Methodenartikel

Live-Bildgebung des mitochondrialen Systems in kultivierten Astrozyten

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DOI:

10.3791/62957

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16. November 2021

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1Department of Psychiatry, Center for Psychiatric Neurosciences, Lausanne University Hospital (CHUV) and University of Lausanne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Methode zur mitochondrialen Zeitraffer-Bildgebung von Astrozytenkulturen, die mit dem MitoTimer-Biosensor ausgestattet sind, und die daraus resultierende multiparametrische Analyse der mitochondrialen Dynamik, Mobilität, Morphologie, Biogenese, Redoxzustand und Umsatz.

Zusammenfassung

Während den mitochondrialen Veränderungen auf neuronaler Ebene viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, zeigen neuere Beweise, dass mitochondriale Dynamik und Funktion in Astrozyten an der Kognition beteiligt sind. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Zeitraffer-Bildgebung von Astrozytenkulturen, die mit einem mitochondrialen Biosensor ausgestattet sind: MitoTimer. MitoTimer ist ein leistungsstarkes und einzigartiges Werkzeug zur Beurteilung der mitochondrialen Dynamik, Mobilität, Morphologie, Biogenese und des Redoxzustands. Hier werden die verschiedenen Verfahren zur Kultur, Bildaufnahme und anschließenden mitochondrialen Analyse vorgestellt.

Einleitung

Astrozyten sind entscheidende Akteure bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Es ist vielleicht am bekanntesten, dass sie eine bedeutende strukturelle Rolle im Gehirn spielen, als Teil der Blut-Hirn-Schranke1 und durch die Unterstützung von Neuronen und Synapsen im gesamten Gehirn2. Die Astrozytenunterstützung von Neuronen ist sowohl strukturell3 als auchmetabolisch 4,5, wobei Astrozyten die Neurogenese und Synaptogenese fördern und gleichzeitig Schlüsselmetaboliten wie Laktat an aktive Neuronenliefern 4,6,7. Über die Rolle der strukturellen Unterstützung hinaus sind Astrozyten aktive Zellen, die an der Ca2+-Signalisierung und -Pufferung (einschließlich spontaner mitochondrialer Ca2+-Zuflüsse) 8,9, K+ Pufferung10beteiligt sind und sich in Zeiten der Verletzung an die Bedürfnisse des Gehirns anpassen und reagieren können11,12 . Als solche dynamischen Zellen haben Astrozyten einen robusten Energiebedarf, der ein effizientes mitochondriales Netzwerk erfordert. Diese Mitochondrien spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Pufferung übermäßig reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)13. Zusätzlich zu ihrer individuellen oder lokalen Rolle der Energieerzeugung und ROS-Pufferung fungieren Mitochondrien als Netzwerk14. In diesem Sinne halten sie das Gleichgewicht zwischen spaltenden und fusionierenden Mitochondrien aufrecht, die neue/reduzierte Mitochondrien bzw. ältere/oxidierte Mitochondrien darstellen15. Der gesamte Redoxzustand einer Zelle kann durch den Redoxzustand des mitochondrialen Netzwerks gemessen werden. In der Pathologie ist dies eine kritische Information, die Aufschluss darüber geben kann, welche Zellen möglicherweise nicht optimal funktionieren.

In den letzten Jahren wurden viele Sensoren entwickelt, um die Dynamik und Funktionen von Mitochondrien in Zellen zu untersuchen. Zum Beispiel werden Sensoren, die den Energieaustausch (ATP), den Redoxzustand (NADH / NAD+, ROS) und die enzymatische Funktionalität (cAMP, Ca2 +, Zn2 +) messen, derzeit bei der Untersuchung der mitochondrialen Funktionverwendet 16. Unter ihnen ermöglicht MitoTimer, die Veränderungen der mitochondrialen Morphologie (Größe, Form, Oberfläche), Mobilität (Geschwindigkeit, Verschiebung) und Dynamik (Fusions- und Spaltereignisse) sowie der gesamten mitochondrialen Fluktuationsrate und des Redoxzustands zu verfolgen. MitoTimer ist ein mutiertes rot fluoreszierendes Protein, drFP58317, mit einem mitochondrialen Signal von der Untereinheit VIII der menschlichen Cytochrom-c-Oxidase18,19 zur Visualisierung neu synthetisierter Mitochondrien in grün (488 nm) und oxidierter Mitochondrien in rot (555 nm). Die Verwendung des grünen (488 nm) und roten (555 nm) Fluoreszenzverhältnisses ermöglicht die gleichzeitige Auswertung einzelner Mitochondrien, ihrer Morphologieanalyse, fusions- / spaltereignisse und der Redoxzustandsgeschichte20,21. Diese einzigartige Eigenschaft kann genutzt werden, um viele wissenschaftliche Fragen zur physiologischen und pathologischen Rolle der Mitochondrien zu untersuchen, und ist daher sehr vielversprechend, um die zugrunde liegenden Mechanismen der mitochondrialen Dynamik in vielen verschiedenen Zelltypen aufzudecken.

