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Methodenartikel

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

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DOI:

10.3791/62974

⸱

8. September 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Verwendung der Einzelmolekül-Bildgebungsmethode DNA Curtains, um den biophysikalischen Mechanismus von EWS-FLI1-Kondensaten zu untersuchen, die sich auf DNA ansammeln.

Zusammenfassung

Die Fusionsgene, die aus der chromosomalen Translokation resultieren, wurden in vielen soliden Tumoren oder Leukämien gefunden. EWS-FLI1, das zur FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie von Fusionsonkoproteinen gehört, ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene beim Ewing-Sarkom. Diese Fusionsproteine der FET-Familie beherbergen typischerweise eine Low-Complexity-Domäne (LCD) des FET-Proteins an ihrem N-Terminus und eine DNA-bindende Domäne (DBD) an ihrem C-Terminus. Es wurde bestätigt, dass EWS-FLI1 aufgrund von LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen biomolekulare Kondensate an seinen Zielbindungsstellen bildet, und diese Kondensate können RNA-Polymerase II rekrutieren, um die Gentranskription zu verbessern. Wie diese Kondensate an ihren Bindungsstellen zusammengesetzt werden, bleibt jedoch unklar. Kürzlich wurde eine Einzelmolekül-Biophysik-Methode - DNA Curtains - angewendet, um diese Montageprozesse von EWS-FLI1-Kondensaten zu visualisieren. Hier werden die detaillierten experimentellen Protokoll- und Datenanalyseansätze für die Anwendung von DNA-Vorhängen bei der Untersuchung der biomolekularen Kondensate diskutiert, die sich auf Ziel-DNA ansammeln.

Einleitung

Die transkriptionelle Regulation ist ein entscheidender Schritt für eine präzise Genexpression in lebenden Zellen. Viele Faktoren, wie chromosomale Modifikation, Transkriptionsfaktoren (TFs) und nicht-kodierende RNAs, sind an diesem komplizierten Prozess beteiligt 1,2,3. Unter diesen Faktoren tragen TFs zur Spezifität der Transkriptionsregulation bei, indem sie spezifische DNA-Sequenzen, die als Promotoren oder Enhancer bekannt sind, erkennen und daran binden und anschließend andere funktionelle Proteine rekrutieren, um die Transkription zu aktivieren oder zu unterdrücken 4,5,6,7. Wie diese TFs es schaffen, nach ihren Zielstellen im menschlichen Genom zu suchen und mit DNA zu interagieren, die mit Histonen und nicht-histon-DNA-bindenden Proteinen beschichtet ist, hat Wissenschaftler seit Jahrzehnten verblüfft. In den letzten Jahren wurden mehrere klassische Modelle für den Zielsuchmechanismus von TFs entwickelt, um zu beschreiben, wie sie entlang derDNA-Kette 8,9,10,11 "gleiten", "hüpfen", "springen" oder "intersegmentieren". Diese Modelle konzentrieren sich auf das Suchverhalten auf der DNA eines einzelnen TF-Moleküls. Neuere Studien zeigen jedoch, dass einige TFs entweder allein im Zellkern oder mit dem Mediator-Komplex12 einer Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) unterzogen werden. Die beobachteten Tröpfchen von TFs sind mit den Promotor- oder Enhancerregionen assoziiert, was die Rolle der biomolekularen Kondensatbildung bei der Transkription und dem dreidimensionalen Genomunterstreicht 13,14,15. Diese biomolekularen Kondensate sind in vivo und in vitro mit membranfehlenden Kompartimenten verbunden. Sie werden über LLPS gebildet, in dem modulare Biomakromoleküle und intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) von Proteinen zwei Hauptantriebskräfte multivalenter Wechselwirkungen sind16. Somit suchen TFs nicht nur DNA, sondern funktionieren auch synergistisch innerhalb dieser Kondensate 4,17,18. Bis heute ist die biophysikalische Eigenschaft dieser Transkriptionskondensate auf DNA unklar.

