Methodenartikel

Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften

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DOI:

10.3791/62995

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13. April 2022

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen radioaktiv markierten Aminosäureaufnahmetest vor, der für die Bewertung des Aminosäureverbrauchs entweder in Primärzellen oder in isolierten Knochen nützlich ist.

Zusammenfassung

Knochenentwicklung und Homöostase sind abhängig von der Differenzierung und Aktivität knochenbildender Osteoblasten. Die Osteoblastendifferenzierung ist sequentiell durch Proliferation gekennzeichnet, gefolgt von der Proteinsynthese und schließlich der Knochenmatrixsekretion. Proliferation und Proteinsynthese erfordern eine konstante Zufuhr von Aminosäuren. Trotzdem ist sehr wenig über den Aminosäureverbrauch in Osteoblasten bekannt. Hier beschreiben wir ein sehr empfindliches Protokoll, das entwickelt wurde, um den Aminosäureverbrauch mit radioaktiv markierten Aminosäuren zu messen. Diese Methode ist optimiert, um Veränderungen in der Aminosäureaufnahme zu quantifizieren, die mit der Proliferation oder Differenzierung von Osteoblasten, Arzneimittel- oder Wachstumsfaktorbehandlungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen verbunden sind. Wichtig ist, dass diese Methode austauschbar verwendet werden kann, um den Aminosäureverbrauch in kultivierten Zelllinien oder Primärzellen in vitro oder in isolierten Knochenschäften ex vivo zu quantifizieren. Schließlich kann unsere Methode leicht angepasst werden, um den Transport einer der Aminosäuren sowie von Glukose und anderen radioaktiv markierten Nährstoffen zu messen.

Einleitung

Aminosäuren sind organische Verbindungen, die eine funktionelle Amino- (-NH2) und Carboxylgruppe (-COOH) mit einer variablen Seitenkette enthalten, die für jede Aminosäure spezifisch ist. Im Allgemeinen sind Aminosäuren als Grundbestandteil von Protein bekannt. In jüngerer Zeit wurden neuartige Anwendungen und Funktionen von Aminosäuren aufgeklärt. Zum Beispiel können einzelne Aminosäuren metabolisiert werden, um intermediäre Metaboliten zu erzeugen, die zur Bioenergetik beitragen, als enzymatische Cofaktoren fungieren, reaktive Sauerstoffspezies regulieren oder zur Synthese anderer Aminosäuren verwendet werden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Viele Studien zeigen, dass der Aminosäurestoffwechsel für die Pluripotenz, Proliferation und Differenzierung von Zellen in verschiedenen Kontexten entscheidend ist 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Osteoblasten sind sekretorische Zellen, die die Kollagen-Typ-1-reiche extrazelluläre Knochenmatrix produzieren und sezernieren. Um hohe Proteinsyntheseraten während der Knochenbildung aufrechtzuerhalten, benötigen Osteoblasten eine konstante Versorgung mit Aminosäuren. Um diese Nachfrage zu decken, müssen Osteoblasten aktiv Aminosäuren erwerben. In Übereinstimmung damit zeigen neuere Studien die Bedeutung der Aminosäureaufnahme und des Stoffwechsels für die Osteoblastenaktivität und Knochenbildung 15,16,17,18,19,20.

Osteoblasten erwerben zelluläre Aminosäuren aus drei Hauptquellen: extrazelluläres Milieu, intrazellulärer Proteinabbau und de novo Aminosäurebiosynthese. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bewertung der Aminosäureaufnahme aus der extrazellulären Umgebung. Die gebräuchlichsten Methoden zur Messung der Aminosäureaufnahme basieren entweder auf radioaktiv markierten (z. B. 3H oder 14C) oder schweren isotopenmarkierten (z. B. 13C) Aminosäuren. Schwere Isotopomer-Assays können die Aminosäureaufnahme und den Stoffwechsel gründlicher und sicherer analysieren, sind jedoch zeitaufwendiger und dauern mehrere Tage, da es einen Tag dauert, um Proben vorzubereiten und zu derivatisieren, und mehrere Tage, um auf dem Massenspektrometer zu analysieren, abhängig von der Anzahl der Proben21,22. Im Vergleich dazu sind radioaktiv markierte Aminosäureaufnahmetests nicht informativ über den nachgeschalteten Stoffwechsel, aber billig und relativ schnell, da sie innerhalb von 2-3 h nach Beginn des Experiments abgeschlossen werden können23,24. Hier beschreiben wir ein leicht modifizierbares Basisprotokoll zur Bewertung der radioaktiv markierten Aminosäureaufnahme in kultivierten Primärzellen oder Zelllinien in vitro oder einzelnen Knochenschäften ex vivo. Die Anwendung dieser beiden Protokolle kann auf andere radioaktiv markierte Aminosäuren und andere knochenassoziierte Zelltypen und Gewebe ausgedehnt werden.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Mausverfahren wurden von den Animal Studies Committees am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt. Das Bestrahlungsprotokoll wurde vom Radiation Safety Advisory Committee am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt.