Wir haben kürzlich einen neuen lentiviralen Vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, im Folgenden LV-G1-MitoTimer genannt) entwickelt, um die Dynamik und Funktionen der Mitochondrien speziell in Astrozyten in vitro und in vivozu untersuchen22. LV-G1-MitoTimer verwendet eine gekürzte Version des Glialfibrillary Acidic Protein (GFAP) Promotors gfaABC1D, mit einem B3 Enhancer (gfaABC1D(B3), im Folgenden G1 genannt) kombiniert mit dem zuvor beschriebenen miR124T neuronalen Detargeting-System23. Es ermöglicht die exklusive Expression des mitochondrialen Biosensors in Astrozyten in vitro und in vivo22. Hier werden die verschiedenen Schritte vorgestellt, um eine Kultur von Ratten-Hippocampus-Astrozyten durchzuführen und sie mit dem LV-G1-MitoTimer-Biosensor auszustatten, sowie die verschiedenen Mikroskopieschritte, um das Verhalten von Astrozyten-Mitochondrien während mehrerer aufeinanderfolgender Stunden / Tage zu verfolgen.

Protokoll

Das vorliegende Protokoll wurde mit Zustimmung einer Ethikkommission (Abkommen VD3602, Lausanne, Schweiz) durchgeführt und folgt den europäischen Richtlinien für die Verwendung von Tieren.

1. Ratten-Hippocampus-Astrozyten-Primärkultur

  1. Opfern Sie fünf Rattenwelpen (Wistar IGS Ratte) durch Enthauptung am postnatalen Tag 1-2.
  2. Entfernen Sie das Gehirn und bewahren Sie es in einer Petrischale auf, die 5 ml frisches Astrozytenmedium enthält (DMEM mit GlutaMAX, ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin und 10% frischem Pferdeserum).
  3. Isolieren Sie den Hippocampus. Dissoziieren Sie in 5 ml des astrozytären Mediums durch drei Passagen durch eine 21 G Nadel und drei Passagen durch eine 25 G Nadel.
  4. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zählen Sie in einem Hämozytometer.
  5. 20.000-25.000 Zellen/cm2 inMultiwell-Schalen (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) plattieren und bei 37 °C unter einer Atmosphäre mit 5%CO2 für den Rest des Experiments lagern.
  6. Ersetzen Sie das Medium vollständig nach 3 Tagen in vitro (DIV3).
  7. Bei DIV8 werden 0,6 pg p24-Antigen pro Zelle des lentiviralen Vektors hinzugefügt, der für den mitochondrialen Biosensor MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22)kodiert ist, der in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS + 0,01% BSA) verdünnt ist.
  8. Bei DIV9 mit vorgewärmtem 1x sterilem PBS (37 °C) waschen und frisches Astrozytenmedium hinzufügen.
  9. Bei DIV11 2 Wäschen mit vorgewärmtem 1x sterilem PBS (37 °C) durchführen und frisches Astrozytenmedium ohne Phenolrot hinzufügen.
    HINWEIS: Die Wahl der Beschichtung hängt vom beabsichtigten Assay ab. Als Standardbeschichtung für die Primärkultur von Astrozyten wird empfohlen, 0,2 mg/ml Poly-D-Lysin oder 8,7 μg/cm2 Basalmembranmatrix (z. B. Matrigel) zu verwenden. Um das mitochondriale System von Astrozyten sichtbar zu machen, ist es wichtig, an abgeflachten und gedehnten Zellen zu arbeiten. In diesem Zusammenhang ist die Kombination von Basalmembranmatrix auf IBIDI U-Schienen am besten geeignet. Es ist auch wichtig, nicht mit Phenolrot zu arbeiten, das bei wiederholter Lichteinwirkung für die Zelle toxisch ist.