Daher zielte diese Studie darauf ab, eine Einzelmolekülmethode - DNA-Vorhänge - anzuwenden, um die Bildung und Dynamik der von TFs gebildeten Transkriptionskondensate auf DNA in vitro direkt abzubilden. DNA Curtains, eine Hochdurchsatz-In-vitro-Bildgebungsplattform zur Untersuchung der Interaktion zwischen Proteinen und DNA, wurde bei der DNA-Reparatur 19,20,21, der Zielsuche22 und LLPS 17,23,24 eingesetzt. Die Flusszelle von DNA Curtains ist mit biotinylierten Lipiddoppelschichten beschichtet, um die Oberfläche zu passivieren und die Biomoleküle auf der Oberfläche diffundieren zu lassen. Die nanofabrizierten Zick-Zack-Muster begrenzen die Bewegung der DNA. Biotinylierte Lambda-DNA-Substrate können sich entlang der Barrierekanten ausrichten und durch den orientierten Pufferfluss gedehnt werden. Die gleichen Start- und Endsequenzen aller Moleküle erlauben die Verfolgung des Proteins auf der DNA und beschreiben die Positionsverteilung der Bindungsereignisse25,26. Darüber hinaus trägt die Kombination von DNA-Vorhängen mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) dazu bei, das Hintergrundrauschen zu minimieren und Signale auf Einzelmolekülebene zu detektieren. Daher könnten DNA-Vorhänge eine vielversprechende Methode sein, um die Dynamik der Transkriptionskondensatbildung an DNA-Motiven zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt das Beispiel eines Fusionsonkoproteins der FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie, EWS-FLI1, das durch chromosomale Translokation erzeugt wird. Lambda-DNA mit 25× GGAA - der Bindungssequenz von EWS-FLI127 - wurde als DNA-Substrat in den DNA-Vorhangexperimenten verwendet, um zu beobachten, wie EWS-FLI1-Moleküle LLPS auf DNA durchlaufen. Dieses Manuskript diskutiert das experimentelle Protokoll und die Methoden der Datenanalyse im Detail.

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Protokoll

1. Herstellung der Lipiddoppelschicht-Mastermischung

  1. Glasfläschchen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) und 99% Ethanol spülen und im 60 °C heißen Trockenofen trocknen.
  2. Die Lipid-Mastermischung wird hergestellt, indem 1 g 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 100 mg Polyethylenglykol-umgesetzte (PEGylierte) Lipide (18:1 von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy (polyethylenglycol)-2000] (Ammoniumsalz) (PEG2000 DOPE) und 25 mg biotinylierte Lipide (18:1 von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl) (Natriumsalz) (Biotinyl Cap DOPE)) in 10 ml Chloroform gelöst werden.
  3. Bereiten Sie 1 ml Aliquots der Lipid-Mastermischung pro Durchstechflasche vor und lagern Sie sie bei -20 °C in sauberen Glasfläschchen.
    HINWEIS: Lagern Sie das gelöste Lipid in Durchstechflaschen aus Glas und bedecken Sie die Durchstechflaschenkappe während der Lagerung mit Parafilm.

