Die ausgewachsene Mückenspeicheldrüse (SG) ist für die Übertragung aller durch Mücken übertragenen Krankheitserreger auf ihre menschlichen Wirte, einschließlich Viren und Parasiten, erforderlich. Dieses Video zeigt die effiziente Isolierung der SGs von den Larven (L4) Anopheles gambiae-Mücken und die Vorbereitung der L4-SGs für die weitere Analyse.
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Methodenartikel
Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mückenspeicheldrüsen (SGs) sind ein notwendiges Einstiegsorgan für die Übertragung von durch Insekten übertragenen Krankheitserregern. Krankheitserreger, einschließlich Viren und die Plasmodium-Parasiten, die Malaria verursachen, sammeln sich in den sekretorischen Hohlräumen von SG-Zellen an. Hier sind sie bereit für die Übertragung auf ihre Wirbeltierwirte während einer anschließenden Blutmahlzeit. Da sich erwachsene Drüsen als Eine Ausarbeitung von Larven-SG-Gang-Knospenresten bilden, die über die frühe pupale SG-Histolyse hinaus bestehen bleiben, ist die Larven-SG ein ideales Ziel für Interventionen, die die Krankheitsübertragung begrenzen. Das Verständnis der Larven-SG-Entwicklung kann dazu beitragen, ein besseres Verständnis ihrer Morphologie und funktionellen Anpassungen zu entwickeln und bei der Bewertung neuer Interventionen zu helfen, die auf dieses Organ abzielen. Dieses Videoprotokoll demonstriert eine effiziente Technik zur Isolierung, Fixierung und Färbung von Larven-SGs von Anopheles gambiae-Mücken. Drüsen, die von Larven in einer 25% igen Ethanollösung seziert werden, werden in einem Methanol-Eisessig-Gemisch fixiert, gefolgt von einer kalten Acetonwäsche. Nach einigen Spülungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) können SGs mit einer breiten Palette von Markerfarbstoffen und/oder Antiseren gegen SG-exprimierte Proteine gefärbt werden. Diese Methode zur Larven-SG-Isolierung könnte auch verwendet werden, um Gewebe für die In-situ-Hybridisierungsanalyse, andere transkriptomische Anwendungen und Proteomstudien zu sammeln.
Einleitung
Malaria ist eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, die im Jahr 2019 fast 230 Millionen Infektionen und schätzungsweise 409.000 Todesfälle verursacht1. Die meisten Todesfälle sind in Subsahara-Afrika und werden durch den Parasiten Plasmodium falciparumverursacht, dessen Insektenvektor Anopheles gambiaeist, der Gegenstand dieser Videodemonstration ist. Obwohl die Zahlen auf einen signifikanten Rückgang der jährlichen Sterberate seit der Jahrhundertwende hindeuten (>300.000 weniger jährliche Todesfälle), nehmen die vielversprechenden Rückgänge der Krankheitsraten, die von 2000 bis 2015 beobachtet wurden, ab, was auf die Notwendigkeit neuer Ansätze zur Begrenzung der Krankheitsübertragung hindeutet2. Zu den vielversprechenden zusätzlichen Strategien zur Kontrolle und möglichen Eliminierung von Malaria gehört das Targeting der Mückenvektorkapazität mittels CRISPR/Cas9-basierter Gen-Editing und Gene-Drive3,4,5. Tatsächlich ist es das Targeting des Mückenvektors (durch den erweiterten Einsatz von langlebigen, mit Insektiziden behandelten Moskitonetzen), das den größten Einfluss auf die Verringerung der Krankheitsübertragung hatte6.
Weibliche Moskitos erwerben Plasmodium-Gametozyten von einem infizierten Menschen während einer Blutmahlzeit. Nach Befruchtung, Reifung, Mitteldarmepithel-Traversal, Populationsexpansion und Hämocoel-Navigation in ihren obligaten Mückenwirten dringen Hunderte bis Zehntausende von Plasmodium-Sporozoiten in die Mücken-SGs ein und füllen die sekretorischen Hohlräume der konstituierenden sekretorischen Zellen. In den sekretorischen Hohlräumen angekommen, haben die Parasiten direkten Zugang zum Speichelgang und sind somit bereit für die Übertragung auf einen neuen Wirbeltierwirt bei der nächsten Blutmahlzeit. Da SGs für die Übertragung von Malaria verursachenden Sporozoiten auf ihre menschlichen Wirte von entscheidender Bedeutung sind und Laborstudien darauf hindeuten, dass SGs für die Bluternährung, das Überleben von Moskitos oder die Fruchtbarkeit nicht wesentlich sind7,8,9, stellen sie ein ideales Ziel für übertragungsblockierende Maßnahmen dar. Adulte Mücken-SGs bilden sich als Eine Ausarbeitung von "Gangknospen" -Überresten in den Larven-SGs, die über die frühe pupale SG-Histolyse10hinaus bestehen bleiben, was die Larven-SG zu einem idealen Ziel für Interventionen zur Begrenzung der Krankheitsübertragung im Erwachsenenstadium macht.