2. Langzeitüberwachung des mitochondrialen Systems.

  1. Beurteilen Sie das astrozytäre mitochondriale System mindestens 3-5 Tage nach den lentiviralen Infektionen mit LV-G1-MitoTimer (um ein ausreichendes Maß an Fluoreszenz in den Mitochondrien zu ermöglichen).
  2. Bilden Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop ab, das von der Erfassungs- und Analysesoftware gesteuert wird, und einem Modul zur vollständigen Automatisierung der Erfassung.
    HINWEIS: Einzelheiten zu der in dieser Studie verwendeten Software und dem Modul finden Sie in der Materialtabelle.
  3. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop mit einem Käfiginkubator ausgestattet ist (siehe Materialtabelle),um die Astrozytenkultur während des gesamten Experiments bei5% CO2 und 37 °C zu halten.
  4. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder mit sequentieller Anregung bei 490 nm (für grünen Kanal) und 550 nm (für roten Kanal) mit Detektion von grünen (500-540 nm für grünen Kanal) und roten (550-600 nm für roten Kanal) Fluoreszenzsignalen.
  5. Wählen Sie 5 Astrozyten pro Vertiefung mit einem mitochondrialen Netzwerk, das ausreichende Mengen an LV-G1-MitoTimer mit einer Vergrößerung von 40x exprimiert. Achten Sie darauf, Astrozyten so flach und groß wie möglich auszuwählen und sich nicht in Zellhaufen zu befinden (um an einzelnen Zellen zu arbeiten).
  6. Speichern Sie die Koordinaten der 5 ausgewählten Zellen in einer xlm-Datei (map.xlm). Diese map.xlm ermöglicht es dem Benutzer, im Laufe der Zeit zu denselben Zellen zurückzukehren.
  7. Erfassen Sie Bildsequenzen (1 Bild/s für 60 s) mit einer Vergrößerung von 150x (100x Ölimmersionsobjektiv, 1,5x Zwischenvergrößerung) für jede Koordinate.
  8. Wiederholte Bildaufnahme (1 Bild/s für 60 s) für die gleichen Astrozyten 6 h, 12 h und 24 h nach der Behandlung.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einem schnellen und effizienten Autofokussystem ausgestattet ist. In diesem Zusammenhang kam die Hardwarelösung Perfect Focus System (PFS) zum Einsatz. PFS verwendet Nahinfrarot-870-nm-LED- und CCD-Liniensensoren, um axiale Fokusschwankungen in Echtzeit während bildgebender Langzeituntersuchungen zu bekämpfen.

3. Analyse der individuellen mitochondrialen Morphologie und des LV-G1-MitoTimer-Verhältnisses

HINWEIS: NIS General Analysis 3 (GA3) von Nikon wurde verwendet, um die morphometrische Analyse in dieser Studie zu automatisieren.

  1. Wählen Sie für jede Bildsequenz (Baseline, 6 h, 12 h, 24 h) den ersten Frame für rote und grüne Kanäle aus, indem Sie auf ND Processing > Select Frameklicken.
  2. Führen Sie den roten und den grünen Kanal zusammen, indem Sie Conversions > Merge Channel auswählen.
  3. Um die Bildschattierung zu korrigieren, wählen Sie Vorverarbeitung > Automatische Schattierungskorrektur.
  4. Wenden Sie den Rolling Ball-Algorithmus an, indem Sie Preprocessing > Rolling Ballauswählen.
  5. Um Binärmasken für jedes Mitochondrium zu generieren, wählen Sie Segmentierung > Schwellenwert.
  6. Entfernen Sie alle Objekte, die durch den Rahmen abgeschnitten sind, indem Sie Binärverarbeitung > Rahmen berührenauswählen.
  7. Um die Fläche zu messen, wählen Sie "Messung > Objektbereich ".
  8. Um den Durchmesser zu messen, wählen Sie Messung > Eq-Durchmesser.
  9. Um die Länge zu messen, wählen Sie Messung > Länge.
  10. Um die Breite zu messen, wählen Sie > Breite.
  11. Um die Rauheit zu messen, wählen Sie Messung > Rauheit.
  12. Um die Zirkularität zu messen, wählen Sie Messung > Zirkularität.
  13. Um die Dehnung zu messen, wählen Sie Messung > Dehnung.
  14. Erstellen Sie eine Gruppe (Rechtsklick) mit der obigen Messung und benennen Sie sie in MorphoData um.
  15. Messen Sie die mittlere Grüne Intensität, indem Sie Messung > Mittlere Intensitätauswählen.
  16. Messen Sie die mittlere Rote Intensität, indem Sie Messung > Mittlere Intensitätauswählen.
  17. Um das Rot/Grün-Verhältnis zu messen, wählen Sie "Maß > Verhältnis ".
  18. Erstellen Sie eine Gruppe (Rechtsklick) mit der obigen Messung und benennen Sie sie in RatioData um.
  19. Exportieren Sie die Tabelle in eine CSV-Datei, indem Sie Referenz > Tabelle in CSVauswählen.
  20. Speichern Sie das GA3-Analyseskript, indem Sie Speichern unter
    ANMERKUNG: Eine nicht erschöpfende Liste der in diesem Verfahren verwendeten Kriterien ist in Abbildung 1, Tabelle 1und Tabelle 2zusammengefasst . Die Analyse-GA3-Skriptdatei ist ergänzend verfügbar (Supplemental Coding File 1 und Abbildung 2). Die verwendeten Schwellenwerte wurden angepasst, um so viele Mitochondrien wie möglich zu individualisieren (wobei große mitochondriale Netzwerke nach Möglichkeit ausgeschlossen wurden). Wo immer möglich, werden mitochondriale Netzwerke entweder manuell individualisiert oder von den Analysen ausgeschlossen. Führen Sie aufgrund der interzellulären Variabilität diese Analysen an mindestens 20-25 Zellen pro Zustand durch (mit mindestens 50 Mitochondrien pro Zelle).

