनए से आता है। इस वजह से, के एम के पास या उससे नीचे सांद्रता पर परख करना मुश्किलहै; पता लगाने के लिए बस पर्याप्त संकेत नहीं है। इन सब्सट्रेट सांद्रता को चुना गया था क्योंकि अवरोधकों की अनुपस्थिति में इन स्थितियों के तहत मजबूत गतिविधि देखी जाती है (चित्रा 6 बी)। अन्य सब्सट्रेट सांद्रता का उपयोग स्क्रीनिंग परख में किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एसएएम सांद्रता को संतृप्त करने पर एक स्क्रीन का संचालन एसएएम-प्रतिस्पर्धी अवरोधकों के खिलाफ खोज को पूर्वाग्रह करने के लिए एक रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रत्येक परख में हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट, मिथाइल-दान सह-कारक एसएएम, और स्क्रीन के लिए नियंत्रण के रूप में एक संभावित अवरोधक या डीएमएसओ शामिल था। हम नियमित रूप से परख में उपयोग के लिए डीएमएसओ में स्क्रीनिंग यौगिकों के 10 एमएम समाधान उत्पन्न करते हैं। एंथ्राक्विनोन जैसे कि यहां जांच किए गए जलीय घोल में खराब घुलनशीलता प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, केंद्रित स्टॉक उत्पन्न करने के लिए, डीएमएसओ का उपयोग विलायक के रूप में किया जाता है। डीएमएसओ को 5% (v/v) अंतिम सांद्रता तक जोड़ने से परख26 में गतिविधि प्रभावित नहीं होती है। हालांकि, जलीय घोल में कम घुलनशीलता वाले यौगिकों से निपटते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि यौगिक चुने हुए अंतिम स्क्रीनिंग एकाग्रता (ओं) पर घुलनशील है।

स्क्रीन में जांच की गई प्रत्येक स्थिति के लिए, एक जीएलए आई युक्त नियंत्रण परख का प्रदर्शन किया जाता है। सब्सट्रेट हेयरपिन डीएनए की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और धीमी दरार के लिए लेखांकन के अलावा, यह नियंत्रण यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि संभावित अवरोधक स्पेक्ट्रोस्कोपिक सिग्नल (जैसे, यह फ्लोरोसेंट है) के साथ हस्तक्षेप करता है या नहीं। एंजाइमों को जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू करने के बाद, स्क्रीनिंग डेटा में 53 सेकंड के समय अंतराल के साथ प्रतिदीप्ति को 30 मिनट के लिए मापा गया था। यह इस प्रयोगशाला में प्लेट रीडर पर उपलब्ध सबसे तेज़ समय अंतराल है जब एक संपूर्ण 96-वेल प्लेट पढ़ते हैं। प्रतिक्रिया निशान उत्पन्न करने के लिए अन्य समय अंतराल का उपयोग किया जा सकता है। एक उपयुक्त समय अंतराल उपयोग किए जा रहे उपकरण और पढ़े जा रहे कुओं की संख्या पर निर्भर करेगा। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक परख तीन प्रतियों में आयोजित की जाती है। औसत जीएलए आई-युक्त नियंत्रण ट्रेस को आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 की उपस्थिति में देखे गए प्रतिक्रिया निशान से घटाया जाता है। प्रतिक्रिया का प्रारंभिक वेग सही प्रतिक्रिया निशान के प्रारंभिक रैखिक भाग को फिट करके निर्धारित किया जा सकता है।