2. Herstellung der Liposomenlösung

  1. Spülen Sie eine 2 ml Glasdurchstechflasche mit ddH2O und 99% Ethanol ab und trocknen Sie sie gründlich im 60 °C Trockenofen.
  2. Spülen Sie eine 250-μL-Glasspritze mit Chloroform aus und geben Sie dann 200 μL der Lipid-Mastermischung in die trockene Glasdurchstechflasche.
  3. Verwenden Sie eine Stickstoffspritzpistole, um N2 vorsichtig zu fließen, während Sie die Durchstechflasche kontinuierlich in eine Richtung drehen.
    HINWEIS: Das N2 hilft, das Chloroform zu verdampfen, und die verbleibenden Lipide bilden einen dünnen Film an der Wand des Glasfläschchens. Stellen Sie den Stickstoffstrom zunächst sehr sanft ein und erhöhen Sie den Durchfluss, wenn ein weißer Film in der Durchstechflasche erscheint. Schließen Sie diesen Verdampfungsprozess innerhalb von 5 min ab.
  4. Die Durchstechflasche aus Glas wird für 16-24 h bei Raumtemperatur (RT) in einen Vakuumtrockenschrank gegeben, um das Chloroform vollständig von den Lipiden zu entfernen.
  5. 2 ml frischer Lipidpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 100 mM NaCl) in die Glasdurchstechflasche geben und die Lipide bei RT für 2 h auflösen. Wirbeln Sie die Lösung mehrmals aus und geben Sie sie in ein 5 ml Polypropylen-Kulturröhrchen.
  6. Sonicieren Sie die Lipidlösung auf Eis mit einem Mikrospitzen-Ultraschallgerät, um kleine unilamellare Vesikel zu bilden, wobei die folgenden Einstellungen verwendet werden: 6 s ein-12 s aus (20% Amplitude) für 6 Zyklen, dann 6 s ein-6 s aus (30% Amplitude) für 3 Zyklen, schließlich 10 s an (40% Amplitude).
    HINWEIS: Der Temperaturanstieg während der Ultraschallbehandlung kann zum Platzen von Schaum führen und die Liposomen zerstören. Überprüfen Sie daher den Zustand des Schaums und die Temperatur und füllen Sie das Eis häufig auf.
  7. Filtern Sie die Liposomen durch einen 0,22 μm Nylonspritzenfilter, aliquot, und lagern Sie sie bei 4 °C.
    HINWEIS: Da ihre Beweglichkeit bei längerer Lagerung abnimmt, müssen die Liposomen in 2-3 Monaten verwendet oder vor Gebrauch frisch zubereitet werden.

