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Methodenartikel

In Ovo Fütterung von kommerziellen Masthähncheneiern: eine genaue und reproduzierbare Methode, um die Muskelentwicklung und das Muskelwachstum zu beeinflussen

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DOI:

10.3791/63006

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20. September 2021

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1Department of Animal and Dairy Sciences, University of Georgia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wurde eine robuste Methodik für die Durchführung von Forschungsversuchen im Bereich der Ovo-Fütterung entwickelt, bei denen nicht bebrütete kommerzielle Masthähncheneier verwendet werden, um die Fähigkeit natürlicher und synthetischer Verbindungen, in diesem Fall Nicotinamid-Ribosid, zu testen, die Muskelentwicklung und das Muskelwachstum zu beeinflussen.

Zusammenfassung

In den letzten drei Jahrzehnten konzentrierten sich Wissenschaftler für rotes Fleisch und Geflügel auf die Entwicklung von Strategien und Technologien zur Manipulation der Muskelentwicklung während der embryonalen und fetalen Entwicklung. Dieser Bereich ist weiterhin ein Schwerpunktbereich, da die Muskelfaserzahl in dieser Zeit festgelegt wird und die Grundlage für das zukünftige Wachstum bestimmt. Bei Geflügel zeigten zahlreiche Studien, dass die Ovo-Fütterung von Wachstumsfaktoren, Vitaminen oder anderen Nährstoffen die embryonale Muskel- und Darmentwicklung des Kükens verbesserte. Die Verbesserung der Ovo-Muskelentwicklung könnte der Geflügelindustrie zugute kommen, indem sie möglicherweise die Fleischausbeute, die Wachstumsrate oder die Myopathie beeinflusst. In den letzten fünf Jahren entwickelte das Gonzalez Laboratory an der University of Georgia ein Nicotinamid-Ribosid in der Ovo-Fütterungsmethodik für Masthähnchen-Embryonen, das die Muskelentwicklung veränderte. Wenn es in den Dottersack eines sich entwickelnden Embryos injiziert wurde, erhöhte Nicotinamid-Ribosid das Hauptmuskelgewicht und die Muskelfaserdichte des Pectoralis am Schlüpfen. Dieses Protokoll wird eine Methodik demonstrieren, um in Ovo-Fütterungsstudien unter Verwendung kommerzieller Standard- und Hochleistungs-Broiler-Embryonen genau und reproduzierbar durchzuführen. Diese Daten und Methoden werden es anderen Forschungsgruppen ermöglichen, in Ovo-Fütterungsstudien mit viel Erfolg und Reproduzierbarkeit durchzuführen.

Einleitung

Seit 1960 ist der Pro-Kopf-Verbrauch von Fleisch von Geflügel in den Vereinigten Staaten mit erstaunlicher Geschwindigkeit gestiegen, während andere primäre Proteinquellen stagniert, zurückgegangen sind oder minimal zugenommen haben. Die Geflügelindustrie investierte viel Zeit und Forschungsanstrengungen in die Optimierung von Ernährung und Genetik, um einen effizienten Vogel zu produzieren, der mit der Nachfrage Schritt halten kann. Da das Hauptziel der Geflügelindustrie darin besteht, Muskeln für die Umwandlung in Fleisch zu produzieren, haben ihre Bemühungen die ultimative Muskelmasse des Vogels bei der Ernte drastisch verändert.

Wie die meisten Arten entwickelt Geflügel Muskeln auf biphasische Weise. Die primäre Myogenese verwendet mesenchymale Stammzellen, um primäre Muskelfasern zu produzieren, die als Gerüst für die zweite Welle der Muskelfaserentwicklungdienen 1. Bei Geflügel tritt die primäre Myogenese während der embryonalen Tage 3 bis 8 und die sekundäre Myogenese von den Tagen 8 bis 212 auf. Einmal entwickelt, dienen primäre und sekundäre Muskelfasern als Grundlage für das gesamte zukünftige Muskelwachstum durch zelluläre Hypertrophie. Daher haben Wissenschaftler und Industrie erhebliche Anstrengungen unternommen, um die primäre und sekundäre Myogenese bei allen fleischproduzierenden Arten zu manipulieren, um den Fleischertrag zu maximieren.