4. Analyse der mitochondrialen Motilität

HINWEIS: Aufgrund der hohen Komplexität der mitochondrialen Bewegungen wird die manuelle Motilitätsanalyse bevorzugt. Hier wurde Nikons NIS-Element-System verwendet, um Mitochondrien manuell zu verfolgen.

  1. Öffnen Sie das Tracking-Modul in NIS, und wählen Sie View > Analysis > Trackingaus.
  2. Klicken Sie auf Neuen ROI definieren.
  3. Wählen Sie mit dem automatischen Erkennungstool25-50 Mitochondrien auf dem ersten Bild der Bildsequenz aus.
  4. Klicken Sie auf Track Autodetected ROIs Analyze.
  5. Löschen Sie ggf. die falschen ROI-Tracks.
  6. Exportieren Sie die Tabelle in eine CSV-Datei.
    ANMERKUNG: Eine nicht erschöpfende Liste der in diesem Verfahren verwendeten Kriterien ist in Abbildung 1 und Tabelle 3zusammengefasst. Eine Tracking-Analyse liefert im Allgemeinen einen Pfad, der die Bewegungen der Mitte jedes verfolgten Objekts darstellt. Die verschiedenen Tracking-Optionen müssen in der Tracking-Option eingestellt werden. Bevorzugen Sie die Auswahl isolierter Mitochondrien, die ausreichend voneinander entfernt sind, um die Verfolgung zu erleichtern. Behalten Sie nur die Objekte bei, die konsistent über die gesamte Sequenz verfolgt werden konnten. Gehen Sie auf die gleiche Weise vor, um Ausreißer aufgrund der Nachverfolgung schlechter Qualität zu entfernen. Folglich unterscheidet sich die Menge der in diesem Abschnitt analysierten Objekte von der für statische morphologische Analysen analysierten und ist im Allgemeinen kleiner.

5. Datentransformation, Normalisierung und statistische Analyse

HINWEIS: Hauptsächlich aufgrund der hohen Heterogenität der Mitochondrien haben die generierten Daten oft eine Nicht-Normalverteilung.

  1. Protokollieren Sie die Messungen vor der Verarbeitung manuell.
  2. Normalisieren Sie für jede Analyse und jeden Zeitrahmen die resultierenden Daten manuell durch den Mittelwert der in der Referenzerfassung erhaltenen Daten.
  3. Erwägen Sie außerdem eine zweite/ doppelte Normalisierung zu einer Kontrollbedingung, um beispielsweise die Wirkung einer Behandlung zu bewerten.
  4. Führen Sie dann eine statistische Analyse mit einer bidirektional abgestimmten ANOVA durch. Hier kam GraphPad Prism V8 zum Einsatz.