3. Sequenzklonierung und Biotinylierung von Lambda-DNA

  1. Einfügen der Bindungsmotive in Lambda-DNA
    1. Verdauen Sie das Zielfragment mit den Bindungsmotiven und der Lambda-DNA mit NheI und XhoI. Ligieren Sie das Zielfragment mit Lambda-DNA unter Verwendung von T4-Ligase über Nacht bei RT.
    2. Kulturieren Sie E.coli VCS257-Zellen in antibiotikafreiem LB-Medium, bis der OD600 0,6 erreicht. Lagern Sie die Bakterien zur späteren Verwendung bei 4 °C.
    3. Die Ligationslösung 20 min bei 65 °C erhitzen, um die T4-Ligase zu denaturieren.
    4. Den Lambda-Phagenextrakt auftauen, vorsichtig mit dem ligierten Produkt durch Pipettieren mit stumpfen Spitzen mischen und die Mischung bei RT für 2 h inkubieren.
    5. 500 μL SM-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl und 8 mM MgCl2, filtriert durch einen 0,22 μm Filter) und 20 μL Chloroform in die Verpackungsmischung aus Schritt 3.1.4 geben, gut mischen und die Lösung zentrifugieren.
      HINWEIS: Die Aktivität des Verpackungsextrakts kann über längere Zeiträume bei 4 °C gehalten werden.
    6. Das Reaktionsgemisch wird durch Mischen von 10 μL Verpackungsextrakt mit 90 μL SM-Puffer und 100 μL der VCS257-Zellen (aus Schritt 3.1.2) hergestellt und 15 min bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Die Konzentration der Verpackungslösung hängt von der Dichte der Phagenplaques am folgenden Tag ab; Es kann je nach Bedarf verdünnt oder hinzugefügt werden.
    7. Nehmen Sie ~5 ml geschmolzenen oberen Agar (22 g / L NZCYM-Brühe mit 15 g / L Agar) in einem 15 ml Röhrchen. Sobald der obere Agar auf ~42 °C abgekühlt ist, fügen Sie das Reaktionsgemisch (aus Schritt 3.1.6) langsam mit einer stumpfen Pipette hinzu und gießen Sie die Flüssigkeit auf eine antibiotikafreie LB-Agarplatte. Bewahren Sie die Platte über Nacht in einem 37 °C Inkubator auf.
    8. Bestätigen Sie die positiven Plaques unter den transparenten Phagen-Plaques auf der oberen Agarplatte mittels PCR. Die positiven Plaketten werden mit einer Pipette auf eine neue obere Agarplatte übertragen und die Platte über Nacht in einem 37 °C Inkubator aufbewahrt.
    9. 400 μL VCS257-Zellen in 400 μL Puffer mit 10 mMMgCl2 und 10 mM CaCl2 geben, eine Plaque in diese Zellmischung einimpfen und in einem 37 °C-Shaker bei 250 U/min für 15 min inkubieren.
    10. 800 μL dieser Suspension, die die Phagenplaque enthält, zu 200 ml NZCYM-Brühe in einen 2-L-Kolben geben und in einem 37 °C-Shaker bei 125 U/min inkubieren.
    11. Messen Sie OD600 der Bakteriensuspension nach ~4 h Kultivierung. Beachten Sie, dass der OD600-Wert zuerst ansteigt und dann auf einen Tiefpunkt bei ~0,2 fällt. Stoppen Sie die Inkubation, wenn der OD 600-Wert wieder ansteigt, fügen Sie500 μL Chloroform hinzu und schütteln Sie bei 80 U/min für weitere 5 Minuten.
      HINWEIS: Der Anstieg von OD600 nach dem Trog wird schnell auftreten; Daher muss der OD600-Wert häufiger gemessen werden, wenn er auf 0,3 sinkt, um ein übermäßiges VCS257-Zellwachstum in der Kultur zu vermeiden.
    12. Die Phagenkultur in eine 500-ml-Flasche geben, 11,7 g NaCl hinzufügen und die Flasche schütteln. Die Flasche 10 min auf Eis brüten.
    13. Die Suspension wird gleichmäßig in vier 50-ml-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 x g für 10 min.
      HINWEIS: Alle diese Zentrifugationsschritte in Abschnitt 3.1 müssen bei 4 °C durchgeführt werden.
    14. Die Überstände in vier neue 50-ml-Röhrchen überführen und bei gleicher Geschwindigkeit für 5 min erneut zentrifugieren.
    15. Die Überstände auffangen, 10% (w/v) PEG8000-Pulver hinzufügen und bei 4 °C drehen, um 30 min zu inkubieren.
    16. Zentrifugieren Sie die Suspensionen aus Schritt 3.1.15 bei 12.000 x g für 15 min, um die Phagenpellets zu erhalten.
    17. Resuspendieren Sie die Pellets in 1 ml Phagen-Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl und 10 mM MgCl2) in vier Röhrchen und gießen Sie alle 4 mL dieser Mischungen in ein 50-ml-Röhrchen.
    18. RNase A (10 mg/ml) und DNase I (4 mg/ml) zu 20 μg/ml und 5 μg/ml Endkonzentrationen zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren, um überschüssige Nukleinsäuren abzubauen.
    19. 4,5 ml 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 ml 0,5 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,67 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 75 μL Proteinase K (10 mg/ml) in das Röhrchen geben und bei 65 °C 10 min inkubieren.
    20. 4,5 ml vorgekühltes 3 M Kaliumacetat zugeben und 10 min auf Eis inkubieren.
    21. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 10 min und drehen Sie den Überstand für weitere 5 min bei 10.000 x g.
    22. 70 Vol.-% Isopropanol in den gesammelten Überstand (ab Schritt 3.1.21) bei ausreichender Mischung geben, bei RT 2 min inkubieren und dann bei 8.000 x g 10 min zentrifugieren. Verwerfen Sie das Isopropanol und drehen Sie es erneut für 5 min.
      HINWEIS: Das DNA-Pellet wird vor der ersten 10-minütigen Zentrifugation verschmiert; Das Pellet wird nach der zweiten 5-minütigen Zentrifugation am Boden des Röhrchens konzentriert.
    23. Waschen Sie die gefällte DNA mit 2-3 ml 70% Ethanol und drehen Sie sie für 1 min wieder herunter. Trocknen Sie das Pellet bei 4 °C für 2 h und resuspendieren Sie dann die DNA in 500 μL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA) über Nacht bei RT.
    24. Übertragen Sie die DNA in ein 1,5 ml Röhrchen und drehen Sie es mit 18.000 x g für 3 min. Übertragen Sie die DNA in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Aliquot die gereinigte Lambda-DNA und lagern Sie sie bei -20 °C.
  2. Biotin-Lambda DNA-Präparat
    1. 50 μL gereinigte Lambda-DNA mit klonierten Motiven bei 65 °C für 10 min schmelzen.
      HINWEIS: Da Lambda-DNA ~ 48 kbp lang ist, muss sie vor dem Pipettieren erhitzt werden, um DNA-Brüche zu vermeiden.
    2. Mischen Sie 50 μL Lambda-DNA, 1 μL Biotin-Primer (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) und 54 μLddH2Omiteinander. Die Mischung bei 65 °C für 5 min coinkubieren und auf dem Tisch abkühlen lassen.
    3. Fügen Sie 12 μL 10x T4-Ligasepuffer und 3 μL T4-Ligase hinzu und inkubieren Sie bei RT für mehrere Stunden oder über Nacht.
    4. Fügen Sie dem Ligationsprodukt ein gleiches Volumen Phenol-Chloroform (1: 1) -Gemisch hinzu, mischen Sie es sofort gut und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 2 min bei RT.
    5. Die obere wässrige Phase, die die DNA enthält, vorsichtig in ein neues Röhrchen überführen, eine gleiche Menge Chloroform hinzufügen, gut mischen und dann bei 12.000 x g für 2 min zentrifugieren.
    6. Die obere wässrige Phase wird in ein neues Röhrchen überführt, ein gleiches Volumen Isopropanol und 10% des Volumens von 3 M Natriumacetat hinzugefügt und bei RT für 2 min inkubiert. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 12.000 x g für 5 min.
    7. Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet mit 75% Ethanol und zentrifugieren Sie dann bei 12.000 x g für 5 min.
    8. Entfernen Sie das 75% ige Ethanol, trocknen Sie die DNA bei RT für 10 min an der Luft und verwenden Sie 120 μL TE-Puffer, um die DNA aufzulösen.
    9. 60 μL Puffer A (30% (w/v) PEG8000 und 30 mM MgCl 2) zu 120 μL der Lösung aus Schritt3.2.8 zugeben und bei 4 °C für 20-24 h drehen.
    10. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 18.000 g für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
    11. Verwenden Sie 180 μl vorgekühltes 75%iges Ethanol, um das Pellet zu waschen, und wiederholen Sie Schritt 3.2.10.
    12. Trocknen Sie das Pellet bei RT und verwenden Sie 100 μL TE150-Puffer, um die DNA aufzulösen.