Eine bei Geflügel erforschte Technologie, die als Ovo-Fütterung bezeichnet wird, beinhaltet die Fütterung von Verbindungen durch Injektion. In der Ovo-Fütterung, einer Technologie, die seit fast 40 Jahren von der Geflügelindustrie eingesetzt wird, wurde ursprünglich für die Impfstoffverabreichungentwickelt 3. Die Literatur dokumentiert, dass bei der Ovo-Fütterung verschiedener Verbindungen und Nährstoffe an verschiedenen Entwicklungsperioden und -stellen innerhalb der Eizelle die Entwicklung und das Wachstum der Ovo-Muskeln positiv beeinflusstwurden 4,5,6. Bis heute ist das Gonzalez Laboratory an der University of Georgia der Pionier bei der Verwendung von Nicotinamid-Ribosid in der Ovo-Fütterung, um die Muskelentwicklung von Geflügel zu manipulieren.

Nicotinamid-Ribosid, ein Pyridin-Nukleosid-Analogon von Vitamin B3, produziert NAD+ über den Heilungsweg7. Da dieser Signalweg weniger enzymatische Schritte zur Herstellung von NAD+ verwendet, ist die Produktion die effizienteste8. Gonzalez und Jackson9 zeigten, dass die Supplementierung des sich entwickelnden Broilerembryo-Dottersacks mit Nicotinamid-Ribosid das Hauptmuskelgewicht und die Muskelfaserdichte des geschlüpften Kükenpectoralis erhöhte. Dies wurde später von Xu et al.10 bestätigt, die herausfanden, dass eine Erhöhung der Nicotinamid-Ribosiddosis das Muskelgewicht erhöhte und die Muskelfaserdichte erhöhte. Diese ersten beiden Studien wurden in einem kommerziellen Masthähnchen durchgeführt. Da Masthähnchen mit hohem Ertrag ein signifikanteres genetisches Potenzial für die ultimative Muskelmassegröße besitzen, bestand das Ziel der Studie darin, die Auswirkungen der Nicotinamid-Ribosiddosis auf die Entwicklung und das Wachstum von Masthähnchen mit hohem Ertrag zu bestimmen.

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Protokoll

Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Georgia genehmigt.

