Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Als Vektoren von Krankheitserregern wie ^Dengue1-, ^Zika2- und Chikungunya3-Viren sowie Malariaparasiten4 stellen Moskitos eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit des Menschen dar. Bei all diesen Erkrankungen liegt ein wesentlicher Schwerpunkt der Übertragungsintervention auf der Bekämpfung von Mückenvektoren. Die Untersuchung der Gene, die beispielsweise für die Permissivität gegenüber Krankheitserregern, die Fitness von Mücken, das Überleben, die Fortpflanzung und die Resistenz gegen Insektizide wichtig sind, ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Strategien zur Bekämpfung von Mücken. Für solche Zwecke wird die Genom-Editierung bei Moskitos zu einer gängigen Praxis, insbesondere mit der Entwicklung von Technologien wie HEs, ZFNs, TALENs und zuletzt CRISPR mit Cas9. Die Etablierung von geneditierten Stämmen beinhaltet typischerweise die Rückkreuzung von Individuen, die die gewünschten Mutationen für einige Generationen tragen, um Off-Target- und Gründer- (Engpass-) Effekte zu minimieren, gefolgt von der Kreuzung heterozygoter Individuen, um homozygote oder trans-heterozygote Linien zu erzeugen. In Ermangelung eines dominanten Markers ist in diesem Prozess eine molekulare Genotypisierung notwendig, da in vielen Fällen keine eindeutigen phänotypischen Merkmale für heterozygote Mutanten nachgewiesen werden können.

Obwohl die Sequenzierung der Goldstandard für die genotypische Charakterisierung ist, stellt die Durchführung bei Hunderten oder möglicherweise Tausenden von Individuen erhebliche Kosten, Arbeit und Zeit dar, die erforderlich sind, um Ergebnisse zu erzielen, was besonders für Organismen mit kurzer Lebensdauer wie Moskitos von entscheidender Bedeutung ist. Häufig verwendete Alternativen sind Surveyor Nuclease ^Assay5 (SNA), T7E1 ^Assay6 und High Resolution Melt Analysis (HRMA, überprüft ⁱⁿ⁷). Sowohl SNA als auch T7E1 verwenden Endonukleasen, die nur nicht übereinstimmende Basen spalten. Wenn eine mutierte Region des heterozygoten mutanten Genoms amplifiziert wird, werden DNA-Fragmente von mutierten und Wildtyp-Allelen geglüht, um eine nicht übereinstimmende doppelsträngige DNA (dsDNA) herzustellen. SNA erkennt das Vorhandensein von Mismatches über die Verdauung mit einer Mismatch-spezifischen Endonuklease und einer einfachen Agarosegelelektrophorese. Alternativ nutzt HRMA die thermodynamischen Eigenschaften von dsDNA, die durch dsDNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden, wobei die Dissoziationstemperatur des Farbstoffs je nach Vorhandensein und Art der Mutation variiert. HRMA wurde unter anderem für den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs)⁸, die mutierte Genotypisierung von Zebrafischen9, mikrobiologische ^{Anwendungen10} und pflanzengenetische ^Forschung11 eingesetzt.

Dieser Artikel beschreibt HRMA, eine einfache Methode der molekularen Genotypisierung für mutierte Moskitos, die durch die CRISPR / Cas9-Technologie erzeugt werden. Zu den Vorteilen von HRMA gegenüber alternativen Techniken gehören 1) Flexibilität, da sie sich für verschiedene Gene als nützlich erwiesen hat, eine breite Palette von Indelgrößen sowie die Unterscheidung zwischen verschiedenen Indelgrößen und heterozygoter, homozygoter und trans-heterozygoter Differenzierung12,13,14, 2) Kosten, da sie auf häufig verwendeten PCR-Reagenzien basiert, und 3) Zeitersparnis, da es in nur wenigen Stunden durchgeführt werden kann. Darüber hinaus verwendet das Protokoll einen kleinen Körperteil (ein Bein) als DNA-Quelle, so dass die Mücke den Genotypisierungsprozess überleben kann, was die Etablierung und Aufrechterhaltung von Mutantenlinien ermöglicht.