प्रारंभ में, प्रतिदीप्ति उत्पादन पर तीन संभावित अवरोधकों के प्रभाव की जांच 20 μM की अंतिम एकाग्रता पर की गई थी। सबसे पहले, परख में सब्सट्रेट सांद्रता दोनों अपने संबंधित केएम मूल्यों से ऊपर हैं। इससे कैनेटीक्स परख में अवरोध का पता लगाना अधिक कठिन हो सकता है, खासकर अगर अवरोधक प्रतिस्पर्धी हैं। दूसरा, इस स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले एंथ्राक्विनोन जैसे यौगिक ज्ञात अवरोधक, लैक्केइक एसिड ए की तुलना में संरचना में काफी सरल हैं। चूंकि इन अणुओं में कोर संरचना के आसपास केवल कुछ प्रतिस्थापन होते हैं, इसलिए हमने कमजोर इंटरैक्शन का अनुमान लगाया। डीएमएसओ युक्त नियंत्रण परख में, 111 ± 5 आरएफयू / मिनट का प्रारंभिक वेग प्राप्त किया गया था (चित्रा 7 ए)। ध्यान दें, यह डीएमएसओ की अनुपस्थिति में पहले रिपोर्ट की गई दर के समान है और पुष्टि करता है कि डीएमएसओ की कम मात्रा को जोड़ने से देखी गई गतिविधि प्रभावित नहीं होती है। दो यौगिकों के अतिरिक्त ने देखे गए प्रारंभिक वेग को कम कर दिया, जबकि तीसरे यौगिक के अतिरिक्त गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। प्रारंभिक वेगों का उपयोग प्रत्येक यौगिक की उपस्थिति में देखी गई प्रतिशत गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया गया था। 20 μM पर, यौगिक 1 और 2 के अतिरिक्त ~ 80% की प्रतिशत गतिविधि हुई, जबकि यौगिक 3 की उपस्थिति में 100% प्रतिशत गतिविधि देखी गई, यह दर्शाता है कि यह अणु एंजाइम को बाधित नहीं करता है (तालिका 1)।

अवरोधकों से एकाग्रता-निर्भर अवरोध प्रदर्शित करने की उम्मीद है। इसके बाद, इन अणुओं को 50 μM की और भी अधिक सांद्रता पर फिर से जांच की गई। परख के इस सेट के लिए, डीएमएसओ युक्त नियंत्रण परख में 125 ± 7 आरएफयू / मिनट (चित्रा 7 बी) का प्रारंभिक वेग था। यह वेग पहले से निर्धारित दरों की तुलना में थोड़ा अधिक है; हालाँकि, ये वेग त्रुटि के भीतर अपेक्षाकृत करीब हैं। फिर, यौगिक 3 का प्रारंभिक वेग पर बहुत कम प्रभाव पड़ा, जबकि यौगिक 1 और 2 के अतिरिक्त ने देखे गए प्रारंभिक वेग को कम कर दिया। जैसा कि अपेक्षित था, उच्च एकाग्रता पर, यौगिक 1 का गतिविधि पर बड़ा प्रभाव पड़ा। 50 μM पर, यौगिक 1 के अतिरिक्त ~ 60% की प्रतिशत गतिविधि हुई (तालिका 1)। हालांकि, यौगिक 2 की उच्च सांद्रता के अलावा अधिक मजबूत अवरोध नहीं हुआ। यौगिक 2 के 50 μM की उपस्थिति में देखी गई प्रतिशत गतिविधि फिर से 80% के करीब थी।

जैसा कि प्रस्तुत आंकड़ों में देखा जा सकता है, एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित प्रतिदीप्ति-आधारित डीएनए मिथाइलेशन परख का उपयोग संभावित डीएनएएमटी अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। डेटा इंगित करता है कि यौगिक 1 और यौगिक 2 संभावित अवरोधक हैं, जबकि यौगिक 3 नहीं है। संभावित अवरोधकों को वास्तविक डीएनएमटी 1 इनहिबिटर के रूप में मान्य करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है।