1. Eizellinkubation und Behandlungsverabreichung

  1. Eizellbeschaffung und Behandlungszuweisung
    1. Erhalten Sie unbebrütetete, befruchtete ertragreiche Broiler-Eier und transportieren Sie sie ins Labor.
    2. Untersuchen und entsorgen Sie Eier, die als minderwertig eingestuft werden.
      HINWEIS: Beseitigen Sie unförmige Eier (rund, länglich, plattenseitig), rissig, schmutzig / fleckig, dünnschalig und faltig. Dies ist wichtig, um das Risiko von faulen Eiern zu minimieren.
    3. Weisen Sie einzelne Eiernummern zu, wiegen und zeichnen Sie Eierzahlen und Gewichte in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf.
    4. Verwenden Sie das Tabellenkalkulationssoftwareprogramm, um Eier nach Gewicht zu sortieren.
      1. Markieren Sie die Spalten Eierzahl und Eigewicht .
      2. Wählen Sie die Registerkarte Daten und dann Sortieren - Sortieren Sie Daten nach Eigewichten vom kleinsten zum größten.
        HINWEIS: Für die beste Schlupfrate verwenden Sie Eier mit einem Gewicht zwischen 40 und 70 g.
      3. Basierend auf dem Design des Experiments weisen Sie den Eiern (numerisch oder alphabetisch) eine Injektionsbehandlung und einen Tag der Euthanasie zu. Geben Sie die Behandlungsnummer und den Tag der Euthanasie in separaten Spalten ein und weisen Sie diese Faktoren nach dem Zufallsprinzip innerhalb jeder Schicht zu.
        HINWEIS: Für diese Veröffentlichung wurden Behandlungen nach dem Zufallsprinzip innerhalb jeder 8-Ei-Schicht zugewiesen.
    5. Generieren Sie eine PivotTable innerhalb des Tabellenkalkulationssoftwareprogramms, um sicherzustellen, dass jede Behandlung ein ähnliches Anfangseigewicht aufweist.
      1. Markieren Sie alle Daten in der zu analysierenden Kalkulationstabelle.
      2. Wählen Sie auf der Registerkarte Einfügen die Option PivotTable aus.
      3. Wählen Sie die unabhängige Variable (Spalte Tag der Euthanasie ) im Unterfenster PivotTable-Felder aus, und ziehen Sie sie in das Feld Zeilen .
      4. Wählen Sie die unabhängige Variable (Spalte Behandlung) im Unterfenster B aus, und ziehen Sie sie unter Tag der Euthanasie in das Feld Zeilen.
      5. Wählen Sie die abhängige Variable von Interesse (Eigewicht) aus und ziehen Sie sie in das Feld Werte .
      6. Ändern Sie die Wertfeldeinstellungen, indem Sie auf die abhängige Variable klicken und Wertfeldeinstellungen auswählen.
        1. Ändern Sie die Einstellung in Durchschnitt.
  2. Tray-Zuweisung
    1. Weisen Sie im Tabellenkalkulationsprogramm Eier einem Tablett zu (numerisch oder alphabetisch), sodass Behandlungen innerhalb eines Tabletts gleichmäßig dargestellt werden.
      1. Weisen Sie die ersten vier Eier mit zugewiesenen Behandlungen Tablett 1 zu. Weisen Sie die nächsten vier Eier Tablett 2 zu und fahren Sie fort, bis alle Eier einem Tablett zugewiesen sind.
        HINWEIS: Dieser Schritt hängt von der Anzahl der im Experiment verwendeten Inkubatoren und Tabletts ab.
  3. Stellen Sie mithilfe der PivotTable-Funktion sicher, dass alle Behandlungen gleichmäßig auf einem Tablett dargestellt werden.
    1. Markieren Sie alle Daten in der zu analysierenden Kalkulationstabelle.
    2. Wählen Sie auf der Registerkarte Einfügen die Option PivotTable aus.
    3. Wählen Sie die unabhängige Variable (Spalte Taskleiste ) im Unterfenster PivotTable-Felder aus, und ziehen Sie sie in das Feld Zeilen .