4. Nanofabrizierte Zick-Zack-Barrieren

  1. Reinigen Sie Objektträger in Aceton für 20 min durch Ultraschall und geben Sie sie in einen neuen Glasbehälter mit 1 M NaOH zur Beschallung für weitere 20 Minuten. 90 mLH2SO4 mit 30 mLH2O2mischen und die Objektträger 30min in diese Mischung eintauchen. Die Objektträger mit Aceton und Isopropanol abspülen und mitN2 trocknen.
    HINWEIS: Das Mischen vonH2SO4 undH2O2istein exothermer Prozess; Treffen Sie während des Betriebs angemessene Sicherheitsvorkehrungen.
  2. Beschichten Sie den gereinigten Objektträger nacheinander mit Polymethylmethacrylat (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa und der obersten Schicht der leitfähigen Schutzschicht. Verwenden Sie die Elektronenstrahllithographie, um die Zick-Zack-Barrieren zu beschreiben (Abbildung 1A).
  3. Waschen Sie die Objektträger mitddH2O, um die leitfähige Schutzschicht zu entfernen, und trocknen Sie die Objektträger mit N2.
  4. Scheiden Sie eine 30 nm große Schicht Chrom (Cr) mit einer Magnetron-Sputtermaschine ab und entfernen Sie die restlichen PMMA-Schichten mit Aceton.
    HINWEIS: Eine Flusszelle kann für mehr als 20 DNA-Vorhangexperimente wiederverwendet werden. Um die Flusszelle wiederzuverwenden, waschen Sie sie mit Ethanol, Reinigungsmittel und NaOH.