Figure 4
चित्रा 4: DNMT1 गतिविधि नियंत्रण। हेमिमिथाइलेटेड डुप्लेक्स डीएनए मिथाइलेशन एसएयू 3 ए 1 दरार से बचाता है। आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 को परख मिश्रण में जोड़ा गया था जिसमें 1 μM DNA और 500 μM SAM था। नमूने 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की इनक्यूबेशन के दौरान संकेतित समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे, एसएयू 3 ए 1 के साथ पच गए थे, और 18% पेज पर जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल किए गए थे। यहां, 5, 10, 15, और 30 मिनट के नमूने दिखाए गए हैं। पहली लेन एक नियंत्रण है जिसमें DNMT1 की कमी है। संक्षेप: डीएनएमटी 1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1; आरएफटीएस = प्रतिकृति फॉसी लक्ष्यीकरण अनुक्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिदीप्ति-आधारित परख नियंत्रण। आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 (10 एनएम अंतिम एकाग्रता) और जीएलए आई (0.8 यू) को क्रमिक रूप से 20 एनएम हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट और 500 एसएम एसएएम युक्त तीन प्रतियों में जोड़ा गया था। अकेले डीएनएमटी 1 (नीले सर्कल) या बफर (लाल सर्कल) को जोड़ने से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। सभी परखों में जीएलए आई को जोड़ने से उन परखों में प्रतिदीप्ति उत्पादन होता है जिनमें डीएनएमटी 1 होता है, लेकिन उन परखों में नहीं जो नहीं करते हैं। संक्षेप: डीएनएमटी 1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1; आरएफटीएस = प्रतिकृति फॉसी लक्ष्यीकरण अनुक्रम; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया निशान। तीन प्रतियों में 10 एनएम हेयरपिन डीएनए सब्सट्रेट और 10 एसएम एसएएम शामिल थे। (ए) आरएफटीएस की कमी वाले डीएनएमटी 1 (2 एनएम) और जीएलए आई (0.8 यू) को तीन परखों (नीला) में जोड़ा गया था, और अकेले जीएलए आई (0.8 यू) को तीन परखों (लाल) में जोड़ा गया था। मजबूत प्रतिदीप्ति उत्पादन केवल परख में देखा जाता है जिसमें दोनों एंजाइम होते हैं। (बी) औसत जीएलए आई प्रतिक्रिया ट्रेस को डीएनएमटी 1 + जीएलए आई प्रतिक्रिया निशान से घटाया गया था। तीन प्रतियों के डेटा के माध्य की औसत और मानक त्रुटि दिखाई गई है। ट्रेस के रैखिक भाग को फिट करने से 113 ± 2 RFU / min का प्रारंभिक वेग मिलता है। संक्षेप: डीएनएमटी 1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1; आरएफटीएस = प्रतिकृति फॉसी लक्ष्यीकरण अनुक्रम; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ; एसएएम = एस-एडेनोसिलमेथिओनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: संभावित अवरोधकों की उपस्थिति में डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि। आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएएमटी 1 की डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि की जांच डीएमएसओ (काला), यौगिक 1 (लाल), यौगिक 2 (नीला), या यौगिक 3 (हरा) की उपस्थिति में की गई थी। प्रारंभिक वेग निर्धारित करने के लिए 20 μM यौगिक (A) और 50 μM यौगिक (B) पर सही प्रतिक्रिया के निशान फिट थे। यौगिक 1 और 2 के अतिरिक्त ने देखे गए वेग को कम कर दिया, जबकि यौगिक 3 का गतिविधि पर बहुत कम प्रभाव पड़ा। तीन प्रतियों के लिए माध्य की औसत और मानक त्रुटि दिखाई गई है। संक्षेप: डीएनएमटी 1 = डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ 1; आरएफटीएस = प्रतिकृति फॉसी लक्ष्यीकरण अनुक्रम; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ; डीएमएसओ = डाइमिथाइलसल्फोक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: संभावित छोटे अणु अवरोधकों की उपस्थिति में देखे गए प्रारंभिक वेग और प्रतिशत गतिविधियां। प्रारंभिक वेग को एक लाइन में सही प्रतिक्रिया निशान के प्रारंभिक रैखिक भाग को फिट करके निर्धारित किया गया था; फिट से संबंधित त्रुटि रिपोर्ट की गई है। प्रतिशत गतिविधि को डीएमएसओ नियंत्रण प्रतिक्रिया में निर्धारित दर द्वारा यौगिक की उपस्थिति में निर्धारित दर को विभाजित करके और 100 से गुणा करके निर्धारित किया गया था; संबद्ध त्रुटि प्रचारित की गई थी. संक्षेप: सीएमपीडी = यौगिक; डीएमएसओ = डाइमिथाइलसल्फोक्साइड; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ के अवरोधकों की पहचान और विशेषता के लिए, एंजाइम की गतिविधि को मापा जाना चाहिए। डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ गतिविधि की जांच के लिए कई तरीके मौजूद हैं। गतिविधि की निगरानी आमतौर पर रेडियोधर्मिता का उपयोग करके की जाती है; एसएएम के लेबल मिथाइल समूह के हस्तांतरण को 29,30,31,32,33,34 की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। मिथाइल-संवेदनशील एंडोन्यूक्लिज़ का उपयोग करने वाले जेल-आधारित परख भी35,36 वर्णित किए गए हैं। ये परख आमतौर पर असंतुलित होते हैं और गतिविधि की जांच करने के लिए कई चरणों की आवश्यकता होती है। यहां, एक एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख को संभावित डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए वर्णित किया गया है। इस तकनीक के कई फायदे हैं। परख अपेक्षाकृत सरल है। सिग्नल प्राप्त करने के लिए इसे पृथक्करण तकनीकों (जैसे, वैद्युतकणसंचलन, फ़िल्टर बाइंडिंग) की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, परख निरंतर है, जिससे वास्तविक समय में डेटा के संग्रह की अनुमति मिलती है। मिथाइलेशन गतिविधि के लिए एक अलग निरंतर कैनेटीक्स परख हाल ही मेंवर्णित किया गया था। हालांकि, इस परख को स्पेक्ट्रोस्कोपिक सिग्नल उत्पन्न करने के लिए तीन युग्मन एंजाइमों की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित परख को एकल युग्मन एंजाइम की आवश्यकता होती है।