Die Charakterisierung des Larvenstadiums der SG-Entwicklung kann nicht nur dazu beitragen, ein besseres Verständnis seiner Morphologie und funktionellen Anpassungen zu entwickeln, sondern auch bei der Bewertung neuer Interventionen helfen, die auf dieses Organ abzielen, durch Gen-Editing von wichtigen SG-Regulatoren. Da alle früheren Studien zur Larven-Speicheldrüsenarchitektur älter sind als Immunfärbung und moderne bildgebende Verfahren10,11, haben wir ein Protokoll zur Isolierung und Färbung von Speicheldrüsen mit einer Vielzahl von Antikörpern und Zellmarkern entwickelt12. Dieses Video demonstriert diesen Ansatz zur Extraktion, Fixierung und Färbung von Larven-SGs aus Anopheles gambiae L4-Larven für die konfokale Bildgebung.
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Protokoll
1. Vorbereitung von Lösungen und Tools
- Herstellung der Dissektionslösung
- Zur Herstellung der Sezierlösung werden 2,5 ml 100% iges Ethanol zu 7,5 ml destilliertemH2Oin einem 15-jährigen Kunststoffröhrchen gegeben. Drehen Sie die Tube 3 mal um, um zu mischen.
HINWEIS: Diese Lösung kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Zur Herstellung der Sezierlösung werden 2,5 ml 100% iges Ethanol zu 7,5 ml destilliertemH2Oin einem 15-jährigen Kunststoffröhrchen gegeben. Drehen Sie die Tube 3 mal um, um zu mischen.
- Herstellung von 10x phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmaterial (PBS)
- Zur Herstellung von 10x PBS-Brühe werden 17,8 gNa2HPO4•2H 2O, 2,4 gKH2PO4,80 g NaCl und 2 g KCl auf 800 ml entionisiertes Wasser gegeben. Mit einem Rührstab auf einer Rührplatte vermischen, bis sich die Feststoffe vollständig aufgelöst haben. Stellen Sie das Endvolumen mit gereinigtem Wasser auf 1 L ein.
HINWEIS: Diese Lösung kann mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Zur Herstellung von 10x PBS-Brühe werden 17,8 gNa2HPO4•2H 2O, 2,4 gKH2PO4,80 g NaCl und 2 g KCl auf 800 ml entionisiertes Wasser gegeben. Mit einem Rührstab auf einer Rührplatte vermischen, bis sich die Feststoffe vollständig aufgelöst haben. Stellen Sie das Endvolumen mit gereinigtem Wasser auf 1 L ein.
- Vorbereitung von 1x PBS
- 10 mL 10x PBS zu 90 mLH2Oin eine sterile Glasflasche geben. Schließen Sie den Deckel fest und wenden Sie 3x zum Mischen um.
HINWEIS: Die Lösung kann mehrere Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- 10 mL 10x PBS zu 90 mLH2Oin eine sterile Glasflasche geben. Schließen Sie den Deckel fest und wenden Sie 3x zum Mischen um.
- Vorbereitung von Fixiermitteln.
- Fügen Sie 600 μL Methanol zu 200 μL Eisessig hinzu. Machen Sie die Lösung jedes Mal frisch.
- Aufbau einer Spachtelplatte (eine mit Silikonkautschuk gefüllte Gewebekulturschale)
- Mischen Sie die Komponenten (1:50) von Epoxidharz (1 g) und Wasser (50 ml) und gießen Sie die Mischung in eine Petrischale. Warten Sie, bis die Komponenten getrocknet sind, bevor Sie sie verwenden.
HINWEIS: Einmal konstruiert, kann die Spachtelplatte jahrelang verwendet werden.
- Mischen Sie die Komponenten (1:50) von Epoxidharz (1 g) und Wasser (50 ml) und gießen Sie die Mischung in eine Petrischale. Warten Sie, bis die Komponenten getrocknet sind, bevor Sie sie verwenden.
2. Drüsendissektion (Abbildung 1A)
- Sammeln Sie L4-Larven im Spätstadium (~ 10 Tage nach dem Schlüpfen; Abbildung 2) von Zuführschalen mit einer Kunststoff-Transferpipette.