5. Reinigung des EWS-FLI1-Proteins

HINWEIS: Die Beobachtung von 500 nM EWS-FLI1 auf Lambda-DNA mit 25× GGAA-Motiven dient als gutes Beispiel für die Anwendung von DNA-Vorhängen zur Kondensatbildung. EWS-FLI1 ist ein Fusionsprotein, das das N-Terminal von EWSR1 (1-265) und das C-Terminal von FLI1 (220-453) kombiniert. Ein mCherry-Tag wurde zur Visualisierung mit dem N-Terminal des EWS-FLI1-Fusionsproteins verschmolzen.

  1. Klonen Sie das EWS-FLI1-Gen in einen rekonstituierten pRSF-Vektor oder einen anderen geeigneten Prokaryoten-Expressionsvektor.
  2. Umwandlung des Plasmids, das für 7x His-mCherry-EWSFLI1 kodiert, in den E.coli BL21(DE3)-Stamm; Wachsen Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml LB-Medium bei 37 °C über Nacht. Wenn der OD600-Wert nach dem Transfer auf 2 L LB-Medium 0,6-0,8 erreicht, fügen Sie 0,5 mM IPTG hinzu und schütteln Sie die Zellkultur bei 18 °C für 16-18 h.
  3. Zentrifugieren Sie die Kultur, um den Überstand zu entfernen, und resuspendieren Sie die Zellen mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M Harnstoff; 10 mM Imidazol; 1,5 mM Beta-Mercaptoethanol (β-ME); und 5% Glycerin).
  4. Nach Beschallung und Zentrifugation bei 18000 × g für ~30 min den Überstand auf Ni-NTA-Harz laden, das in einem 5-fachen Volumen Lysepuffer ausgeglichen ist, und dann das Harz mit einem 10-fachen Volumen Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M Harnstoff, 40 mM Imidazol, 1,5 mM β-ME und 5% Glycerin) waschen.
  5. Eluieren Sie das gebundene Protein mit 15 mL Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M Harnstoff, 500 mM Imidazol, 1,5 mM β-ME und 5% Glycerin) und konzentrieren Sie die Elution auf ~500 μL.
  6. Laden Sie die konzentrierte Proteinlösung auf eine Gelfiltrationssäule und analysieren Sie die Produkte durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Das gereinigte Protein schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.