ये डीएनएमटी गतिविधि परख पहले एक परख समाधान उत्पन्न करके किए जाते हैं जिसमें एंजाइमों को छोड़कर सभी परख घटक होते हैं। परख समाधान में सब्सट्रेट, हेयरपिन डीएनए और एसएएम होते हैं; 0.1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए भी नियमित रूप से परख में शामिल है। परख में उपयोग किए जाने वाले डीएनए और डीएनएमटी 1 की बेहद कम सांद्रता (नैनोमोलर रेंज में) के साथ, बीएसए सामान्य प्रोटीन एकाग्रता को बढ़ाता है ताकि पिपेट टिप्स, ट्यूबों और माइक्रोटिटर प्लेटों और पर्यावरणीय अपमानों के आसंजन को रोकने में मदद मिल सके जो एंजाइम गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं। प्रतिक्रिया तब परख समाधानों में एंजाइमों को जोड़कर शुरू की जाती है। सभी परख घटकों की अंतिम सांद्रता का निर्धारण करते समय इन कमजोर पड़ने का हिसाब रखा जाना चाहिए। प्रतिक्रियाएं 95 μL परख समाधान में एंजाइम समाधान के 5 μL जोड़कर शुरू की जाती हैं। इसलिए, परख समाधान में डीएनए, एसएएम और बीएसए की सांद्रता वांछित अंतिम एकाग्रता 1.05 गुना है। उदाहरण के लिए, यदि 10 एनएम डीएनए वांछित है, तो परख समाधान 10.5 एनएम डीएनए के साथ उत्पन्न होते हैं। एंजाइम समाधान में आरएफटीएस-कमी वाले डीएनएमटी 1 की एकाग्रता वांछित अंतिम एकाग्रता का 20 गुना है। यहां, एंजाइम समाधान में 40 एनएम आरएफटीएस-कमी डीएनएमटी 1 का उपयोग किया गया था ताकि प्रत्येक परख में डीएनएमटी 1 की अंतिम एकाग्रता 2 एनएम हो।

