Diese Studie beschreibt die direkte Messung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom unter Verwendung eines stabilen Isotopenglukose-Tracers über die Schwanzvene sowohl im nüchternen als auch im glukosereichen Zustand im Tandem.
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Methodenartikel
Evaluierung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige Erkrankung, die zu Störungen des Glukosestoffwechsels wie Insulinresistenz und Glukoseintoleranz führt. Der fehlregulierte Glukosestoffwechsel ist eine wichtige Manifestation der Krankheit und der Schlüssel zu ihrer Pathogenese. Daher sind Studien zur Bewertung des Glukosestoffwechsels bei PCOS von größter Bedeutung. Nur sehr wenige Studien haben die hepatische Glukoseproduktion direkt in PCOS-Modellen mit nicht-radioaktiven Glukose-Tracern quantifiziert. In dieser Studie diskutieren wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Quantifizierung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell durch Messung der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose, einem stabilen Isotopenglukose-Tracer, mittels Gaschromatographie - Massenspektrometrie (GCMS). Dieses Verfahren beinhaltet die Herstellung einer stabilen isotopenförmigen Glucose-Tracer-Lösung, die Verwendung der Platzierung des Schwanzvenenkatheters und die Infusion des Glucose-Tracers sowohl im nüchternen als auch im glucosereichen Zustand in derselben Maus im Tandem. Die Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose wird mit Pentaacetatderivat in GCMS gemessen. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Studien angewendet werden, die eine direkte Messung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion beinhalten.
Einleitung
Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige Erkrankung, die bei 12 %-20 % der Frauen im gebärfähigen Alter auftritt1,2. Es ist eine komplexe Erkrankung, die zu variablen Phänotypen führt, an denen polyzystische Eierstöcke, unregelmäßige Menstruationen und klinische oder Labornachweise einer Hyperandrogenämie beteiligt sind, und wird typischerweise diagnostiziert, wenn eine Frau zwei der drei Kriterien erfüllt3. Ein vorherrschender Aspekt von PCOS und ein Schlüsselfaktor für seine Pathogenese sind metabolische Störungen, die bei Frauen mit der Krankheit auftreten. Frauen mit PCOS haben eine höhere Inzidenz von Insulinresistenz, Glukoseintoleranz, Fettleibigkeit und metabolischem Syndrom3,4,5,6. Insulinresistenz ist nicht nur eine Manifestation der Krankheit, sondern es wird angenommen, dass sie zu ihrer Pathogenese beiträgt, indem sie die Wirkung des luteinisierenden Hormons im Eierstock verstärkt und dadurch zu einer erhöhten Androgenproduktion führt7,8. Es wird angenommen, dass die Insulinresistenz mehrere mögliche Ursprünge hat, aber Studien deuten darauf hin, dass sie auf abnormale Muster der Insulinrezeptorsignalisierung zurückzuführen sein könnte9,10. Studien haben die Insulinresistenz bei PCOS-Patienten unter Verwendung der Goldstandardtechnik der hyperinsulinämisch-euglykämischen Clamp11,12,13,14,15 untersucht. Frauen mit PCOS, unabhängig vom BMI, haben im Vergleich zu Kontrollen eine höhere Insulinresistenz. Die Insulinkontrolle über die Glukoseproduktion ist bei Störungen der Insulinresistenz, die zu einer übermäßigen Glukoseproduktion führen, beeinträchtigt. Zum Beispiel haben Diabetiker erhöhte Raten der Glukoneogenese und eine gestörte Unterdrückung der Glykogenolyse16. Darüber hinaus wurde bei diabetischen Ratten eine gestörte Unterdrückung der Glukoseproduktion beobachtet17. Obwohl Clamp-Studien eine Messung der Insulinresistenz liefern können, konzentrieren sich nur wenige Studien in PCOS auf die direkte Messung der Glukoseproduktion im Nüchtern- und Fütterungszustand. Dies erfordert die Verwendung einer nicht-radioaktiven Isotopenglukose-Tracer-Infusion und die Messung mittels Massenspektrometrie.