6. Vorbereitung einer DNA-Vorhang-Flusszelle

  1. Bereiten Sie eine Flusszelle mit nanofazierten Zick-Zack-Barrieren für ein DNA-Vorhangexperiment vor und bestimmen Sie die Fließrichtung. Verbinden Sie dazu die Ein- und Ausgangsröhren in die richtige Richtung.
  2. Waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 ml Lipidpuffer mit zwei 3-ml-Spritzen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blase in der Durchflusszelle befindet.
  3. Nehmen Sie die Spritze aus dem Ausgang und injizieren Sie 1 ml der Liposomenlösung (40 μL Liposomenschaft aus Abschnitt 2 und 960 μL Lipidpuffer) dreimal mit 5 min Inkubation nach jeder Injektion.
  4. Für den Heilungsschritt waschen Sie die Flusszelle langsam mit 2,5 ml Lipidpuffer und inkubieren Sie bei RT für 30 min.
    HINWEIS: Die Heilungszeit kann bei Bedarf länger sein; Wenn Blasen auftreten, führen Sie eine doppelte Heilung durch, indem Sie die Schritte 5.3 und 5.4 wiederholen, um die Blasen zu entfernen.
  5. 30 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Puffer (40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol und0,5 mg/ml BSA zur Oberflächenpassivierung). Nach 30 Minuten Heilung waschen Sie die Flusszelle mit 2,5 ml BSA-Puffer von der Ausgangsseite.
    HINWEIS: Die BSA-Brühe ist eine 20 mg/ml Lösung, die bei 4 °C gelagert wird und innerhalb von 1-2 Wochen verbraucht werden muss. Die BSA-Konzentration im Puffer kann je nach Oberflächenbeschaffenheit eingestellt werden.
  6. Injizieren Sie 800 μL Streptavidinpuffer (10 μL eines 1 mg/ml Streptavidin-Vorrats, 790 μL BSA-Puffer) von der Eingangsseite in zwei Schritten mit 10 Minuten Inkubation nach jedem Schritt.
    HINWEIS: Das Streptavidin verankert die DNA aufgrund seiner Multivalenz an den Lipiden, indem es eine Brücke zwischen den biotinylierten Lipiden und der biotinylierten DNA schlägt.
  7. Waschen Sie die Flusszelle mit 2,5 ml BSA-Puffer, um alle freien Streptavidinmoleküle zu entfernen.
  8. Die Biotin-Lambda-DNA wird mit klonierten Motiven aus Abschnitt 3 unter Verwendung eines BSA-Puffers (2,5 μL DNA und 998 μL BSA-Puffer) verdünnt. Injizieren Sie Lambda-DNA 4-mal langsam in Abständen von 5 Minuten.
  9. Schalten Sie während der Injektion das Mikroskop und das wissenschaftliche Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS)-System ein. Waschen Sie den Schlauch mit 10 mL ddH2O. Spülen Sie das Prisma und den Schlauchanschluss mit Wasser, 2% flüssigem Küvettenreiniger und 99% Ethanol ab. Bereiten Sie den Bildgebungspuffer vor, indem Sie KCl und doppelsträngigen DNA-Farbstoff in den BSA-Puffer geben, um Endkonzentrationen von 150 mM bzw. 0,5 nM zu erhalten, und nehmen Sie mindestens 20 ml des Bildgebungspuffers in eine 30-ml-Spritze auf.
  10. Stellen Sie die Flusszelle auf dem Mikroskoptisch auf und verbinden Sie sie mit dem mikrofluidischen System.
  11. Verwenden Sie eine Flussrate von 0,03 ml / min, um die DNA-Moleküle für 10 Minuten zur Barriere zu spülen, inkubieren Sie für 30 Minuten bei gestopptem Fluss und schalten Sie sie dann aus, um die DNA seitlich diffundieren zu lassen.
    HINWEIS: Der Zweck dieser 30-minütigen Inkubation besteht darin, das DNA-Molekül durch einfache Diffusion gleichmäßiger vor der Barriere verteilen zu lassen, da DNA-Moleküle dazu neigen, sich auf der Seite der Barriere anzusammeln, die zum Eingang geschlossen ist, wo sie eingespült werden. Die Inkubationszeit kann bei Bedarf angepasst werden.

7. Bildgebung der EWS-FLI1-Kondensationsbildung auf DNA-Vorhängen

  1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, suchen und markieren Sie die Positionen der 3 × 3 Zick-Zack-Muster unter Hellfeld.
  2. Schalten Sie den Fluss bei 0,2 ml / min ein, um die DNA mit dem doppelsträngigen DNA-Farbstoff für 10 min zu färben.
  3. Verdünnen Sie mCherry-EWS-FLI1 mit dem Bildpuffer auf die Konzentration von 100 nM in 100 μL im Röhrchen.
  4. Laden Sie die Proteinprobe mit einer 100-μL-Glasspritze durch das Ventil und ändern Sie die Durchflussrate auf 0,4 ml/min.
  5. Schalten Sie den 488-nm-Laser ein und scannen Sie jede Region vor, um den DNA-Verteilungszustand zu überprüfen. Wählen Sie die Region aus, in der sich die DNA-Moleküle gleichmäßig verteilen. Stellen Sie die Laserleistung auf 10 % für den 488 nm Laser und 20 % für den 561 nm Laser ein. Verwenden Sie den Leistungsmesser, um die tatsächliche Laserleistung in der Nähe des Prismas zu messen: 4,5 mW für den 488-nm-Laser und 16,0 mW für den 561-nm-Laser.
  6. Bildaufnahme
    1. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern in Abständen von 2 s mit 488-nm- und 561-nm-Lasern gleichzeitig.
    2. Ändern Sie das Ventil vom manuellen in den Injektionsmodus, damit der Bildgebungspuffer die Proteinprobe nach 60 s in die Durchflusszelle spülen kann.
      HINWEIS: Dieser Prozess dauert ~30 s, und das Sichtfeld wird mit mCherry-Signalen bedeckt, sobald die EWS-FLI1-Proteine die Flusszelle erreichen.
    3. Um das freie EWS-FLI1 zu entfernen, waschen Sie die Flusszelle 5 Minuten lang mit dem Bildpuffer, wobei nur der 561-nm-Laser eingeschaltet ist. Stoppen Sie den Fluss und inkubieren Sie ihn bei 37 °C für 10 min.
    4. Schalten Sie den Durchfluss bei 0,4 ml / min ein, um die DNA ausdehnen zu lassen, und nehmen Sie Bilder in Abständen von 2 s zwischen verschiedenen Frames auf, um Hochdurchsatzdaten der EWS-FLI1-Kondensatbildung zu erhalten.