    4. Wählen Sie die abhängige Variable von Interesse (Eigewicht) aus und ziehen Sie sie in das Feld Werte .
    5. Ändern Sie die Wertfeldeinstellungen, indem Sie auf die abhängige Variable klicken und Wertfeldeinstellungen auswählen.
      1. Ändern Sie die Einstellung in Count.
  4. Inkubation
    1. Legen Sie die Eier in die entsprechende Inkubationsschale und bebrüten Sie sie bei 26,6 °C bei 40% ± 4% relativer Luftfeuchtigkeit für 6 h.
      HINWEIS: Einige Inkubatoren verfügen über Selbstüberwachungssysteme, die möglicherweise nicht ganz genau sind. Verwenden Sie andere Temperatur- und Feuchtigkeitsüberwachungsgeräte, um die Bedingungen zu steuern.
    2. Erhöhen Sie die Temperatur des Inkubators auf 37 °C bei 40 % ± 4 % relativer Luftfeuchtigkeit und halten Sie diese Bedingungen bis zum Inkubationstag 18 aufrecht.
      1. Um die richtige Inkubatortemperatur zu gewährleisten, messen Sie die Oberflächentemperaturen mehrerer Eier im gesamten Inkubator zweimal täglich mit einem thermischen Oberflächenthermometer, um sicherzustellen, dass die Oberflächentemperaturen 37 ° C betragen.
    3. Eier stündlich drehen, um sie neu zu positionieren.
    4. Erfassen Sie die Eigewichte täglich, um einen Gewichtsverlust von 10% -12,5% während der ersten 18,5 Tage der Inkubation sicherzustellen.
      HINWEIS: Wenn der Gewichtsverlust nicht im gewünschten Bereich liegt, passen Sie die Luftfeuchtigkeit an (erhöhen oder verringern).
  5. Inkubationstag-10 bei Ovo-Injektionen
    1. Berechnen Sie die Menge an Nicotinamid-Ribosid, die für jede Behandlung benötigt wird, unter Verwendung des Formelgewichts von 290,07 g / mol, wobei 100 μL Lösung in den Eigelbsack jedes Eies injiziert werden.
      HINWEIS: Sterile Kochsalzlösung (0,9%) wird als Verdünnungsmittel für alle Lösungen verwendet.
      Berechnung: 50 Eier × 100 μL = 5.000 μL (5 ml) Lösung benötigt. Auf 6 ml aufrunden, um sicherzustellen, dass genügend Lösung für die Injektion verfügbar ist (Abbildung 1).
      1. Sobald die Lösungen hergestellt sind, legen Sie sie in ein 37 ° C warmes Wasserbad, um sie auf der Temperatur der Eier zu halten.
    2. Eier nacheinander aus dem Inkubator nehmen und mit einem warmen Handtuch abdecken.
    3. Kerzenei, um den Dottersack zu lokalisieren und den Injektionsbereich mit 70% Ethanol zu reinigen.
    4. Führen Sie eine sterile 20 G, 2,54 cm Injektionsnadel ~ 1 cm in die Eierschale ein und injizieren Sie die zugewiesene Dosis in den Dottersack. Injizieren Sie die Eier aus der 0 mM Nicotinamid-Ribosid-Behandlung mit 100 μL steriler Kochsalzlösung (0,9%).
    5. Decken Sie die Injektionsstelle sofort mit einem kleinen Stück absolut wasserdichtem Klebeband ab, um einen übermäßigen Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden.
    6. Sobald alle Eier ihre Behandlung erhalten haben, legen Sie das Tablett zurück in den Inkubator.
    7. Nehmen Sie am 18. Inkubationstag Eier aus den Schalen und legen Sie sie entsprechend ihrer Behandlung in Brutkästen.
    8. Legen Sie Brutkästen in den Inkubator und erhöhen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60 ± 2%, bis alle Eier schlüpfen oder bis zum 23. Tag der Inkubation.
      HINWEIS: Wenn Eier beim Kandieren keinen Embryo enthalten, werfen Sie das Ei weg. Dies verhindert das Auftreten von faulen Eiern.