1. Scannen auf Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), HRMA-Primer-Design und Primer-Validierung

1. SNP-Identifizierung bei Wildtyp-Laborkolonienmücken
   1. Wählen Sie das Ziel-Exon aus, um die korrekte Polypeptid-Translation zu stören.
      ANMERKUNG: Das Ziel sollte in der Nähe des Startcodons oder unter den für die Proteinfunktion erforderlichen Schlüsselrückständen liegen. Je kürzer das Exon (z. B. ≤200 Basen), desto schwieriger ist es, es zu zielen und zu analysieren. Vermeiden Sie es, in der Nähe der Grenzen eines Exons zu editieren, da dies einen der HRMA-Primer zwingt, entweder ein Intron zu überqueren oder sich in einem Intron zu befinden. Dies ist unerwünscht, da die SNP-Raten in diesen Regionen tendenziell viel höher sind.
   2. Primer-Design
      1. Gehen Sie auf die NCBI Blast - Primer Blast ^Website15, kopieren Sie das ausgewählte Exon und fügen Sie es in das Feld oben auf der Seite | Wählen Sie die PCR-Produktgröße (stellen Sie sicher, dass sie den größten Teil des Exons umfasst) | Wählen Sie den Organismus.
      2. Klicken Sie auf Erweiterte Parameter | Entscheiden Sie sich (für PCR-Produkt Tm) und fügen Sie 60 (für eine optimale Temperatur von 60 ° C) | Holen Sie sich Primer. Behalten Sie die anderen Parameter als Standard bei.
   3. Erhalten Sie genomische DNA (gDNA) aus der Wildtyp-Laborkolonie. Legen Sie 10 Moskitos beiseite, betäuben Sie sie mit _CO2 und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis, um sie inaktiv zu halten. Stellen Sie 10 Röhrchen mit 0,5 μL des Reagenzes für die Freisetzung von DNA aus Gewebe und 20 μL Verdünnungspuffer auf, die beide in dem in der Materialtabelle vorgeschlagenen DNA-Freisetzungskit enthalten sind.
   4. Entfernen Sie ein Bein von einer einzelnen Mücke mit einer Pinzette und legen Sie es in ein entsprechendes Röhrchen einer verdünnten Lösung des DNA-Freisetzungsreagenzes (aus Schritt 1.1.3), wobei das Bein vollständig in die Lösung eingetaucht wird. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den verbleibenden Moskitos und wischen Sie die Pinzette mit 70% Ethanol ab, bevor Sie mit dem nächsten fortfahren.
   5. Die beinhaltige Lösung bei Raumtemperatur für 2-5 min, dann bei 98 °C für 2 min inkubieren und beim Einrichten der PCR-Reaktion abkühlen lassen.
      HINWEIS: Platten, die die freigesetzte gDNA enthalten, können bei -20 °C gelagert werden, und das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden.
   6. Bereiten Sie 10 Röhrchen mit 10 μL 2x PCR Master Mix, Primer auf eine Endkonzentration von 0,5 μM und Molekularwasser auf ein Endvolumen von 20 μL vor und übertragen Sie 1 μL der verdünnten Probe in jedes Röhrchen. PCR nach diesen Zyklusparametern durchführen: 98 °C 5 min, 40 Zyklen von 98 °C für 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s pro kb; Endausdehnung von 72 °C für 1 Min.
   7. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Enzym, um die verbleibenden PCR-Primer abzubauen und überschüssige dNTPs oder ein beliebiges Säulenreinigungskit zu dephosphorylieren. Fahren Sie mit der Sequenzierung der Proben fort.
   8. Analysieren Sie jedes Elektropherogramm auf das Vorhandensein von doppelten Peaks / mehrdeutigen Basen und passen Sie die Basisaufrufe in jeder Sequenz manuell mit dem entsprechenden entarteten Basiscode an.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss vor der Ausrichtung mehrerer Sequenzen ausgeführt werden, da es üblich ist, dass die Basisrufsoftware den prominenteren Peak als "echten" Basisaufruf auswählt, was den falschen Eindruck erweckt, dass keine SNPs vorhanden sind.