HINWEIS: Siehe dieses hilfreiche Online-Handbuch für Standard-Mückenhaltung und Larvenkultur13.- Legen Sie eine Spachtelplatte auf die Bühne eines Seziermikroskops und übertragen Sie die Larven auf die Spachtelplatte.
HINWEIS: Beim Aliquotieren von Larven für die anfängliche Dissektion ist es hilfreich, ~ 10 Larven gleichzeitig mit einer Kunststoff-Transferpipette auf den Objektträger zu übertragen.
- Legen Sie eine Spachtelplatte auf die Bühne eines Seziermikroskops und übertragen Sie die Larven auf die Spachtelplatte.
- Geben Sie einen Tropfen Dissektionslösung (1:3 EtOH:H2 O) auf die Kittplatte, getrennt von den 10 Larven.
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette oder Einweg-Glaspipette, um eine L4-Larve in den 25% igen EtOH-Tropfen zu legen.
- Nehmen Sie eine Pinzette (# 5), eine in jeder Hand, und greifen Sie mit der nicht dominanten Hand den Kopf der Larve. Mit der dominanten Hand greifen Sie die Larve mit einer Pinzette direkt unter dem Kopf und ziehen Sie vorsichtig mit minimaler konstanter Kraft, so dass sich der Kopf vom Rest des Körpers löst und die Drüsen am Kopf befestigt bleiben. Verwerfen Sie den Körperteil des Larvenkadavers.
HINWEIS: Stellen Sie beim Sezieren ein Papiertuch in die Nähe, um die Larvenkadaver zu sammeln. - Sammeln Sie den Kopf / die Drüsen in 1 ml 1x PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 1 ml PBS für ~ 40 sezierte Drüsen mit ihren angehängten Köpfen. Warten Sie, bis die Köpfe/SGs auf den Boden des Puffers sinken.
3. Fixierung auf Antikörperfärbung (Abbildung 1B)
- Lassen Sie das PBS von der Oberseite des Mikrozentrifugenröhrchens mit einer Glastransferpipette abtropfen, vermeiden Sie das klebrige Mückengewebe und entfernen Sie so viel PBS-Lösung wie möglich, ohne das Gewebe zu beschädigen. Ersetzen Sie die Lösung durch 800 μL eines 3:1-Gemisches von Methanol zu Eisessig. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht auf 4 °C (12-24 h empfohlen; 19 h bevorzugt).
- Am nächsten Tag die Lösung abtropfen lassen und durch 1 ml kaltes 100% Aceton ersetzen. Lassen Sie für 90 s.
- Entfernen Sie das Aceton und spülen Sie das Gewebe dreimal vorsichtig mit jeweils 1 ml 1x PBS ab.
HINWEIS: Die Proben sollten langsam mit der Strömung nach oben schweben und dann bis zum Abschluss jeder PBS-Zugabe auf den Boden des Rohres zurückfallen.
4. Immunfärbung (Abbildung 1B)
- Primärantikörper (z. B. Rab11) in der entsprechenden Verdünnung (1:100) in 200 μL des Gesamtvolumens von 1x PBS zugeben. Den Röhrcheninhalt vorsichtig mit einer Pipettenspitze schwenken. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal mit 1 ml 1x PBS (vorsichtiges Pipettieren der Lösung in und aus der Pipette).
- Sekundärer Antikörper (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) in der entsprechenden Verdünnung (1:200) in 200 μL Gesamtvolumen zugeben. Den Röhrcheninhalt vorsichtig mit einer Pipettenspitze schwenken. Bei Raumtemperatur 90 Min. inkubieren.
- Fügen Sie Farbstoffe wie Nilrot (Lipide, 5 μL von 1 μg / μL) und / oder Hoechst (DNA, 3 μL von 1 μg / μL) in 200 μL PBS in diesem Stadium hinzu. Bei Raumtemperatur für weitere 60 Min. inkubieren. Dreimal vorsichtig mit 1x PBS waschen.
5. Befestigung gefärbter Drüsen für die Mikroskopie (Abbildung 1C)
- 200 μL 100% Glycerin auf einen Objektträger pipettieren.
HINWEIS: Da Glycerin viskos ist, lassen Sie die Pipettenspitze in der Flüssigkeit, bis sie das entsprechende Volumen erreicht hat. Es wurde keine Gewebeschrumpfung beobachtet, wenn man direkt in 100% Glycerin ging. Forscher können jedoch 30% und 50% Glycerinwäschen in den Röhrchen durchlaufen, bevor sie die Proben in 100% Glycerin bewegen. - Übertragen Sie die gefärbten Köpfe (bis zu 20 pro Objektträger) mit den angebrachten Drüsen (zusammen mit anderen inneren Strukturen) mit einem weichen Pinsel auf den Objektträger (Abbildung 3A). Verteilen Sie die Proben so, dass sie gleichmäßig entlang des Glasobjektträgers verteilt sind.