1. Aufnahme von Aminosäuren in Zellen (Protokoll I)

  1. Platte 5 x 104 ST2-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Plattenzellen aus α-MEM, die 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 0,1 μg/ml Streptomycin (Pen/Streptokokken) enthalten. Plate zusätzliche Vertiefungen von Zellen, um die Zellzahl pro Bedingung für die Normalisierungen in Schritt 1.12 zu quantifizieren. Zellen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C mit 5%CO2 inkubieren.
  2. Kultivieren Sie die Zellen für 2-3 Tage, bis sie konfluieren.
  3. Bereiten Sie am Tag des Experiments die folgenden Lösungen vor: 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 und Krebs Ringers HEPES (KRH) Puffer, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Auf 37 °C vorwärmen.
  4. Das Medium absaugen und die Zellen zweimal mit 1 ml 1x PBS, pH 7,4 waschen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll eignet sich auch für sich schnell teilende nicht konfluente Zellen. In diesem Fall ist es wichtig, die Radioaktivität entweder auf absolute Zellzahl oder DNA-Gehalt zu normalisieren. Erwägen Sie außerdem, die Größe der Kulturplatte oder des Kulturkolbens zu erhöhen, um die Gesamtzahl der Zellen und die cpm-Werte zu erhöhen. Dies ist wichtig, um empirisch auf individueller Basis zu bestimmen.
  5. 1x PBS absaugen und die Zellen einmal mit 1 mL KRH waschen.
  6. Stellen Sie 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamin-Arbeitsmedien her, indem Sie 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamin-Brühe pro 1 ml KRH verdünnen.
    HINWEIS: Bevor Sie radioaktive Stoffe verwenden, wenden Sie sich bitte an das Amt für Strahlenschutz Ihrer Heimateinrichtung, um Genehmigungen zu erhalten. Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Strahlung müssen hinter dem Plexiglasschirm durchgeführt werden.
  7. Zellen mit 0,5 mL KRH inkubieren, die 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamin-Arbeitsmedien enthalten, für 5 min.
  8. Sammeln Sie das radioaktive Medium und geben Sie es in den flüssigen Abfallbehälter. Waschen Sie die Zellen dreimal kurz mit eiskaltem KRH, um die Reaktion zu beenden. Sammeln und entsorgen Sie alle Waschungen im Behälter für radioaktive flüssige Abfälle.
  9. Fügen Sie 1 ml 1% SDS zu jeder Vertiefung hinzu und triturate 10x, um die Zellen zu lysieren und zu homogenisieren. Übertragen Sie die Zelllysate in 1,5 ml Röhrchen. Entsorgen Sie Zellkulturplatten, serologische Pipetten und Pipettenspitzen im Behälter für feste radioaktive Abfälle.
  10. Zentrifugieren bei >10.000 x g für 10 min. Die Überstände werden in Szintillationsfläschchen überführt, die 8 ml der Szintillationslösung enthalten. Mischen Sie, indem Sie die Szintillationsfläschchen kräftig schütteln. Entsorgen Sie Röhrchen und Pipettenspitzen in einem Behälter für feste radioaktive Abfälle.
  11. Lesen Sie Radioaktivität in Zählungen pro Minute (cpm) mit einem Szintillationszähler. Entsorgen Sie Szintillationsfläschchen in einem Abfallbehälter der Szintillationsfläschchen.
  12. Trypsinisieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen aus den verbleibenden nicht-radioaktiven Zellplatten (siehe Schritt 1.1), um die Anzahl der Zellen in den lysierten, radioaktiven Kulturen zu schätzen. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen pro nicht radioaktiver Vertiefung für jeden experimentellen Zustand. Normalisieren Sie die cpm von Schritt 1.11 auf die geschätzte Zellzahl der nicht radioaktiven Platten.
  13. Nach Abschluss des Experiments dekontaminieren Sie die Zellkulturhaube, den Labortisch und alle Instrumente mit einem Radioaktivitäts-Dekontaminationsspray. Führen Sie schließlich Wischtests durch, um sicherzustellen, dass der Arbeitsbereich strahlungsfrei ist.