   9. Führen Sie eine Ausrichtung mit mehreren Sequenzen mit der Ausrichtungssoftware SeqMan Pro durch, die in der Materialtabelle aufgeführt ist, oder einer anderen Open-Source-Ausrichtungssoftware wie ClustalW16 oder T-Coffee17.
      1. Öffnen Sie die ausrichtungssoftware | Klicken Sie auf Sequenzen hinzufügen | Wählen Sie die gewünschten Sequenzen aus und klicken Sie auf Add | Sobald alle Sequenzen ausgewählt sind, klicken Sie auf Fertig.
      2. Klicken Sie auf Assemblieren , um die Ausrichtung durchzuführen. Um die Ausrichtung zu öffnen, klicken Sie auf Contig 1 und analysieren Sie die Ausrichtung und identifizieren Sie die SNPs (Abbildung 1).
         HINWEIS: Alternativ zu den Schritten 1.1.3-1.1.6 kann die PCR aus isolierter genomischer DNA durchgeführt werden, die aus Massenproben gewonnen wurde (abgeleitet von >10 Individuen). Sequenzierte Amplikone können direkt auf das Vorhandensein von SNPs analysiert werden, die als Doppelpeaks im Elektropherogramm erscheinen, obwohl seltene SNPs schwieriger zu erkennen sind.
   10. Entwurf 3-5 Single Guide RNAs (sgRNAs), Vermeidung von Regionen, die oben identifizierte SNP enthalten, gemäß dem ^unter18 beschriebenen Protokoll.
2. HRMA-Primer-Design
   1. Testen Sie die Exonsequenz auf die mögliche Bildung von Sekundärstrukturen während der PCR mit ^mFold19.
      1. Gehen Sie zum UNAFold Web Server | Klicken Sie auf mFold | Klicken Sie im Dropdown-Menü auf Anwendungen | DNA-Faltungsform.
      2. Geben Sie den Sequenznamen in das Feld ein und fügen Sie das Exon ein.
      3. Ändern Sie die Falztemperatur auf 60 °C; ändern Sie unter den ionischen Bedingungen [Mg⁺⁺] auf 1,5 und auf Einheiten auf mM; Klicken Sie auf DNA falten.
      4. Klicken Sie unter Ausgabe unter Struktur 1 auf pdf , um die kreisförmigen Strukturdiagramme zu öffnen.
   2. Gehen Sie zu NCBI Blast - Primer ^Blast15 für das Primer-Design.
   3. Kopieren Sie die ausgewählte Exon-Sequenz, die durch Sequenzierung in Schritt 1.1 ermittelt wurde (die Sequenz, die die niedrigste Anzahl von SNPs oder keine SNPs enthält), und fügen Sie sie in das Feld oben auf der Seite ein.
   4. Verwenden Sie das Symbol < > , um Sequenzen zu markieren und auszuschließen, die SNPs, den Zielstandort und Regionen mit möglicher Bildung von Sekundärstrukturen enthalten.
   5. Wählen Sie die PCR-Produktgröße zwischen 80 und 150 bp und wählen Sie den Organismus.
      HINWEIS: Größere Fragmentgrößen können erfolgreich verwendet werden (~300 bp). Längere Amplikone können jedoch die Empfindlichkeit zwischen Sequenzen verringern, die sich in einem oder nur wenigen Basenpaaren unterscheiden.
   6. Klicken Sie auf Primers abrufen. Wählen Sie 2-3 Paare von Primern aus, die getestet werden sollen (idealerweise sind Primer-Sites ≥20-50 bp von allen CRISPR-Zielstandorten entfernt).
3. Primer-Validierung
   1. Führen Sie eine Gradienten-PCR mit gDNA von einer einzelnen Person durch.
      1. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, und entfernen Sie eine Probe für das Nicht-Vorlagensteuerelement (NTC) in einem separaten Röhrchen. Fügen Sie die Vorlage dem verbleibenden Master-Mix hinzu und aliquot in eine 96-Well-Platte.
      2. Befolgen Sie die Zyklusparameter: 98 °C 30 s, 34 Zyklen von 98 °C für 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; Endausdehnung von 72 °C für 10 min.
      3. Generieren Sie thermische Schmelzeprofile nach den Parametern: Denaturierungsschritt 95 °C für 1 min, Glühen 60 °C für 1 min, Schmelzkurvenerkennung zwischen 75 °C und 95 °C in 0,2 °C-Schritten mit einer Haltezeit von 10 s bei jeder Temperatur.
         HINWEIS: Es sollten nur Glühtemperaturen mit einem einzigen thermischen Schmelzeprofil verwendet werden.
4. Fahren Sie fort, die Mutantenlinien mit Embryoneninjektionen wie ⁱⁿ¹² beschrieben zu erzeugen.