2. Euthanasie und Pectoralis major Muskelprobenentnahme

  1. Euthanasie für Küken
    1. Nehmen Sie am 18. Inkubationstag die embryonalen Eizellen aus dem Inkubator und legen Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur ab, um den Stoffwechsel zu stoppen. Entfernen Sie die Embryonen aus den Eiern, wiegen Sie ohne den Dottersack und enthaupten Sie dann. 12 h nach dem Schlüpfen, die Küken durch Exposition gegenüber CO2 für 10 min einschläfern, wiegen, schnell die Kronen-zu-Rumpf-Längenmessung sammeln und dann enthaupten.
      HINWEIS: Die Tatsache, dass der Vogel seinen Kopf nicht mehr hat, sorgt für Euthanasie.
    2. Betrachten Sie die folgenden Messungen (Schritte 2.1.2.1-2.1.2.4) mit digitalen Bremssätteln für Embryonen und Küken.
      1. Um die Kronen-zu-Rumpf-Länge zu bestimmen, legen Sie das Küken mit dem Kopf nach unten und den Beinen unter den Körper. Messen Sie von der Oberseite des Kopfes bis zum Schwanz.
      2. Um die Kopfbreite zu messen, messen Sie von einem Ohrloch zum anderen Ohrloch.
      3. Um die Kopflänge zu bestimmen, messen Sie von der Rückseite des Schnabels bis zur Rückseite des Schädels.
      4. Nehmen Sie eine nicht elastische Schnur und wickeln Sie sie von einem Ohrloch zum anderen um den Schädel, um den Kopfumfang zu messen. Platzieren Sie eine Zeichenfolge auf einem metrischen Lineal, um eine Messung zu erhalten.
    3. Sammeln Sie den Brustumfang, indem Sie eine Schnur um die Brust wickeln, unter der die Flügel den Körper berühren, und legen Sie die Schnur auf ein metrisches Lineal, um die Messung zu erhalten.
    4. Besprühen Sie die Brüste mit 70% Ethanol und ziehen Sie mit den Fingern an den Federn und der Haut, um die Hauptmuskeln des Pectoralis freizulegen , und nehmen Sie die Messungen (Schritte 2.1.4.1-2.1.4.2) mit digitalen Bremssätteln vor.
      1. Um die Brustbreite zu bestimmen, messen Sie über die Brust, wo die Flügel den Körper berühren.
      2. Um die Brustlänge zu bestimmen, messen Sie von der Unterseite des Schlüsselbeins bis zur Oberseite des Fettpolsters.
  2. Extraktion des Musculus pectoralis major , Messung und Sammlung
    1. Entfernen Sie mit einer chirurgischen Schere oder Skalpell und Pinzette den rechten Musculus pectoralis major , indem Sie entlang des Kielknochens schneiden und den Muskel von der Körperwand lösen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, den Musculus pectoralis minor nicht zu sammeln, indem Sie visuell erkennen, dass der Muskel auf dem Brustkorb verbleibt.
    2. Nachdem Sie den Musculus pectoralis major entfernt haben, legen Sie den Muskel flach auf einen Eis am Stiel und sammeln Sie die folgenden Messungen (Schritte 2.2.2.1-2.2.2.3) mit digitalen Bremssätteln.
      1. Um die Muskellänge zu bestimmen, messen Sie vom Schädel bis zum kaudalen Teil des Muskels.
      2. Um die Muskelbreite zu bestimmen, messen Sie am breitesten Teil des Schädelteils des Muskels.
      3. Um die Muskeldicke zu bestimmen, nehmen Sie die Brust mit einer Pinzette auf und messen Sie am dicksten Teil des Schädelteils des Muskels.
    3. Wenn gewünscht, lagern Sie diesen Muskel und den linken Musculus pectoralis major für weitere Analysen (wie Histologie, Protein- und Genexpression usw.) bis zu einem Jahr bei -80 ° C.

3. Statistik

  1. Analysieren Sie die Daten als vollständig randomisiertes Design mit Ei / Küken als Versuchseinheit.
    HINWEIS: Nicotinamid-Ribosid-Dosis (DOS) diente als feste Wirkung. Alle Daten wurden mit einer statistischen Analysesoftware analysiert (siehe Tabelle der Materialien), und paarweise Vergleiche zwischen den am wenigsten quadratischen Behandlungsmitteln wurden berechnet. Die Unterschiede wurden bei P < 0,05 als signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Es gab keine DOS-Effekte für das Körpergewicht von Tag-18-Embryonen und geschlüpften Küken (P > 0,52; Abbildung 2). Es gab keine DOS-Effekte für alle Embryo-18-Embryo-Pectoralis-Hauptmuskelmessungen (P > 0,24; Abbildung 3). Es gab keine DOS-Effekte für die Messungen der Hauptmuskellänge und -breite des geschlüpften Kükenpectoralis (P > 0,26); DOS beeinflusste jedoch das Muskelgewicht und die Muskeltiefe (

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Diskussion

Bis heute ist das Gonzalez Laboratory an der University of Georgia die einzige Gruppe, die positive Effekte von Nicotinamid-Ribosid in der Ovo-Fütterung auf die Entwicklung und das Wachstum von Pectoris-Hauptmuskeln nachgewiesen hat. Die erste Studie ergab, dass bei der Ovo-Fütterung von 250 mM Nicotinamid-Ribosid das Muskelgewicht und die Abmessungen erhöhte, wenn es in den Dottersack9 injiziert wurde. In der Folgestudie führte die Injektion einer Erhöhung der Nicotinam...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

Die Autoren danken Cobb Vantress, Inc. für die Spende der Eizellen und die technische Unterstützung bei der Eizellinkubation. Die Autoren danken ChromaDex, Inc. für die technische Unterstützung durch Nicotinamid-Ribosid.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Referenzen

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  10. Xu, X., Jackson, A. R., Gonzalez, J. M. The effects of in ovo nicotinamide riboside dose on broiler myogenesis. Poultry Science. 100 (3), 100926(2021).

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