Tiermodelle wurden in der PCOS-Forschung ausgiebig verwendet. Sowohl schlanke als auch fettleibige PCOS-Murinenmodelle wurden durch pränatale, präpubertelle oder postpubertale Verabreichung von Androgenen erstellt18. Nagetier-PCOS-Modelle zeigen auch metabolische Unterschiede im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen. Frühere Daten aus unserem Labor zeigten abnormale Glukosetoleranztests (GTT) in PCOS-Mausmodellen (mager und fettleibig), die mit der menschlichen PCOS-Literatur übereinstimmen19. Die Verwendung eines schlanken und fettleibigen Tiermodells ermöglicht die weitere Untersuchung von Stoffwechselunterschieden. Insbesondere ermöglicht dieses Modell die Bewertung der Rate der Glukoseproduktion direkt unter Verwendung von Isotopenglukose-Tracern. Einer der am häufigsten verwendeten stabilen Isotopenglukose-Tracer ist [6,6-2H2]Glucose. Die [6,6-2H2]Glucoseanreicherung kann mit einem Pentaacetatderivat wie zuvor beschrieben gemessen werden20.
In dieser Studie war es unser Ziel, die Rate der hepatischen Glukoseproduktion im nüchternen und glukosereichen Zustand bei PCOS-Mäusen mit Isotopenglukoseinfusion zu messen. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Experimenten mit Glukosekinetik angewendet werden.
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Protokoll
Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Herstellung von [6,6-2H2]Glucose
- Bereiten Sie einen Tag vor dem Eingriff den stabilen Isotopenglukose-Tracer in normaler Kochsalzlösung vor. Für dieses Experiment wurde [6,6-2H2]Glucose als Tracer zur Messung der Plasmaglukose-Erscheinungsrate verwendet.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde die Glukoseproduktion während des Fastens und glukosereicher Bedingungen gemessen, so dass das Glukoseisotop in zwei verschiedenen Präparaten hergestellt wurde. Bereiten Sie die Lösungen so vor, dass die endgültige Infusionsdosis nahe bei 1 mg/(kg·min) bzw. 2 mg/(kg·min) liegt. Diese Konzentrationen wurden durch mehrere frühere Pilotstudien optimiert. - Bereiten Sie das erste Infusat mit nur [6,6-2H2]Glucose als Tracer vor, um den Nüchternzustand darzustellen, indem sterile und pyrogenfreie [6,6-2H2]Glucose in steriler 0,9% iger Natriumchloridlösung gelöst wird.
- Bereiten Sie das zweite Infusat vor, indem Sie sowohl [6,6-2H2] Glucose Tracer zusammen mit nicht-isotopischer Glucose (~ 20 mg/kg·min) in steriler 0,9% iger Natriumchloridlösung auflösen, um den Fütterungszustand zu simulieren.
ANMERKUNG: Im vorliegenden Versuch wurde eine grundierte Infusion mit konstanter Rate von [6,6-2H2]Glucose bei (~) 1,08 mg/(kg·min) (Nüchternzustand) und (~) 1,9 mg/kg·min (glukosereicher Zustand) verwendet. Um den "glukosereichen Zustand" nachzuahmen, wurde die D-Glukose-Infusionsrate auf (~) 18,8 mg/(kg·min) eingestellt. - Sobald die Lösungen hergestellt sind, werden die Lösungen mit einem 0,22 μm-Filter steril filtriert und bei 4 °C gelagert. Erwärmen Sie die Lösungen vor der Infusion auf Raumtemperatur. Laden Sie die Lösungen auf voretikettierte 1 ml Spritzen.
- Richten Sie die Pumpe so ein, dass sie eine grundierte Infusion des ersten Infusats (für den basalen Zustand) mit konstanter Rate ermöglicht, die nur den Tracer enthält, und programmieren Sie die Pumpe für eine Infusion des Isotops mit konstanter Rate bei 150 μL / h für 3 h.
- Ersetzen Sie am Ende des 3-stündigen Nüchternaufbaus die erste Infusionsspritze durch die zweite Infusionsspritze, die den Isotopen-Tracer und die D-Glucose (für den simulierten Fed-Zustand) enthält, und bereiten Sie die Infusion für die ersten 15 min bei 600 μL/h vor. Stellen Sie die Pumpe für die zusätzlichen 3 h auf eine Infusion mit konstanter Geschwindigkeit bei 150 μL/h.
2. Aufbau von Infusionsexperimenten
- Entfernen Sie die Mäuse aus ihren Heimkäfigen und legen Sie sie 3 h vor Beginn des Experiments in ihre Fastenkäfige. Für dieses Experiment wurde eine 4 Monate alte weibliche Mäuse aus dem Stamm C57BL/6J verwendet.