2. Herstellung von genomischer DNA aus Mückenbeinen

1. Trennen Sie die _G1-Mücken im Puppenstadium nach Geschlecht, damit sie sich vor der Genotypisierung nicht paaren, und stellen Sie sicher, dass altersangepasste Wildtyp-Kontrollmücken für Referenzen und Rückkreuzungen zur Verfügung stehen. Trennen Sie sie gleichermaßen nach Geschlechtern.
2. Sammeln Sie die benötigten Materialien (Abbildung 2A) und bereiten Sie eine 96-Well-PCR-Platte mit 0,5 μL des DNA-Freisetzungsreagenzes und 20 μL Verdünnungspuffer (aus dem gDNA-Freisetzungskit) pro zu genotypisierendem Individuum vor (Abbildung 2B) und lassen Sie es auf Eis liegen. Reservieren Sie zwei Reaktionen für NTC.
3. Beschriften Sie ein Tablett für Mückenfläschchen (Drosophila Fläschchen), so dass jede Vertiefung auf der 96er Platte dem jeweiligen Mückenfläschchen im Tablett entspricht.
4. Betäuben Sie die _G1-Mücken mit _CO2 und legen Sie sie in eine Glas-Petrischale, um sie sediert zu halten (Abbildung 2C, D). Betäuben Sie und legen Sie 8 Wildtyp-Moskitos in eine zweite Petrischale.
5. Wischen Sie eine Pinzette mit 70% Ethanol ab und entfernen Sie eines der Hinterbeine der Mücke (Abbildung 2E,F).
6. Tauchen Sie das Bein in die DNA-Freisetzungsreagenzlösung, legen Sie die Mücke in die entsprechende Durchstechflasche und schließen Sie sie mit einem Schwamm (Abbildung 2G, H).
7. Wischen Sie die Pinzette erneut mit 70% Ethanol ab und entfernen Sie das Bein von der nächsten Mücke. Wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.7, bis die 96-Well-Platte fertig ist.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Pinzette mit 70% Ethanol abzuwischen. Dies minimiert die DNA-Kreuzkontamination.
8. Versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattendichtung (Abbildung 2I) und inkubieren Sie die 96-Well-Platte, die die Beine enthält, bei Raumtemperatur (RT) für 2-5 min und dann bei 98 °C für 2 min. Lassen Sie die Platte während der Zubereitung der PCR-Mischung auf RT abkühlen.
   HINWEIS: Der gesamte Prozess dauert in der Regel 3-4 h. Wenn die Moskitos länger als die erwartete Dauer (insbesondere ≥1 Tag) in den Fläschchen aufbewahrt werden müssen, legen Sie bei jeder Mücke ein kleines Stück Rosine (oder eine Quelle für Zucker und Wasser) auf, um das Überleben der Moskitos während längerer Inkubationen zu gewährleisten.