HINWEIS: Beim Ablegen von Verschraubungen auf einem Abdeckschlitten mit einer Bürste können die SGs mit einer Pinzette sanft ausgerichtet werden, so dass sie alle in die gleiche Richtung ausgerichtet sind. - Wenn Sie unter einem Seziermikroskop den Larvenkopf mit zwei Zangenpaaren von den Drüsen trennen und die beiden Gewebe vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
HINWEIS: Da es schwierig ist, die SGs vollständig zu isolieren, entfernen Sie einfach die Köpfe und lassen Sie die SGs und die zugehörigen internen Strukturen zurück. Auch wenn die SGs mit anderen Geweben assoziiert bleiben, sind sie leicht zu erkennen, wenn sie mit Hoechst und anderen Markern angefärbt werden (Abbildung 3B, C). - Entfernen und entsorgen Sie die Köpfe und wiederholen Sie den Trennvorgang für jedes SG.
HINWEIS: Wenn Sie Köpfe entfernen, stellen Sie ein Papiertuch in die Nähe, um sie zu sammeln. - Legen Sie vorsichtig einen 1,5 mm dicken Deckglas auf die Oberseite (Luftblasen vermeiden) und verschließen Sie ihn mit klarem Nagellack.
- Bei 4 °C in einem lichtdichten Behälter aufbewahren.
HINWEIS: Vorbereitete Objektträger aus gefärbten Drüsen können bis zu sechs Monate bis zu einem Jahr bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt werden, ohne dass es zu nennenswerten Qualitätsänderungen kommt. Wenn Glycerin im Laufe der Monate zu lecken beginnt, heben Sie den Deckstab vorsichtig an und pipettieren Sie mehr Glycerin, um Löcher zu füllen.
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Ergebnisse
Speicheldrüsen sind relativ einfach von allen Larven des Stadiums 4 zu sezieren. Männliche und weibliche Larven können im späten L4-Larvenstadium durch einen roten Streifen entlang des dorsalen Thorax von Weibchen, nicht aber von Männchen unterschieden werden (Abbildung 2). Wir beobachten auch, dass die Antennenmorphologie bei männlichen L4-Larven viel ausgefeilter ist als bei weiblichen L4-Larven (Abbildung 2), ähnlich den Unterschieden, die in dieser Struktur ...
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Diskussion
Das hierin beschriebene Protokoll wurde aus einem Drosophila SG-Dissektionsprotokoll und einem adulten Mückendissektionsprotokoll14,15,16angepasst. Die meisten Marker drangen jedoch nicht in die Basalmembran ein (Daten nicht gezeigt), wenn die Adult-Dissektions- und SG-Färbemethoden verwendet wurden. Zu den Anpassungen des Erwachsenenprotokolls gehörten das Sezieren der Drüsen in einer 25% igen EtOH-Lösung, das Waschen der Drüse...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken dem Johns Hopkins Malaria Research Institute für den Zugang zu und die Aufzucht von An. gambiae-Larven.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Aceton | Millipore Sigma | 179124 | |
| Pinsel mit weichen Borsten | Amazon (SN NJDF) Detail Pinsel Set | B08LH63D89 | |
| Deckgläser (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethylalkohol 200 Proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Eisessig | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Juwelier Pinzette, Dumont Nr. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nagellack | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nilrot (Lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Papierhandtücher/-tücher | ULINE | S-7128 | |
| Petriplatte (zur Herstellung von Spachtelplatten) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipettenspitzen | Gilson | Tips E200ST | |
| Kunststoff-Transferpipette | Fisher Wissenschaftliche | S304671 | |
| Primäre Antikörper (z. B. Crb, Rab11) | Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Maus anti-Crb (Cq4) oder Kaninchen anti-Rab11 | |
| Sekundärantikörper mit fluoreszierenden Tags (z. B. Alexa Fluor 488 Ziegen-anti Kaninchen) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silikonharz und Härter für Spachtelplatten | Dow Chemicals - Ximeter Silikon | PMX-200 | |
| Objektträger, einseitig mattiert zur Beschriftung | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Weizenkeim-Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referenzen
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553(2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672(2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115(1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617(2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
- Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
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Nachdrucke und Genehmigungen