Ergebnisse

Die Primärkultur von Astrozyten, die mit LV-G1-MitoTimer infiziert waren, zeigte typische mitochondriale Netzwerke. Vor der Behandlung zeigten Astrozyten, die LV-G1-MitoTimer exprimierten, die heterogene mitochondriale Größe und verschiedene grün/rote Fluoreszenzintensitäten(Abbildung 3, Abbildung 4und Video 1). Das mitochondriale System von Astrozytenkulturen, die LV-G1-MitoTimer exprimieren, wurde vor und nach der Inkubation mit H2 02 (10 μM) überwacht. Die verschiedenen mitochondrialen Merkmale, die oben beschrieben wurden, wurden über 12 h (alle 3 h) berechnet und normalisiert (Zelle für Zelle) auf ihren Ausgangszustand. Auf morphologischer Ebene (Abbildung 3B) beginnen die Wirkungen vonH2O2bei etwa 6 h sichtbar zu werden. Tatsächlich waren die Mitochondrien fragmentiert (Abnahme von Länge, Oberfläche und Dehnungsfaktor). Diese Fragmentierung ist 12 h nach der Behandlung noch offensichtlicher. Beachten Sie, dass die Durchmesser, Breiten und Kugeln nicht reduziert wurden. In Bezug auf Redoxzustand und Umsatz (Abbildung 3C), 3 h nachH2O2-Behandlungnahm der Anteil der grünen Mitochondrien in Astrozyten zu (die Folge eines schnellen Anstiegs der mitochondrialen Biogenese). Nach 6 h kehrte das Grün/Rot-Verhältnis auf das Ausgangsniveau zurück, aber die Anzahl der rein roten Mitochondrien stieg gegenüber dem Basalspiegel signifikant an. Nach 12 h waren die Folgen der oxidativen Behandlung vonH2O2sichtbar und führten zu einer erheblichen Erhöhung des Verhältnisses und der Anzahl der roten Punkten. Hinsichtlich der Dynamik und Beweglichkeit (Abbildung 3D), 3 h nach der Behandlung wurden alle Kriterien vorübergehend erhöht. Längerfristig (12 h) bewegten sich die Mitochondrien langsamer und über kürzere Distanzen.

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Abbildung 1: Astrozytenkultur, die den LV-G1-MitoTimer-Biosensor ausdrückt. (A) Konfokale Fotografien von Astrozyten, die LV-G1-MitoTimer exprimieren. (B) Auswahl konfokaler Fotografien von reduzierten (grün) ausgeglichenen (orange) und oxidierten (roten) Mitochondrien mit unterschiedlichen Fragmentierungsgraden. (C) Zusammenfassendes Diagramm der verschiedenen Kriterien, die für die Analyse in einem Astrozyten mit LV-G1-MitoTimer zur Verfügung stehen. Maßstabsleiste: (A) Obere Platte: 50 μm, untere Platte: 10 μm, (B) 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Mitochondriale Morphologie und Verhältnisanalyse. (A) GA3-Skriptübersicht zur Analyse der individuellen mitochondrialen Morphologie und des Verhältnisses. (B) Erste Fotos eines Astrozyten, der LV-G1-MitoTimer ausdrückt, analysiert mit dem GA3-Skript. (C) Beispiel für binäre Masken, die für das mitochondriale System von Astrozyten erzeugt wurden. Maßstabsleiste: 10 μm (B-C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Die Auswirkungen vonH2O2auf das mitochondriale System der Astrozyten. (A) Fotografien von Astrozyten, die LV-G1-MitoTimer 1 h vor und 6 h, 24 h nach der Behandlung mit PBS (CTRL) und 10 μMH2O2ausdrücken. (B) Radardiagramme der mitochondrialen Morphologie, (C) Redoxzustand und -umsatz und (D) Mobilitätskriterien, die an Astrozyten während des Ausgangswerts und 3 h, 6 h und 12 h nachH2O2-Behandlung bewertetwurden. SA: Fläche; D: Durchmesser; L: Länge; W: Breite; R: Rundheit; S: Sphäroizität; EF: Dehnungsfaktor (=L/W); G/R: Individuelles Rot/Grün-Verhältnis; Gpuncta: Prozentsatz der grünen Puncta-Mitochondrien; Rpuncta: Prozentsatz der roten Puncta-Mitochondrien; Dis: Verdrängung; Tr: Tracklänge; Sp und SpV: Geschwindigkeit und Geschwindigkeitsvarianz; Str: Geradheit. Maßstabsleiste: 20 μm (A) und 2,5 μm (Einschub). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Fotografien von Astrozyten, die LV-G1-MitoTimer exprimieren und ein homogenes und ausgeglichenes mitochondriales Netzwerk während der Baseline zeigen. Maßstabsleiste: 20 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Wirkung der H2O2-Behandlung auf das mitochondriale System kultivierter Astrozyten. Astrozytäre Mitochondrien vor derH2O2-Behandlung (Baseline) sowie 6 h und 24 h nach derH2O2-Behandlungim Vergleich zu nicht behandelten Kontrollzellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Morphologische KriterienBereichBemerkungen
Fläche (SA)0,5–4 μm2 Diese Kriterien geben Aufschluss über die fragmentierten-länglichen Merkmale der Mitochondrien. Sie entwickeln sich im Allgemeinen in die gleiche Richtung. Fragmentierte Mitochondrien haben eine verringerte Oberfläche, Durchmesser, Länge und Dehnungsfaktor, während Rundheit, Kugelförmigkeit und Breite unverändert oder erhöht sein können.
Durchmesser (D)0,5–1,5 μm
Länge (L)0,5–5 μm
Breite (B)0,5–2 μm
Rundheit (R)0–1
Sphäroizität (S)0–1
Dehnungsfaktor (EF = L/W)1–10