3. HRMA

1. Führen Sie eine PCR durch.
   1. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, die die folgenden Komponenten pro Reaktion enthält: 10 μL 2x Puffer (aus dem gDNA-Freisetzungskit), 0,5 μM jeder Grundierung, 1 μL EvaGreen-Farbstoff, 0,4 μL Polymerase (aus gDNA-Freisetzungskit) und bis zu 19 μL mit molekularem Wasser.
   2. Übertragen Sie mit einem Mehrkanal-Pipett 19 μL des Master-Mixes in jede Vertiefung. 1 μL der in Abschnitt 2 hergestellten DNA-Freisetzungslösung, die Mücken-DNA enthält, auf die Platte übertragen (Abbildung 3A). Versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattendichtung.
   3. Führen Sie die PCR nach den Zyklusparametern durch: 98 °C für 5 min, 39 Zyklen von 98 °C für 10 s, die gewählte Glühtemperatur (72 °C) für 30 s; Endverlängerung 72 °C für 2 min.
2. Generieren Sie thermische Schmelzeprofile nach den Parametern: Denaturierungsschritt 95 °C für 1 min, Glühen 60 °C für 1 min, Schmelzkurvenerkennung zwischen 75 °C und 95 °C in 0,2 °C-Schritten mit einer Haltezeit von 10 s bei jeder Temperatur. Eine detaillierte Beschreibung des Software-Setups für HRMA-Ausführung mit dem CFX96-Echtzeitsystem finden Sie im Ergänzenden Material und in der ergänzenden Abbildung S1-S5 .
3. Untersuchen Sie die Schmelzeprofile (Abbildung 3B). Weisen Sie dem Referenzcluster ein Wildtype-Steuerelement zu.
   HINWEIS: Die Software (siehe Materialtabelle) normalisiert die Daten automatisch und bezeichnet Cluster mit Farben für verschiedene Schmelzekurven.
4. Markieren Sie die verschiedenen Cluster mit den entsprechenden Farben auf der 96-Well-Vorlage (Abbildung 3C).
5. Wählen Sie die Personen mit interessanten Kurven aus, entfernen Sie sie aus den Röhren, und kreuzen Sie sie zurück (Abbildung 3D). Füttern Sie die gepaarten Weibchen mit Blut und sammeln Sie _G2-Eier .

4. Sequenzverifikation durch Sanger-Sequenzierung

1. Reinigen Sie das PCR-Produkt aus den Vertiefungen mit ausgewählten Moskitos (von der in Abschnitt 3.1 vorbereiteten Platte), verwenden Sie ein Enzym, um die verbleibenden PCR-Primer abzubauen, und dephosphorylieren Sie überschüssige dNTPs. Alternativ können Sie ein beliebiges Spaltenbereinigungskit verwenden und mit der Sequenzierung der Proben fortfahren.
   HINWEIS: Die direkte Sequenzierung kann schwieriger sein, wenn die PCR-Produktgröße klein ist (≤200 bp). Entwerfen Sie in solchen Fällen Primer, um größere Fragmente, die die Zielstelle umfassen (≥250 bp), zu amplifizieren und durch PCR unter Verwendung der DNA in der 96-Well-Platte zu amplifizieren (Schritt 2.2).
2. Analysieren und identifizieren Sie die Indels mithilfe der Trace-Viewer-Software (Abbildung 4). Alternativ kann die Poly Peak Parser ^Software20 helfen, die Mutation bei heterozygoten Personen nachzuweisen.
   1. Gehen Sie zur Poly Peak Parser-Website, wählen Sie die Sequenz aus den mutierten Individuen im Menü Durchsuchen aus und kopieren Sie die Referenzsequenz und fügen Sie sie in das Feld ein.
      HINWEIS: Die Ausrichtung zwischen dem alternativen Allel und der Referenz wird automatisch auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt.

Moskitos, die Mutationen in den Genen AaeZIP11 (mutmaßlicher Eisentransporter21) und Myo-fem (ein weiblich voreingenommenes Myosin-Gen im Zusammenhang mit Flugmuskeln13) enthalten, wurden mit der CRISPR/Cas9-Technologie gewonnen, mit HRMA genotypisiert und sequenzverifiziert (Abbildung 5). Abbildung 5A und Abbildung 5C zeigen die normalisierte Fluoreszenzintensität aus den HRM-Kurven aus AaeZIP11- bzw. Myo-Fem-Mutantenproben zusammen mit Wildtyp-Kontrollen. Abbildung 4B und Abbildung 4D zeigen die Vergrößerung der Differenzkurven (aus den AaeZIP11- bzw. Myo-fem-Mutantenproben) zwischen den Schmelzprofilen der verschiedenen Cluster, die von der Software nach Abzug jeder Kurve von der Wildtypreferenz zugewiesen wurden. Heterozygote und homozygote mutierte AaeZIP11-Individuen wurden in verschiedenen Clustern platziert und sind leicht von den Wildtyp-Kontrollen zu unterscheiden (Abbildung 5B). Heterozygote mutierte Myo-Fem-Individuen unterscheiden sich ebenfalls von den Kontrollen (Abbildung 5D). Beachten Sie, dass in beiden Fällen zwei Cluster innerhalb der Wildtyp-Kontrollen vorhanden waren, höchstwahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von SNPs in der Zielregion (Abbildung 5), was die Notwendigkeit unterstreicht, mehrere Kontrollproben zu verwenden, um die Kategorisierung von Kontrollen als Mutanten zu vermeiden, wenn SNPs nicht vermieden werden können.