8. Intensitätsanalyse für mCherry-EWS-FLI1

  1. Importieren Sie die Daten als Bildsequenzen in die ImageJ-Software, wählen Sie den Puncta an 25× GGAA-Standorten in einem Quadrat von 8× 8 Pixeln aus und speichern Sie das Bild in .tif Format.
  2. Berechnen Sie die Intensität als Summation der Intensität im 8×8-Pixel-Quadrat, einschließlich der gesamten Puncta, und entfernen Sie den Hintergrund, indem Sie die Intensität des Hintergrunds in einem Bereich gleicher Größe in der Nähe des 8 x 8-Pixel-Quadrats subtrahieren.

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Ergebnisse

Das Schema der DNA-Vorhänge ist in Abbildung 1A, Abbildung 1B und Abbildung 1D dargestellt. Die klonierte Zielsequenz mit 25 ununterbrochenen Wiederholungen von GGAA befindet sich im NORB1-Promotor des Ewing-Sarkoms. Diese Zielsequenz ist entscheidend für die EWS-FLI1-Rekrutierung28. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-nm-La...

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Diskussion

Da Einzelmolekülansätze extrem empfindlich auf den Inhalt des Reaktionssystems reagieren, müssen zusätzliche Anstrengungen unternommen werden, um eine gute Qualität aller Materialien und Lösungen während der DNA-Vorhangexperimente zu gewährleisten, insbesondere der in den Abschnitten 1 und 2 hergestellten Lipide und der in Abschnitt 5 verwendeten Puffer. Zur Herstellung von Puffern müssen Reagenzien höherer Reinheit verwendet werden, und Puffer müssen frisch für den Einzelmolekültest vorbereitet werden.

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
488 nm diodengepumpter FestkörperlaserCoherentOBIS488LS
diodengepumpter Festkörperlaser 561 nmCoherentOBIS561LS
AgarRhawnR003215-50g
biotinyliertes DOPEAvanti870273P
RinderserumalbuminSigmaA7030
ChloroformAmresco1595C027
Beschichtung Electra 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02Die leitfähige Schutzbeschichtung
Desoxyribonuklease I RindSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti850375P
DTTSigmaD9779
DeckglasFisher Scientific12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S
Lambda Packung ExtrakteEpizentrumMP5120
MgCl2SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
NheI-HFNEBR3131S
Nikon Inverses MikroskopNikonEclipse Ti
NZCYM BouillonSigmaN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000Amresco25322-68-3
PMMA 200K, ETHYLLACTAT 4%Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOL 2%Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS KameraPHOTOMETRICSPrime95B
Proteinase KNEBP8107S
Quarzglas ObjektträgerG.Finkenbeiner
Sechs-Wege-InjektionsventilIdexMXP9900-000
StreptavidinThermoS888Verdünnt mit ddH2
O SpritzenpumpeHarvard ApparatusPump11 Elite
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Tris baseSigmaT6066
XhoINEBR0146V
YOYO-1 Iodid (491/509)InvitrogenY3601Verdünnt mit DMSO

Referenzen

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).

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