2. Aminosäureaufnahme in frisch isoliertem Knochengewebe (Protokoll II)

  1. KRH auf 37 °C vorwärmen.
  2. Euthanasieren Sie eine 3 Tage alte Maus und entfernen Sie die Haut an den Armen. Trennen Sie den Humeri mit einer Schere von der Schulter und sezieren Sie beide Oberarmknochen. Entfernen Sie alle Magistralgewebe mit einem Skalpell und einer Pinzette. Entfernen Sie die Epiphysen vom Knochen.
    HINWEIS: Zusätzlich zu humerii kann dieses Protokoll an neonatale Femora, Tibiae und Calvariae sowie Humerii, Femora und Tibiae angepasst werden, die aus 2- und 4 Monate alten Mäusen isoliert wurden (unveröffentlichte Daten).
  3. Spülen Sie das Knochenmark aus dem Knochen und wiegen Sie die Knochenschäfte, um sich in Schritt 2.14 zu normalisieren.
  4. Kochen Sie einen Humerus in 1x PBS bei 100 °C für 10 min, um den Knochen zu dezellularisieren. Der dezellularisierte gekochte Knochen wird als Negativkontrolle verwendet.
    HINWEIS: Als Qualitätskontrolle bettet Paraffin die gekochten und nicht gekochten Knochen für histologische Färbungen ein, um visuell zu bestätigen, dass das Kochen bei der Dezellularisierung des Knochens wirksam war.
  5. Beide Humeri in 1 ml KRH für 30 min im Zellkulturinkubator bei 37 °C ausgleichen.
  6. Man stellt eine Arbeitslösung von 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-Arginin in KRH her, indem man 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Argininbestand pro 1 ml KRH verdünnt.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist geeignet, um die Aufnahme des gewählten radioaktiv markierten Nährstoffs zu bewerten. L-[2,3,4-3 H]-Glutamin, L-[14CU]-Alanin und L-[2,3-3 H]-Prolin wurden mit ähnlichen Ergebnissen getestet. Arginin-Daten werden gezeigt, um den Nutzen dieses Protokolls hervorzuheben.
    ACHTUNG: Alle Verfahren mit Strahlung müssen hinter dem Plexiglasschirm unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt werden.
  7. Inkubieren Sie sowohl den experimentellen als auch den gekochten Kontrollknochen separat in KRH mit 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-Arginin für bis zu 90 min bei 37 °C.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Inkubationszeiten für verschiedene Bedingungen, einschließlich des Alters der Mäuse, verschiedener Skelettelemente und der Arten von radioaktiv markierten Aminosäuren, empirisch zu bestimmen, indem ein Zeitverlauf durchgeführt wird. Die Sättigung erfolgt meist nach ca. 3-4 h. Die Aufnahme sollte zu einem Zeitpunkt in der linearen Wut der Aufnahme bewertet werden.
  8. Entfernen Sie das radioaktive Medium und entsorgen Sie es im Behälter für flüssige radioaktive Abfälle. Waschen Sie Humeri dreimal mit eiskaltem 1 ml KRH, um die Reaktion zu beenden. Entsorgen Sie alle Waschungen im Behälter für flüssige radioaktive Abfälle.
  9. Übertragen Sie jeden Knochen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie 500 μL RIPA-Puffer hinzu [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (w/v); 0,1% SDS (w/v)]. Entsorgen Sie die Kulturplatten, serologischen Pipetten und Pipettenspitzen in einem Behälter für radioaktive feste Abfälle.
  10. Homogenisieren Sie die Oberarmknochen, indem Sie 100 Mal mit einer Schere in einem RIPA-Puffer hacken.
  11. Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) den resultierenden homogenisierten Knochen für 10 s.
    HINWEIS: Es ist auch bekannt, dass die Sondierung Aerosole erzeugt. Beschallungsschritte können in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Um die Aerosolbildung zu reduzieren, ist es wichtig, die Röhrchen nicht zu überfüllen. Die Beschallung kleiner Probenvolumina kann zu einer unvollständigen Beschallung oder zu Probenverlust aufgrund von Schaumbildung führen. Wenn Schaumbildung auftritt, zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten, um sich abzusetzen.
  12. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren für 10 min bei >10.000 x g bei Raumtemperatur. 200 μL des Überstands werden in Szintillationsfläschchen überführt, die 8 ml der Szintillationslösung enthalten. Mischen Sie, indem Sie die Szintillationsfläschchen kräftig schütteln. Entsorgen Sie alle festen radioaktiven Abfälle (z. B. gebrauchte Röhrchen, Pipettenspitzen, Platten usw.) in den Behälter für feste radioaktive Abfälle.
  13. Radioaktivität (cpm) mit dem Szintillationszähler ablesen. Entsorgen Sie gebrauchte Szintillationsfläschchen in dem für Szintillationsfläschchen vorgesehenen Behälter für radioaktive Abfälle.
  14. Subtrahieren Sie die cpm des gekochten Knochens (Basalwert) von der cpm des experimentellen Knochens. Normalisieren Sie die Radioaktivität mit Knochengewicht aus Schritt 2.3.
  15. Besprühen Sie die Zellkulturhaube, die Instrumente und die Bank mit Radioaktivitätsdekontaminant. Führen Sie Wischtests durch, um zu bestätigen, dass der Arbeitsbereich strahlungsfrei ist.

