Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Probenvorbereitungsmethode, die auf Wärmeinaktivierung basiert, um endogene Peptide zu erhalten und den Abbau post mortem zu vermeiden, gefolgt von einer relativen Quantifizierung mittels Isotopenmarkierung plus LC-MS.

Abstract

Peptidomics kann als die qualitative und quantitative Analyse von Peptiden in einer biologischen Probe definiert werden. Zu den Hauptanwendungen gehören die Identifizierung der Peptid-Biomarker für Krankheit oder Umweltstress, die Identifizierung von Neuropeptiden, Hormonen und bioaktiven intrazellulären Peptiden, die Entdeckung antimikrobieller und nutrazeutischer Peptide aus Proteinhydrolysaten und können in Studien verwendet werden, um die proteolytischen Prozesse zu verstehen. Der jüngste Fortschritt in der Probenvorbereitung, Trennmethoden, Massenspektrometrietechniken und Berechnungswerkzeugen im Zusammenhang mit der Proteinsequenzierung hat zur Erhöhung der identifizierten Peptidzahl und der charakterisierten Peptidome beigetragen. Peptidomische Studien analysieren häufig Peptide, die auf natürliche Weise in Zellen erzeugt werden. Hier wird ein Probenvorbereitungsprotokoll beschrieben, das auf Wärmeinaktivierung basiert, das die Proteaseaktivität eliminiert, und die Extraktion unter milden Bedingungen, so dass es keine Spaltung der Peptidbindungen gibt. Darüber hinaus wird auch die relative Quantifizierung von Peptiden mittels stabiler Isotopenmarkierung durch reduktive Methylierung von Aminen gezeigt. Diese Markierungsmethode hat einige Vorteile, da die Reagenzien im Handel erhältlich, im Vergleich zu anderen kostengünstig, chemisch stabil sind und die Analyse von bis zu fünf Proben in einem einzigen LC-MS-Lauf ermöglichen.

Introduction

"Omics" -Wissenschaften zeichnen sich durch die tiefe Analyse eines Molekülsatzes wie DNA, RNA, Proteine, Peptide, Metaboliten usw. aus. Diese generierten groß angelegten Datensätze (Genomik, Transkriptomik, Proteomik, Peptidomik, Metabolomik usw.) haben die Biologie revolutioniert und zu einem fortgeschrittenen Verständnis biologischer Prozesse ^geführt1. Der Begriff Peptidomik wurde im frühen 20^. Jahrhundert eingeführt, und einige Autoren haben ihn als einen Zweig der Proteomik ^bezeichnet2. Die Peptidomik weist jedoch deutliche Besonderheiten auf, wobei das Hauptinteresse darin besteht, den natürlich erzeugte....

Protocol

Das folgende Verfahren zur Peptidextraktion und reduktiven Methylierung wurde aus zuvor veröffentlichten Verfahren angepasst24,25,26,27. Dieses Protokoll folgte den Richtlinien des National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA) und wurde von der Ethikkommission für Tierversuche (CEUA) am Biowissenschaftlichen Institut der Staatlichen Universität Sao Paulo genehmigt. Die Protokollschritte sind in Abbildung 1 dargestellt.

HINWEIS: Bereiten Sie alle wässrigen Lösungen in Re....

Results

Die Ergebnisse der auf dem Massenspektrometer durchgeführten Läufe werden in Rohdatendateien gespeichert, die in der Massenspektrometer-Software geöffnet werden können. In den MS-Spektren ist es möglich, Peakgruppen zu beobachten, die markierte Peptide gemäß dem verwendeten Markierungsschema darstellen, das von 2-5 Markierungen reicht. In Abbildung 2 werden beispielsweise Paare von Peaks, die in einer chromatographischen Zeit detektiert wurden, in einem Experiment dargestellt, bei dem nur zw.......

Discussion

In den meisten Peptidomik-Studien ist einer der kritischen Schritte zweifellos die Probenvorbereitung, die sorgfältig durchgeführt werden sollte, um das Vorhandensein von Peptidfragmenten zu vermeiden, die von Proteasen nach einigen Minuten post mortem erzeugt werden. Die ersten Studien an Gehirnextrakten, die aus nicht in der Mikrowelle hergestellten Proben hergestellt wurden, zeigten eine große Anzahl von Proteinfragmenten, die in den 10-kDa-Mikrofiltraten vorhanden sind. Es wurden verschiedene Ansätze beschrieben^.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Dichtfilter	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa
Aceton	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitril	Sigma-Aldrich	1000291000
Ammoniumbicarbonat	Sigma-Aldrich	11213
Analysesäule (EASY-Säule)	EASY-Säule	(SC200)	10 cm, ID75 & Mikro; m, 3 µ m, C18-A2
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Fluorescamin	Sigma-Aldrich	F9015
Formaldehydlösung	Sigma-Aldrich	252549
Formaldehyd-13C, d2, Lösung	Sigma-Aldrich	596388
Formaldehyd-d2 Lösung	Sigma-Aldrich	492620
Ameisensäure	Sigma-Aldrich	33015
Abzug	Quimis	Q216
Salzsäure - HCl	Sigma-Aldrich	258148
LoBind-Protein Retentionsröhrchen	Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
Mikrowellenherd	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	VERSION 8.5
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Invitrogen	3002	Tabletten
Vorsäule (EASY-Säule)	Thermo Fisher Scientific	(SC001)	2 cm, ID100 & Mikro; m, 5 & micro; m, C18-A1
Kühlzentrifuge	Hermle	Z326K	für konische Röhrchen
Kühlzentrifuge	Vision	VS15000CFNII	für Mikroröhrchen
Umkehrphasen-Reinigungskolonnen    (Oasis HLB 1 cc Kartusche)	Waters	186000383	Oasis HLB 1 cc Kartusche
Natriumcyanoborodeuterid - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
Natriumcyanoborohydrid - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	S9763	HINWEIS: 0,2 M PB = 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,8 (26,85 mL Na2HPO3 1M) plus 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,8 (23,15 mL NaH2PO3 1M) auf 250 ml Wasser
Natriumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	S3139
Sonicator	Qsonica	Q55-110
Standardpeptid	Proteimax		Aminosäuresequenz: LTLRTKL
Triethylammoniumpuffer - TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
Trifluoressigsäure - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
Ultrareines	Wasser Milli-Q	Direct-Q 3UV
Vakuumzentrifuge	GeneVac	MiVac DNA-Konzentrator
Wasserbad	Cientec	266
Xcalibur Software	ThermoFisher Scientific	OPTON-30965