चूंकि Gla I एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम है, इसलिए इसकी मात्रा निर्माता द्वारा प्रदान की गई इकाइयों (U) में दी जाती है। उत्पन्न एंजाइम समाधानों में 0.16 U/μL Gla I होता है ताकि प्रत्येक कुएं में Gla I का कुल 0.8 U जोड़ा जा सके। अभिकर्मक लागतों को बचाने के लिए, उपयुक्त एंजाइम समाधानों की छोटी मात्रा तैयार की जाती है, और उन समाधानों को फिर शंक्वाकार-तल वाली 96-वेल प्लेटों में विभाजित किया जाता है। मल्टीचैनल पिपेट्स का उपयोग करके, 5 μL एंजाइम समाधान शंक्वाकार-तल प्लेट से काले 96-वेल हाफ-एरिया प्लेट में परख समाधान में स्थानांतरित हो जाते हैं। यह प्रक्रिया एक साथ परख की एक पंक्ति शुरू करने की अनुमति देती है। वैकल्पिक रूप से, एक अलग परख प्लेट सेटअप के साथ, एंजाइम समाधान को अभिकर्मक जलाशयों में रखा जा सकता है, और फिर परख समाधानों में एंजाइम जोड़ने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण को जलाशयों में तरल वसूली अपशिष्ट के कारण एंजाइम समाधान की उच्च मात्रा की आवश्यकता होगी। हम 96-अच्छी तरह से आधे क्षेत्र की प्लेटों में परख करते हैं; इन प्लेटों में छोटा कुआं आकार पारंपरिक 96-वेल प्लेटों की तुलना में एक छोटी कुल परख मात्रा (100 μL) की अनुमति देता है, फिर से अभिकर्मक लागतों पर बचत करता है।

यहां वर्णित डीएनए मिथाइलेशन परख को युग्मन एंडोन्यूक्लिज़ जीएलए आई की विशिष्टता के कारण हेमिमिथाइलेटेड सब्सट्रेट डीएनए की आवश्यकता होती है। यह डीएनएमटी 1 की गतिविधि की जांच के लिए परख को विशेष रूप से अच्छा बनाता है, क्योंकि यह आइसोजाइम अधिमानतः हेमिमिथाइलेटेड डीएनए 1 को मिथाइलेटेडकरता है। डीएनएमटी 3 आइसोजाइम नॉनमिथाइलेटेड और हेमिमिथाइलेटेड डीएनए1 के बीच वरीयता प्रदर्शित नहीं करते हैं। इस प्रकार, इस परख का उपयोग डीएनएमटी 3 आइसोजाइम की गतिविधि की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। वास्तव में, छोटे अणुओं द्वारा डीएनएमटी 3 ए के निषेध का मूल्यांकन इस परख 26,27,41 का उपयोग करके किया गया है। हेमिमिथाइलेटेड सब्सट्रेट डीएनए की आवश्यकता का मतलब है कि इस परख का उपयोग नॉनमिथाइलेटेड और हेमिमिथाइलेटेड सीपीजी साइटों के बीच सब्सट्रेट विशिष्टता या वरीयता की जांच करने के लिए नहीं किया जा सकता है।

यह परख एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक संकेत पर निर्भर करती है: फ्लोरोफोरे और बुझाने वाले को अलग करने पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि। इस प्रकार, छोटे अणु जो स्वयं फ्लोरेस या फ्लोरेसेंस बुझाते हैं, परख में हस्तक्षेप कर सकते हैं। प्रत्येक परख स्थिति के लिए जीएलए आई-युक्त नियंत्रण का संचालन करने का एक कारण इस संभावना की जांच करना है। छोटे अणु के स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुणों को केवल जीएलए आई नियंत्रण डेटा का उपयोग करके जिम्मेदार ठहराया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यदि अणु में कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत है)। हालांकि, यदि अणु दृढ़ता से फ्लोरोसेंट या एक मजबूत बुझाने वाला है, तो इस परख का उपयोग डीएनए मिथाइलेशन गतिविधि का पता लगाने के लिए नहीं किया जा सकता है।