Tabelle 1: Zusammenfassung ausgewählter Parameter für die mitochondriale Morphologie.

Redox-ZustandskriterienBereichBemerkungen
Individuelles Verhältnis (G/R)0–10Das Verhältnis zeigt das Ergebnis des Redoxzustands an. Es informiert über den allgemeinen Zustand und das Alter der Mitochondrien in der Zelle. Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass dieses Verhältnis das Gleichgewicht von Biogenese und Abbau von Mitochondrien und die Spaltung / Fusion von oxidierten Mitochondrien mit reduzierten Mitochondrien ist. Daher kann die Bewertung der Anzahl der grünen und roten Puncta stark helfen, die Ergebnisse zu interpretieren.  Grüne Puncta-Mitochondrien werden bestimmt, wenn die Intensität von Grün 10-mal so hoch ist wie die von Rot. Rote Puncta-Mitochondrien werden bestimmt, wenn die Intensität von Rot 10-mal größer ist als die von Grün. Der Redoxzustand eines Astrozyten ist der Durchschnitt aller Mitochondrienverhältnisse dieser Zelle.
Prozentsatz der grünen Puncta-Mitochondrien(G-Puncta)0%–100%
Prozentsatz der roten Puncta-Mitochondrien (Rpuncta)0%–100%

Tabelle 2: Zusammenfassung ausgewählter Parameter für den mitochondrialen Redoxzustand.

MobilitätskriterienBereichBemerkungen
Verschiebung (Dis)0–10 μmZusammen prägen diese Merkmale die allgemeine Motilitätsdynamik des Netzwerks. Stationäre Mitochondrien zeigen kurze Verschiebungen und Spurlängen mit einer niedrigen Geschwindigkeit an. Auf der anderen Seite können Oszillationspartikel mit einem Unterschied zwischen der Spurlänge und -verschiebung (was zu einer geringen Geradheit führt) und einer erhöhten Geschwindigkeit im Vergleich zu statischen unterschieden werden.
Streckenlänge (Tr)0–10 μm
Geschwindigkeit und Geschwindigkeitsvarianz (Sp und SpV)0–1,5 μm/s ± 0,2 μm/s
Geradheit0–1
(Str = Verdrängung/Spurlänge)

Tabelle 3: Zusammenfassung ausgewählter Parameter für die mitochondriale Mobilität.

Supplemental Coding File 1: GA3-Skriptdatei zur Analyse der individuellen mitochondrialen Morphologie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier wird eine neuartige Methode vorgeschlagen, um die Dynamik und den Umsatz des mitochondrialen Systems in einem kultivierten Astrozyten longitudinal zu verfolgen. Im Gegensatz zu einem Zeitrafferansatz an einer festen Gruppe von Zellen oder einer einzelnen Zelle gleichzeitig (am häufigsten in der Literatur verwendet)24,25, können Forscher die Entwicklung des mitochondrialen Systems während mehrerer Tage auf denselben einzelnen Zellen verfolgen. Im Gegensatz zur Single-Well-Live-Bildgebung, bei der eine hohe Lichtexposition erforderlich ist und die Auswahl vieler einzelner Zellen weniger möglich ist, nutzt die vorgeschlagene Methode die Fähigkeit dieses Mikroskops, mehrere verschiedene Zellen in verschiedenen Bereichen eines Brunnens abzubilden und zu verschiedenen Zeitpunkten zu denselben Zellen zurückzukehren, um sie neu abzubilden. Dank der Normalisierung auf eine Baseline, die für jedes gemessene Kriterium an jeder Zelle von Interesse durchgeführt wird, berücksichtigt es die Komplexität des mitochondrialen Systems und untersucht die Wirkung der Behandlung auf jede Zelle relativ zu ihrem eigenen Baseline-Bild. Die Fähigkeit des Mikroskops, diese Art der Bildgebung autonom an bis zu 16 Vertiefungen gleichzeitig durchzuführen (Abbildung von 5 Zellen pro Vertiefung), ermöglicht es, die Heterogenität des mitochondrialen Systems während der Analyse angemessen zu berücksichtigen, ohne die experimentelle Variabilität, die mit der Abbildung verschiedener Bedingungen an verschiedenen Tagen einhergeht.