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert aufgrund seines minimalinvasiven Charakters keine Analgesie vor oder während des Eingriffs. - Stellen Sie die Käfigausrüstung zusammen, indem Sie die Mäuse in eine bestimmte Anzahl von Mäusen pro Insulinpumpe gruppieren. Platzieren Sie Trennwände auf einer flachen, stabilen Basis, um individuelle Ställe für die Mäuse zu schaffen. Es ist wichtig, Zugang zum Schwanzvenenkatheter zu haben, damit die Infusion laufen kann, also stellen Sie sicher, dass sich unten in der Käfigtür eine Kerbe befindet.
HINWEIS: Die im Video gezeigten Käfige wurden speziell für dieses Experiment hergestellt. Die Käfige sind klar und bestehen aus Plexiglas. Es gibt eine flache, stabile Basis (Standard-Käfigausrüstung), auf der die Trennwände sitzen. Dieses Setup besteht aus mehreren Teilen, um die Einrichtung in verschiedenen Umgebungen zu erleichtern, abhängig von der Höhe des Tisches und den Bedürfnissen des Experimentators. Die Tür zum Käfig gleitet zum Schließen und hat eine Kerbe an der Unterseite, damit der Schwanz durchpassen kann. - Montieren Sie die 1-ml-Spritzen, die 1 ml Basalinfusat enthalten, und schließen Sie sie dann mit dem Polyethylenschlauch 0,28 mm ID x 0,61 mm an den Infusionspumpenschlauch an.
- Bereiten Sie die Infusionspumpe vor, indem Sie die Rate auf 150 μL/h einstellen, was der Basalrate entspricht.
- Ein Wasserbad auf 48 °C erhitzen.
- Bereiten Sie die Kathetereinführungsstation neben dem Wasserbad vor, die die 30 G 0,5 Zoll Nadeln, 0,3 mm ID x 0,64 mm Silastikschlauch und 1 Zoll klares Transporeband enthält.
- Beginnen Sie nach 3 Stunden Fasten mit dem Kathetereinführungsprozess, der unten beschrieben wird.
3. Kathetereinführung
- Wählen Sie eine Maus aus und legen Sie sie in eine sichere Halterung mit Zugriff auf den Schwanz. Ein Beispiel dafür, was zu verwenden ist, ist eine flasche, die mit einer Kerbe für den Schwanz in zwei Hälften geschnitten ist. Stellen Sie den Halter auf einen flachen Boden. Legen Sie ein Stück Klebeband über den proximalen Teil des Schwanzes, um Platz für die Kathetereinführung zu schaffen.
HINWEIS: Der für diese Aufgabe gewählte Bandtyp muss eine moderate Festigkeit und Haftfähigkeit aufweisen. Mehrzweck-, papierbasiertes Etikettierband wurde in diesem Experiment verwendet, da es mild und leicht abzuziehen ist. - Bereiten Sie den Katheter vor (30 G Nadel, die an einem 0,3 mm silastischen Schlauch befestigt war, und PE-10 wurden gassterilisiert), indem Sie ihn an einer 1-ml-Spritze befestigen, die sterile heparinisierte Kochsalzlösung enthält. Spülen Sie den Katheter vorsichtig.
- Bringen Sie die Maus ins Wasserbad und stecken Sie den Schwanz für ca. 30-45 s in das Wasserbad. Dies hilft, das Schwanzgefäßsystem für die Katheterplatzierung zu erweitern.
- Führen Sie die Kathetereinführung unter sterilen Bedingungen durch. Sobald der Schwanz erwärmt ist, reinigen Sie den Schwanz mit Benzalkoniumtüchern und legen Sie eine kleine kupferne, zahnlose Alligatorklemme, die zuvor an die Form des Schwanzes angepasst war, als Tourniquet am proximalen Ende des Schwanzes. Visualisieren Sie die laterale Schwanzvene unter einer Lupe und führen Sie dann den Katheter vorsichtig in die Schwanzvene ein und ziehen Sie die Nadel zurück. Spülen Sie die Lösung vorsichtig, um die Durchgängigkeit des Katheters sicherzustellen.
- Wickeln Sie ein Stück 1 Zoll Transpore-Klebeband um die Einführstelle, um den Katheter zu sichern. Entfernen Sie den kleinen Tourniquet vom Schwanz.
4. Infusionsaufbau und erste Infusion
- Legen Sie die Maus in ihren individuellen Käfig und schließen Sie die Schiebetür, um sicherzustellen, dass der Schwanz durch die Kerbe herausragt und außerhalb des Käfigs bleibt.