यहां वर्णित स्क्रीन संभावित डीएनएमटी अवरोधकों का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक परख है। प्रारंभिक स्क्रीन में "हिट" यौगिकों को द्वितीयक परख में मान्य किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे सही डीएनएमटी अवरोधक हैं। क्योंकि यह परख एक युग्मित कैनेटीक्स परख है, बस एक विशेष छोटे अणु की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति पीढ़ी में कमी का मतलब यह नहीं है कि यौगिक मेथिलट्रांसफेरेज़ को रोक रहा है। युग्मन एंजाइम जीएलए आई को बाधित करने में सक्षम एक छोटा अणु भी प्रतिदीप्ति उत्पादन में कमी का परिणाम होगा। एक साधारण माध्यमिक स्क्रीन में संभावित अवरोधकों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में जीएलए आई की गतिविधि का निर्धारण करना शामिल है। इस परख के लिए, पूरी तरह से मिथाइलेटेड आंतरिक रूप से बुझाए गए हेयरपिन डीएनए का उपयोग सब्सट्रेट26,41 के रूप में किया जाता है। एकत्रीकरण-निर्भर अवरोध और डीएनए इंटरकेलेशन की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए अतिरिक्त परखों का उपयोग संभावित अवरोधकों 26,41 को और मान्य करने के लिए माध्यमिक परखके रूप में भी किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत आंकड़ों में, यौगिक 1 और यौगिक 2 को संभावित डीएनएमटी 1 अवरोधकों के रूप में पहचाना गया था। विभिन्न प्रकार के द्वितीयक परखों का उपयोग करते हुए, यौगिक 1 को डीएनएमटी 141 के प्रत्यक्ष अवरोधक के रूप में मान्य किया गया है। इस पहले प्रकाशित काम से पता चला है कि एंथ्राक्विनोन कोर की सी 2 स्थिति में भारी प्रतिस्थापन वाले यौगिक डीएनएमटी 1 के अधिक प्रभावी अवरोधक प्रतीत होते हैं। हालांकि, डीएनएमटी 1 निषेध के लिए संरचनात्मक निर्धारकों को पूरी तरह से समझने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता है।

यहां वर्णित युग्मित परख के कई संभावित उपयोग हैं। परख का उपयोग स्थिर-राज्य कैनेटीक्स प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। क्योंकि परख निरंतर है, प्रारंभिक वेगों का निर्धारण करना सीधा है। इस परख का उपयोग पहले विभिन्न कटे हुए डीएनएमटी 1 प्रोटीन40 के मैक्रोस्कोपिक कैनेटीक्स मापदंडों (यानी, केएम, वी मैक्स और केकैट) की जांच करने के लिए किया गया है। परख का उपयोग डीएनएमटी 1 निषेध41 के लिए अणुओं के एक छोटे सेट की जांच करने और डीएनएमटी 3 ए गतिविधि 26,27,41 पर उनके प्रभाव की जांच करके पहचाने गए अवरोधकों की आइसोजाइम विशिष्टता का आकलन करने के लिए किया गया है। परख का उपयोग अवरोधकों को चिह्नित करने के लिए भी किया गया है। निरोधात्मक प्रोटीन डोमेन36,40 और नए छोटे अणु 27,41 दोनों के निषेध और शक्ति (जैसे, केआई, आईसी50) का तंत्र इस युग्मित कैनेटीक्स परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया है। परख को एचटीएस अभियान में उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया गया है। इस मामले में, परख को 384-वेल प्रारूप में आगे छोटा किया गया था और प्रारंभिक स्क्रीन26 के लिए समापन बिंदु परख के रूप में उपयोग किया गया था। इस प्रकार, यहां वर्णित प्रतिदीप्ति-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख एक बहुमुखी परख है जिसका उपयोग डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ की गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है और इन महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक संशोधक के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस काम के समर्थन के लिए बकनेल विश्वविद्यालय और रसायन विज्ञान विभाग को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040

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जैव रसायन अंक 186 जैव रसायन मुद्दा,
डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए निरंतर फ्लोरेसेंस-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख
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Switzer, R., Ward, K. A., Medrano, J. Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (186), e62949, doi:10.3791/62949 (2022).

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