Die Qualität der Kulturen, die Konzentration der Virusinfektionen, die den LV-G1-MitoTimer-Biosensor exprimieren, die Art des Mikroskops und der Objektive sowie die Auswahl geeigneter Zellen sind kritische Variablen, die in diesem Protokoll so konsistent wie möglich bleiben müssen. Die Zelldichten, die Art des Vektors und die viralen Titer können je nach Fragestellung angepasst werden. Obwohl frühere Arbeiten gezeigt haben, dass die LV-G1-MitoTimer-Expression keine schädlichen Folgen für die mitochondriale Funktion und Dynamikhat 21,22,26,27, ist es wichtig zu überprüfen, ob die Konzentration für die Zellen nicht toxisch ist (z. B. überprüfung der Gesamtzahl der Zellen in der Kontrolle gut). Da eine einzelne Fokusebene verwendet wird, sollten Astrozyten: (1) so flach wie möglich, (2) von anderen markierten Zellen isoliert sein (um die Analyse im Falle einer Verschiebung in der Schale zu vereinfachen) und (3) hohe Fluoreszenzwerte aufweisen. Da Zellen in Kultur in der Morphologie sehr variabel sein können, kann das mitochondriale System sehr heterogen sein. In diesem Zusammenhang kompensiert die Analyse von ROIs (und nicht der gesamten Zelle) einige problematische Regionen, wie die perinukleären Regionen, und verringert die Variabilität. Es ist wichtig, die Baseline auf relativ ähnlichen Zellen durchzuführen und so viele Zellen wie möglich zu beproben. Daher sind High-Content-Erfassungs- und Analysemikroskope ideal geeignet. Bei diesem Längsschnittmonitoring ist es auch wichtig, die Zellen nicht zu sehr lichtbelichtet zu machen, um eine Bleiche des Biosensors zu vermeiden.

Diese Bildgebungsmethode ist nicht ohne Komplexität, und während des gesamten Protokolls sind mehrere Notizen enthalten, die die Fehlerbehebung bei früheren Tests mit dem Mikroskop berücksichtigen. Zum Beispiel hängt die Wahl der verwendeten Plattenbeschichtung vom beabsichtigten Assay ab, aber Empfehlungen für die am besten geeignete Auswahl für Astrozyten-Primärkulturen wurden enthalten. Darüber hinaus sollte die Bildaufnahme aufgrund der interzellulären Variabilität an mindestens 5 Zellen pro Zustand durchgeführt werden. Genauer gesagt, einige Zellen, die bei der Baseline-Bildgebung ausgewählt werden, sterben ab, einige bewegen sich aus dem Rahmen des zugewiesenen Bildaufnahmebereichs und einige ändern ihre Morphologie, was die Individualisierung der Mitochondrien in der Analyse sehr schwierig macht. Die Abbildung vieler Zellen von Anfang an erhöht die Wahrscheinlichkeit einer ausreichend großen Stichprobengröße von Zellen, die am Ende des Experiments analysiert werden können. Zusätzlich zu den komplexeren Aspekten dieser Bildgebungstechnik gibt es einige absolute Einschränkungen, wer von dieser Art der Bildgebung und Analyse profitieren kann. Um die Vorteile der Automatisierung der Bildaufnahme voll ausschöpfen zu können, muss das verwendete Mikroskop über ein Autofokussystem verfügen, das die Geschwindigkeit der Zeitintervalle zwischen den Bildern (d. H. Alle 3 s in diesem Protokoll) bewältigen und sich konsequent auf die betreffende Zelle konzentrieren kann, bevor jedes Bild aufgenommen wird. Darüber hinaus wird diese Methode ohne die JOBS-Software, die den gesamten Bildaufnahmeprozess automatisiert, mühsam und möglicherweise unmöglich, abhängig von der Anzahl der zellen, die abgebildet werden, da es erforderlich wäre, jede Zelle zum richtigen Zeitpunkt manuell zu finden und abzubilden. Schließlich ist diese bildgebende Methode nicht immun gegen das Problem des Photobleichens. Aus diesem Grund ist es, wie bei jeder Langzeiterfassungsmethode, wichtig, fluoreszierende Marker zu wählen, die weniger anfällig für Photobleiching sind, und die Bildaufnahme so anzupassen, dass dieses Problem so weit wie möglich vermieden wird.