Abbildung 4A zeigt die Sequenzanalyse der AaeZIP11-Mutante . Das Elektropherogramm von AaeZIP11 heterozygoten Mutanten zeigt die Nukleotidposition an, in der der Indel aufgetreten ist. Dies wird durch eine Verschiebung von Einzel- zu Doppelpeaks dargestellt, da polymorphe Positionen beide Nukleotide gleichzeitig zeigen (Abbildung 4A). Die Anzahl der gelöschten oder eingefügten Basenpaare wurde berechnet, indem die einzelnen Peaks am Ende des Laufs gezählt wurden (Abbildung 4B), da einer der DNA-Stränge kürzer oder länger ist als der andere um die Anzahl der basenpaare, die gelöscht bzw. eingefügt wurden. Es wird empfohlen, sequenzverifizierte gDNA aus den Mutanten als Referenz für die Identifizierung der Heterozygoten zu verwenden, um HRMA-Analysen für nachfolgende Generationen zu unterstützen. Eine manuelle Zuweisung für die Kurven kann erforderlich sein, wenn ähnliche Kurven automatisch verschiedenen Clustern zugewiesen werden. Dies kann durch den Vergleich der temperaturverschobenen Kurven und Differenzkurven erfolgen. Möglicherweise ist eine manuelle Anpassung der Software erforderlich, um Samples den Clustern ordnungsgemäß zuzuordnen. HRMA-Ergebnisse von AaeZIP11 und einer Mutante namens Aeflightin zeigen, dass individuelle Probenanalysen erforderlich waren, um Heterozygoten, Homozygoten und Transheterozygoten erfolgreich zu kategorisieren. Anfangs konnte die automatische Clusterzuweisung aus der Software keine richtige Unterscheidung zwischen den Gruppen treffen (Abbildung 6A, Abbildung 6C, Abbildung 6E und Abbildung 6G). Jede Probe wurde dann einzeln analysiert und den richtigen Gruppen zugeordnet, basierend auf der Ähnlichkeit mit Referenzproben von Heterozygoten, Homozygoten und Trans-Heterozygoten (zuvor durch Sequenzierung verifiziert) (Abbildung 6B, Abbildung 6D, Abbildung 6F und Abbildung 6H).