- Legen Sie ein zusätzliches Stück Klebeband über den gesamten Katheter und den Schwanz, um es an der Grundplatte des Käfigs zu befestigen. Für diesen Schritt wurde ein farbig buntes Etikettenband verwendet.
- Trennen Sie die Spülung vom Schwanzvenenkatheter und legen Sie eine kleine Klemme auf den silastischen Schlauch des Katheters, um einen Rückfluss zu verhindern, während Sie die Infusatleitung von der Pumpe verbinden.
- Nach dem sicheren Anschluss entfernen Sie die Klemme und bündig mit der Grundierungslösung, die aus dem Infusat besteht. Stellen Sie sicher, dass die Lösung im Schlauch klar und nicht blutbefleckt ist.
- Notieren Sie sich den Zeitpunkt des Beginns der Infusion, um sicherzustellen, dass sie für die Gesamtzeit von ca. 3 h läuft. Wenn mehrere Käfige gleichzeitig verwendet werden, sollten sie gestaffelt sein, um die Infusionszeiten effektiv zu verwalten.
- Sobald festgestellt wird, dass die Infusionsleitungen ordnungsgemäß funktionieren, entfernen Sie die Abdeckung von der Maus. Legen Sie die Standardbettwäsche um die Maus herum.
- Beginnen Sie die Infusion mit dem ersten Infusat, das den Tracer enthält, und lassen Sie es 3 h lang kontinuierlich laufen. Überprüfen Sie für die Dauer der Infusion weiterhin das Wohlbefinden der Mäuse sowie die Infusionsleitungen. Stellen Sie sicher, dass der Infusionsschlauch ordnungsgemäß gesichert ist und dass keine Lecks von den Leitungsanschlusspunkten vorhanden sind.
5. Blutentnahme
- Nachdem die erste Infusion abgeschlossen ist, stoppen Sie die Infusion, legen Sie eine Klemme auf den Sylastikschlauch am Katheter, um einen Rückfluss zu verhindern. Entfernen Sie die Mäuse vorsichtig aus ihren Gehegen, ohne den Katheter zu stören, um Blut zu sammeln. Legen Sie sie an eine Stelle in der Nähe der Käfige zur Blutentnahme. Für dieses Experiment unterzogen sich die Mäuse einer Wangenflechtung mit einer 4 mm Lanzette.
- Sammeln Sie ~ 75 μL Blut in der gewünschten Durchstechflasche. Um Proben in Vorbereitung auf die Massenspektrometrie zu deproteinisieren, fügen Sie etwa 15 μL Blut zu 500 μL Aceton hinzu. Das verbleibende Blut kann verwendet werden, um den Blutzuckerspiegel über das Blutzuckermessgerät zu überprüfen und / oder zentrifugiert werden, um Plasma für zukünftige Hormonassays zu trennen.
6. Zweite Infusion
- Entfernen Sie die Infusate aus den Spritzenpumpen, indem Sie den Schlauch von den Spritzen trennen und durch das zweite Infusat ersetzen, das den Tracer zusammen mit der Glukose enthält. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.7 mit der glukosereichen isotopenförmigen Glukoseinfusion.
- Um einen stationären Zustand zu erreichen, lassen Sie einen Bolus des zweiten Infusats bei 600 μL / h für 15 min laufen. Notieren Sie sich die Startzeit für jede Gruppe von Käfigen. Verringern Sie die Infusionsrate auf 150 μL/h, um die Gesamtinfusionszeit von 3 h zu vervollständigen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1 und 5.2.
- Stoppen Sie die Infusionspumpe und entfernen Sie den Schwanzvenenkatheter vorsichtig, üben Sie Druck auf die Katheterstellen aus, bis die Blutung aufhört, und bringen Sie Mäuse in ihre Heimkäfige zurück.
- Santisieren und desinfizieren Sie die Käfigeinrichtung gründlich mit Standard-Seife und Wasser.
HINWEIS: Dies ist ein Überlebensverfahren. Mäuse können in Käfige zurückgebracht und bei Bedarf für weitere Experimente gehalten werden. Es wird empfohlen, nach diesem Verfahren mindestens eine Woche lang keine weiteren Untersuchungen durchzuführen, um ein angemessenes Tierwohl zu gewährleisten.
7. Massenspektrometrie
- Senden Sie die Proben zur Massenspektrometrie.
- Analysen
- Messung der Isotopenanreicherung von [6,6-2H2]Glucose durch Gaschromatographie - Massenspektrometrie (GCMS) unter Verwendung des Pentaacetatderivats21,22. Kurz gesagt, diese Methode beinhaltet die Herstellung des Pentaacetatderivats von Glucose, gefolgt von einer Probenanalyse mit GCMS 20,22.
