Dieses Protokoll stellt einen radioaktiv markierten Aminosäureaufnahmetest vor, der für die Bewertung des Aminosäureverbrauchs entweder in Primärzellen oder in isolierten Knochen nützlich ist.
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Methodenartikel
Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Knochenentwicklung und Homöostase sind abhängig von der Differenzierung und Aktivität knochenbildender Osteoblasten. Die Osteoblastendifferenzierung ist sequentiell durch Proliferation gekennzeichnet, gefolgt von der Proteinsynthese und schließlich der Knochenmatrixsekretion. Proliferation und Proteinsynthese erfordern eine konstante Zufuhr von Aminosäuren. Trotzdem ist sehr wenig über den Aminosäureverbrauch in Osteoblasten bekannt. Hier beschreiben wir ein sehr empfindliches Protokoll, das entwickelt wurde, um den Aminosäureverbrauch mit radioaktiv markierten Aminosäuren zu messen. Diese Methode ist optimiert, um Veränderungen in der Aminosäureaufnahme zu quantifizieren, die mit der Proliferation oder Differenzierung von Osteoblasten, Arzneimittel- oder Wachstumsfaktorbehandlungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen verbunden sind. Wichtig ist, dass diese Methode austauschbar verwendet werden kann, um den Aminosäureverbrauch in kultivierten Zelllinien oder Primärzellen in vitro oder in isolierten Knochenschäften ex vivo zu quantifizieren. Schließlich kann unsere Methode leicht angepasst werden, um den Transport einer der Aminosäuren sowie von Glukose und anderen radioaktiv markierten Nährstoffen zu messen.
Einleitung
Aminosäuren sind organische Verbindungen, die eine funktionelle Amino- (-NH2) und Carboxylgruppe (-COOH) mit einer variablen Seitenkette enthalten, die für jede Aminosäure spezifisch ist. Im Allgemeinen sind Aminosäuren als Grundbestandteil von Protein bekannt. In jüngerer Zeit wurden neuartige Anwendungen und Funktionen von Aminosäuren aufgeklärt. Zum Beispiel können einzelne Aminosäuren metabolisiert werden, um intermediäre Metaboliten zu erzeugen, die zur Bioenergetik beitragen, als enzymatische Cofaktoren fungieren, reaktive Sauerstoffspezies regulieren oder zur Synthese anderer Aminosäuren verwendet werden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 <....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Mausverfahren wurden von den Animal Studies Committees am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt. Das Bestrahlungsprotokoll wurde vom Radiation Safety Advisory Committee am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt.
1. Aufnahme von Aminosäuren in Zellen (Protokoll I)
- Platte 5 x 104 ST2-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Plattenzellen aus α-MEM, die 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 0,1 μg/ml Streptomycin (Pen/Streptokokken) enthalten. Plate zusätzliche Vertiefungen von Zellen, um die Zellzahl ....
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Ergebnisse
Der Aminosäuretransport wird durch viele membrangebundene Aminosäuretransporter reguliert, die basierend auf zahlreichen Merkmalen, einschließlich Substratspezifität, Kinetik sowie Ionen- und pH-Abhängigkeit in unterschiedliche Transportsysteme eingeteilt wurden25. Beispielsweise kann die Glutaminaufnahme durch die Na+-abhängigen Transportsysteme A, ASC, γ+L und N oder das Na+-unabhängige System L vermittelt werden. Die Na+-abhängigen Systeme unterscheiden sich durch die Fähi.......
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Diskussion
Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen schnellen und sensitiven Ansatz zur Bewertung der Aminosäureaufnahme als Reaktion auf verschiedene experimentelle Permutationen entweder in vitro oder ex vivo. Im Vergleich zu handelsüblichen Kits (z. B. Glutamine and Glutamate Determination Kit) ist diese Methode viel empfindlicher, schneller und weniger arbeitsintensiv16,17,25. In unserem Protokoll bewerten wir d.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
Das Karner-Labor wird durch R01-Zuschüsse des National Institute of Health (AR076325 und AR071967) an C.M.K.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-Well-Platte | Corning | 3513 | |
| 1 mL Spritze | BD Präzision | 309628 | |
| 30G Nadel | BD Präzision | 305106 | |
| Arginin Monohydrochlorid L-[2,3,4-3H]-, 1 mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 Szintillationszähler | |||
| Calciumchlorid | Sigma | C1016 | |
| Cholinchlorid | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glukoselösung | Sigma | G8769 | |
| Präparierwerkzeug | Pinzetten, Scheren, Scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamin | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Fläschchen mit flüssiger Szintilation | Sigma | Z190535 | |
| Lithiumchloridlösung, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Kaliumchlorid | Sigma | P3911 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma | S6014 | |
| Natriumchlorid | Sigma | S9888 | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma | D6750 | |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& Werkstoffe | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Szintillationslösung) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobuttersäure | Sigma | M2383 |
Referenzen
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
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Nachdrucke und Genehmigungen