Abbildung 1: SNP-Identifikation. Schematische Darstellung der Ausrichtung mehrerer Sequenzen des AaeZIP11-Fragments aus wild-type. In Rot sind die SNPs, und in Grün sind die Fragmente frei von SNPs; Diese sNP-freie Region wird für das sgRNA- und Primer-Design vorgeschlagen. Abkürzungen: SNP = Single Nucleotide Polymorphism; sgRNA = Einzelleiter-RNA; LVP = Liverpool-Stamm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Experimentelles Verfahren zur Gewinnung genomischer DNA aus Mückenbeinen für HRMA. (A) Materialien zur Gewinnung genomischer DNA, einschließlich Pipetten, Spitzen, PCR-Platte, optisches Siegel, Reservoir, Verdünnungspuffer und DNA-Freisetzungslösung. (B) PCR-Plattenpräparat mit DNA-Freisetzungsreagenz und Verdünnungspuffer. (C) Mückenanästhesie mit CO2. (D) Abwischen der Pinzette mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden. (E) Versuchsaufbau mit Pinzette, Gestell für Mückenfläschchen, Petrischale auf einem Eisbehälter mit betäubten Moskitos und der zuvor vorbereiteten PCR-Platte. (F) Entfernung des Mückenbeins. (G) Zoom-Ansicht des Mückenbeins, das in die DNA-Freisetzungsreagenzlösung eingetaucht wird. H) Einzelne Mücke in der Durchstechflasche. (I) Versiegelung der PCR-Platte mit den Mückenbeinen. Abkürzung: HRMA = High-Resolution Melt Analysis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Experimentelle Vorgehensweise für HRM-Analysen. (A) Übertragung der freigesetzten gDNA auf eine 96-Well-Platte, die die PCR-Mischung enthält. (B) Sichtprüfung der Differenzkurven. (C) Markieren jeder Probe auf der 96-Well-Schablone mit der gleichen Farbe wie die jeweilige Differenzkurvenfarbe. (D) Rückkreuzung der Individuen aus demselben Cluster. Abkürzungen: HRM = high-resolution melt; gDNA = genomische DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Sequenzanalyse einer AaeZIP11-Mutante . (A) Nukleotid-Alignment der AaeZIP11Δ56-Mutante. Gelb hervorgehobene Bindestriche sind die gelöschten Basen. In der Box geht das Elektropherogramm von einzelnen Peaks zu doppelten Peaks über und zeigt die Position an, an der die Deletion stattgefunden hat (Pfeil). (B) Elektropherogramm des Endes des Sequenzierungslaufs und des Übergangs von Double Peaks zu Single Peaks. Beachten Sie, dass die Anzahl der einzelnen Peaks die Anzahl der gelöschten Basen darstellt (graues Rechteck). Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: HRMA von DNA, die aus Mückenbeinen extrahiert wurde. DNA wurde aus einem einzigen Bein aus AaeZIP11 (A und B) und Myo-Fem (C und D) Knockout Ae. aegypti Moskitos extrahiert und von HRMA analysiert. A und C bezeichnen die normierten Fluoreszenzsignale der Proben auf Relativwerte von 1,0 bis 0. B und D bezeichnen die Vergrößerung der Kurvendifferenzen, indem jede Kurve von der Wildtypreferenz (Liverpool-Dehnung) subtrahiert wird. Abkürzungen: HRMA = high-resolution melt analysis; LVP = Liverpool-Stamm; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Beispiele für manuelle Gruppenzuordnungen. (A-D) HRMA für Aeflightin-Mutanten. (A und C) Schmelzekurven (normalisierte lineare Skalenkurven bzw. Differenzkurven) werden automatisch von der Precision Melt Analysis Software gruppiert. (B) Normalisierung von Differentialkurven, die manuell geändert wurden. (D) Nach Änderung der Normalisierung der Differentialkurven wurde jede Probe individuell durch die Spitzentemperaturen in den Differenzkurven für entsprechende Positivkontrollen (zuvor sequenzierte Proben, die durch Δ4- und Δ5-Heterozygoten und Δ4Δ5-Transheterozygoten identifiziert wurden) zugeordnet, was die eindeutige Identifizierung der 3 Gruppen ermöglichte. Rote und braune Pfeile werden hinzugefügt, um die Gipfel bei verschiedenen Temperaturen hervorzuheben. (E-H) HRMA für AaeZIP11-Mutanten. (E und G) Schmelzekurven werden von der Software automatisch zugewiesen. (F und H) Mutanten in der zweiten heterozygoten Selbstkreuzung wurden durch die Ähnlichkeit der normalisierten und Differenzkurven zu zuvor bestimmten Referenzen (farbcodiert in Kurven) den richtigen Gruppen zugeordnet. Heterozygotes asg, Homozygotes asg und Trans-heterozygotes asg: zugewiesene Schmelzkurven von precision melt analysis software. Abkürzungen: HRMA = high-resolution melt analysis; LVP = Liverpool-Stamm; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten. Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle S1 enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Material: Detailliertes Protokoll zur Einrichtung von HRMA im CFX96 Real-Time System (z.B. Bio-rad).

Ergänzende Abbildung S1: Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Einrichten des Zyklusprotokolls auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 2.1-2.3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Einrichtung einer Platte auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 3.1-3.4. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Schritt-für-Schritt-Anleitung für eine Platteneinrichtung auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 3.5-3.6. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Run-Setup auf Bio-rad CFX Manager. Siehe Ergänzendes Material 4.1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S5: Schritt-für-Schritt-Anleitung für die HRMA-Analyse auf Bio-rad CFX Manager. Siehe ergänzendes Material 5.1-5.3. Abkürzung: HRMA = High-Resolution Melt Analysis. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Liste der Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.