- Berechnungen
- Führen Sie alle kinetischen Messungen unter stationären Bedingungen durch. Die Gesamtplasmaglukose-Erscheinungsrate (Glucose Ra) wurde aus der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose im Plasma unter Verwendung etablierter Isotopenverdünnungsgleichungen21 berechnet. Unter stationären Bedingungen wird angenommen, dass die Rate des Auftretens von Glukose gleich der Rate des Verschwindens von Glukose ist. Rate der endogenen Glukoseproduktion (mg/(kg·min)) (GPR) = glucoseRa - exogene Glukose.
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Ergebnisse
Unter Verwendung zuvor beschriebener Isotopenverdünnungsgleichungen wurde die Gesamtplasmaglukoserate (glucoseRa) aus der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose unter nüchternen und glucosereichen Bedingungen unter Verwendung des Pentaacetatderivats21 berechnet. Unter stationären Bedingungen wird angenommen, dass die Rate des Auftretens von Glukose gleich der Rate des Verschwindens von Glukose ist. In der Kontrollgruppe betrug die GesamtglucoseRa 19,98 ± 2,53 mg/(kg...
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Diskussion
Hyperglykämie und abnormaler Glukosestoffwechsel / Homöostase sind Merkmale von PCOS. Der Blutzuckerspiegel wird durch eine Kombination von Glukose aus der Nahrung und Glukoseproduktion über Glykogenolyse und Glukoneogenese und Glykogenese unter der Kontrolle von Hormonen und Enzymen aufrechterhalten. Die hepatische Glukoseproduktion wird durch das Vorhandensein erhöhter zirkulierender Glukosespiegel unterdrückt. Bei Störungen des abnormalen Glukosestoffwechsels ist die Regulierung der Unterdrückung der Glukosep...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Ausbildungsstipendien der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, des Baylor College of Medicine (ALG) und des R-01-Forschungsstipendiums (Grant # DK114689) für CSB, SC und JM von National Institutes of Health unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,9%ige Natriumchloridlösung | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok Spitzenspritze | VWR | 75846-756 | Zwei Spritzen pro Tier (eine für isotopische Glukoselösung, eine für glukosereiche Isotopenlösung) |
| 1 Zoll durchsichtiges Transporenband | 3M | 70200400169 | |
| 1 Zoll Beschriftungsband | Fisher | GS07F161BA | Brand ist ein Beispiel |
| 5 mL Spritze mit heparanisierter Kochsalzlösung | Flush McKesson | 191-MIH-2235 | Man kann auch eine Heparin-Spüllösung herstellen (10 Einheiten/mL Heparin in 0,9% Natriumchlorid) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod Tierlanzetten | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm, wenn das Tier zwischen 2 und 6 Monaten alt ist |
| Aceton | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced Heizplattenrührer | VWR | 97042-602 | Marke ist Beispiel |
| BD 27 Gauge 0,5 Zoll | Nadeln Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 Gauge 0,5 Zoll | Nadeln Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylen (PE) Schlauch 0,28 mm ID x 0,61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylen (PE) Schlauch 0,28 mm ID x 0,61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Becherglas, 1000 mL | Jede Marke | ||
| Käfigpellets Klare | |||
| VOA-Glasfläschchen mit geschlossenem Verschluss | Fisher Scientific | 05-719-120 | Zur Aufbewahrung von Aceton- und Blutabnahmeproben |
| Zahnlose Krokodilklemme aus Kupfer für Tourniquet | Amazon | Alle Marken; glatte zahnlose Krokodilklemmen aus massivem Kupfer | |
| D-(+)-Glukose >99,5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-Glukose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Lupe | Amazon | Alle Marken; ähnlich LANCOSC Lupe mit Licht und | |
| Stativ | Microbalance Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Jedes ähnliche Modell mit einer Genauigkeit von 0,0001 g kann verwendet werden |
| Nalgene Flasche, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | oder eine ähnliche Marke; Sägen Sie die Hälften (einschließlich Deckel) und schneiden Sie die schwanzgroße Kerbe im Boden |
| ab PHD Ultra Multi-Spritzenpumpe | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglasplatte | Jede Marke; zur Stabilisierung der Maus während des Einführens des Katheters | ||
| Plexiglasplatten und Trennwände | Jede Marke; wird verwendet, um Mäuse während der Infusion einzusperren |
Referenzen
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