Hier beschreiben wir die Verwendung der Einzelmolekül-Bildgebungsmethode DNA Curtains, um den biophysikalischen Mechanismus von EWS-FLI1-Kondensaten zu untersuchen, die sich auf DNA ansammeln.
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Methodenartikel
Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fusionsgene, die aus der chromosomalen Translokation resultieren, wurden in vielen soliden Tumoren oder Leukämien gefunden. EWS-FLI1, das zur FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie von Fusionsonkoproteinen gehört, ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene beim Ewing-Sarkom. Diese Fusionsproteine der FET-Familie beherbergen typischerweise eine Low-Complexity-Domäne (LCD) des FET-Proteins an ihrem N-Terminus und eine DNA-bindende Domäne (DBD) an ihrem C-Terminus. Es wurde bestätigt, dass EWS-FLI1 aufgrund von LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen biomolekulare Kondensate an seinen Zielbindungsstellen bildet, und diese Kondensate können RNA-Polymerase II rekrutieren, um die Gentranskription zu verbessern. Wie diese Kondensate an ihren Bindungsstellen zusammengesetzt werden, bleibt jedoch unklar. Kürzlich wurde eine Einzelmolekül-Biophysik-Methode - DNA Curtains - angewendet, um diese Montageprozesse von EWS-FLI1-Kondensaten zu visualisieren. Hier werden die detaillierten experimentellen Protokoll- und Datenanalyseansätze für die Anwendung von DNA-Vorhängen bei der Untersuchung der biomolekularen Kondensate diskutiert, die sich auf Ziel-DNA ansammeln.
Einleitung
Die transkriptionelle Regulation ist ein entscheidender Schritt für eine präzise Genexpression in lebenden Zellen. Viele Faktoren, wie chromosomale Modifikation, Transkriptionsfaktoren (TFs) und nicht-kodierende RNAs, sind an diesem komplizierten Prozess beteiligt 1,2,3. Unter diesen Faktoren tragen TFs zur Spezifität der Transkriptionsregulation bei, indem sie spezifische DNA-Sequenzen, die als Promotoren oder Enhancer bekannt sind, erkennen und daran binden und anschließend andere funktionelle Proteine rekrutieren, um die Transkription zu aktivieren ....
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Protokoll
1. Herstellung der Lipiddoppelschicht-Mastermischung
- Glasfläschchen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) und 99% Ethanol spülen und im 60 °C heißen Trockenofen trocknen.
- Die Lipid-Mastermischung wird hergestellt, indem 1 g 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 100 mg Polyethylenglykol-umgesetzte (PEGylierte) Lipide (18:1 von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy (polyethylenglycol)-2000] (Ammoniumsalz) (PEG2000 DOPE) und 25 mg biotinylierte Lipide (18:1 von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl) (Natriumsalz) (Biotinyl Cap DOPE)) in 10 ml Chloroform gelöst werden.
- Bereiten ....
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Ergebnisse
Das Schema der DNA-Vorhänge ist in Abbildung 1A, Abbildung 1B und Abbildung 1D dargestellt. Die klonierte Zielsequenz mit 25 ununterbrochenen Wiederholungen von GGAA befindet sich im NORB1-Promotor des Ewing-Sarkoms. Diese Zielsequenz ist entscheidend für die EWS-FLI1-Rekrutierung28. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-nm-La.......
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Diskussion
Da Einzelmolekülansätze extrem empfindlich auf den Inhalt des Reaktionssystems reagieren, müssen zusätzliche Anstrengungen unternommen werden, um eine gute Qualität aller Materialien und Lösungen während der DNA-Vorhangexperimente zu gewährleisten, insbesondere der in den Abschnitten 1 und 2 hergestellten Lipide und der in Abschnitt 5 verwendeten Puffer. Zur Herstellung von Puffern müssen Reagenzien höherer Reinheit verwendet werden, und Puffer müssen frisch für den Einzelmolekültest vorbereitet werden.
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 488 nm diodengepumpter Festkörperlaser | Coherent | OBIS488LS | |
| diodengepumpter Festkörperlaser 561 nm | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinyliertes DOPE | Avanti | 870273P | |
| Rinderserumalbumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Beschichtung Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | Die leitfähige Schutzbeschichtung |
| Desoxyribonuklease I Rind | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Deckglas | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packung Extrakte | Epizentrum | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverses Mikroskop | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Bouillon | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYLLACTAT 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOL 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS Kamera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Quarzglas Objektträger | G.Finkenbeiner | ||
| Sechs-Wege-Injektionsventil | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Verdünnt mit ddH2 |
| O Spritzenpumpe | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodid (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Verdünnt mit DMSO |
Referenzen
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histon....
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Nachdrucke und Genehmigungen