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Ergebnisse

Der Aminosäuretransport wird durch viele membrangebundene Aminosäuretransporter reguliert, die basierend auf zahlreichen Merkmalen, einschließlich Substratspezifität, Kinetik sowie Ionen- und pH-Abhängigkeit in unterschiedliche Transportsysteme eingeteilt wurden25. Beispielsweise kann die Glutaminaufnahme durch die Na+-abhängigen Transportsysteme A, ASC, γ+L und N oder das Na+-unabhängige System L vermittelt werden. Die Na+-abhängigen Systeme unterscheiden sich durch die Fähi...

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Diskussion

Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen schnellen und sensitiven Ansatz zur Bewertung der Aminosäureaufnahme als Reaktion auf verschiedene experimentelle Permutationen entweder in vitro oder ex vivo. Im Vergleich zu handelsüblichen Kits (z. B. Glutamine and Glutamate Determination Kit) ist diese Methode viel empfindlicher, schneller und weniger arbeitsintensiv16,17,25. In unserem Protokoll bewerten wir d...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Angaben.

Danksagungen

Das Karner-Labor wird durch R01-Zuschüsse des National Institute of Health (AR076325 und AR071967) an C.M.K.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % TrypsinGibco25200
12-Well-PlatteCorning3513
1 mL SpritzeBD Präzision309628
30G NadelBD Präzision305106
Arginin Monohydrochlorid L-[2,3,4-3H]-, 1 mCiPerkinElmerNET1123001MC
Beckman LS6500 Szintillationszähler
CalciumchloridSigmaC1016
CholinchloridSigmaC7077
D-(+)-GlukoselösungSigmaG8769
PräparierwerkzeugPinzetten, Scheren, Scapels
DPBSGibco14190
EthylendiamintetraessigsäureSigmaE9884
HEPES(1M)Gibco15630
L-[3,4-3H(N)]-GlutaminPerkinElmerNET551250UC
Fläschchen mit flüssiger SzintilationSigmaZ190535
Lithiumchloridlösung, 8MSigmaL7026
MagnesiumchloridSigmaM8266
MEMαGibco12561
Mikrozentrifugenröhrchen, 15mLBiotix89511-256
NP-40Sigma492016
KaliumchloridSigmaP3911
NatriumbicarbonatSigmaS6014
NatriumchloridSigmaS9888
NatriumdesoxycholatSigmaD6750
NatriumdodecylsulfatSigma436143
SonicatorSonic& WerkstoffeVCX130
Tris BaseSigma648311
Ultima Gold (Szintillationslösung)PerkinElmer6013329
α-(Methylamino)isobuttersäureSigmaM2383

Referenzen

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