Diese Technik unterscheidet sich von anderen, die derzeit verwendet werden, in entscheidender Weise. Im Gegensatz zu anderen Zeitrafferstudien erfordert diese Technik keine Bildgebung an der gleichen Position im Bohrloch die ganze Zeit, noch erfordert sie eine manuelle Bewegung der Platte, um andere Bereiche abzubilden. Dies ermöglicht es den Forschern, viele Zellen unter vielen Bedingungen in einem Zeitrahmen von 24 Stunden abzubilden. Folglich liefert die Fähigkeit, diese Bildgebung und Analyse an vielen Zellen in jedem Bohrloch durchzuführen, die gleichen Populationsinformationen, die man durch die umfassende Untersuchung einer großen Gruppe von Zellen erhalten würde, während zusätzlich spezifische Messungen von jeder abgebildeten Zelle bereitgestellt werden. Während einige Besonderheiten dieser Methode möglicherweise nicht für andere Bildaufnahmemethoden gelten (siehe oben), überwiegen die Vorteile die Komplikationen bei der Art der Analyse, die nach der Aufnahme möglich ist. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die genauen Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf das mitochondriale System und folglich auf die kultivierten Astrozyten zu sehen.

Darüber hinaus ist diese Methode in hohem Maße an viele verschiedene wissenschaftliche Fragen zum mitochondrialen Verhalten und zu den Rollen in bestimmten Kontexten anpassbar. Hier befasst sich das skizzierte Protokoll speziell mit kultivierten Astrozyten. Es können jedoch viele andere Zelltypen verwendet werden, und die Behandlungen, die getestet werden können, sind nur durch die untersuchten Fragen begrenzt. Diese Art der Bildgebung hat das Potenzial, das kollektive Wissen und Verständnis des mitochondrialen Verhaltens, der zugrunde liegenden Mechanismen, die zu mitochondrialer Dysfunktion führen, und der Auswirkungen vieler Pathologien auf die angeborene Dynamik in verschiedenen Zelltypen zu verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine gegensätzlichen Interessen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Synapsis Foundation unterstützt, das an K.R. und das Universitätsspital Lausanne (CHUV) vergeben wurde. Die Autoren danken Nikon für ihre Hilfe, insbesondere J. Gannevat.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
µ-Slide 8 WellIBIDI80807
19 G NadelPlexus SANTEPL001213
21 G NadelPlexus SANTEPL000142
25 G NadelPlexus SANTEPL000133
Bovin Serum AlbuminLIFE TECH15260037
KameraHAMAMATSUORCA-Blitz4.0 V3 - C13440-20CU
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX(TM)THERMOFISHER61965059
Glutamax SupplementTHERMOFISHER35050061
PferdeserumSIGMA16050122
ObjektivNikon InstrumentsCFI Plan Fluor 100x Öl
Light EnginesLUMENCORSPECTRA X
Linear kodiertes motorisiertes PlatinNikon InstrumentsN/A
MikroskopNikon InstrumentsECLIPSE Ti2-E MIKROSKOP INVERSES
Mikroskop Tischinkubator mit 3-Kanal manuellem Gasmischer und Gasblasen-/FeuchtemodulOKOLABH201-NIKON-TI-S-ER
PBS 1xflüssiger THERMOFISHER20012068
Penicillin-StreptomycinSIGMA15140122
Petrischalen 100 mmSIGMAP5731
Petrischalen 35 mmSIGMACLS430165
Trächtige RattenCHARLES RIVERS3
Software Nikon NIS-HCNikon InstrumentsNIS-Elements HC
Software PrismGraphPadV8.02
Stericup 500 mLMERCK MILLIPORE10412701

Referenzen

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