Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Zusammenfassung

Die rollende Adhäsion, die durch selektinvermittelte Wechselwirkungen erleichtert wird, ist eine hochdynamische, passive Motilität bei der Rekrutierung von Leukozyten an der Entzündungsstelle. Dieses Phänomen tritt in postkapillaren Venolen auf, wo der Blutfluss Leukozyten in einer rollenden Bewegung auf die Endothelzellen drückt. Stabiles Walzen erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Bildung von Adhäsionsbindungen und deren mechanisch angetriebener Dissoziation, so dass die Zelle während des Walzens in Strömungsrichtung an der Oberfläche befestigt bleibt. Im Gegensatz zu anderen Adhäsionsprozessen, die in relativ statischen Umgebungen ablaufen, ist die Rolladhäsion hochdynamisch, da sich die Rollelzellen mit mehreren zehn Mikrometern pro Sekunde über Tausende von Mikrometern bewegen. Konventionelle mechanoologische Methoden wie die Zugkraftmikroskopie sind daher aufgrund der kurzen Zeitskala und der erforderlichen hohen Sensitivität ungeeignet, um die einzelnen Adhäsionsereignisse und die damit verbundenen molekularen Kräfte zu messen. Hier beschreiben wir unsere neueste Implementierung des Adhäsions-Footprint-Assays zur Abbildung des P-Selektins: PSGL-1-Wechselwirkungen in der rollenden Adhäsion auf molekularer Ebene. Diese Methode verwendet irreversible DNA-basierte Spannungsmessstreifenbinder, um eine permanente Historie molekularer Adhäsionsereignisse in Form von Fluoreszenzspuren zu erzeugen. Diese Spuren können auf zwei Arten abgebildet werden: (1) Zusammenfügen von Tausenden von beugungsbegrenzten Bildern, um ein großes Sichtfeld zu erzeugen, das die Extraktion des Adhäsionsfußabdrucks jeder rollenden Zelle über Tausende von Mikrometern Länge ermöglicht, (2) Durchführen von DNA-PAINT, um hochauflösende Bilder der Fluoreszenzspuren in einem kleinen Sichtfeld zu rekonstruieren. In dieser Studie wurde der Adhäsions-Footprint-Assay verwendet, um HL-60-Zellen zu untersuchen, die bei verschiedenen Scherspannungen rollen. Dabei konnten wir die räumliche Verteilung der P-Selektin:PSGL-1-Wechselwirkung abbilden und durch fluoreszenzintensität Einblick in ihre molekularen Kräfte gewinnen. Damit liefert diese Methode die Grundlage für die quantitative Untersuchung der verschiedenen Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen, die an der Rolladhäsion auf molekularer Ebene beteiligt sind.

Einleitung

Die rollende Adhäsionskaskade beschreibt, wie zirkulierende Zellen an die Blutgefäßwand binden und entlang dieser ^rollen1. Passives Walzen wird hauptsächlich durch Selectine vermittelt, eine Hauptklasse zellulärer Adhäsionsmoleküle (CAMs)¹. Unter dem Scherfluss des Blutes bilden Leukozyten, die P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL-1) exprimieren, hochtransiente Bindungen mit P-Selektin, die auf der Oberfläche entzündeter Endothelzellen exprimiert werden können. Dieser Prozess ist entscheidend dafür, dass Leukozyten an einen Ort der Entzündung ^wandern2. Darüber hinaus ist PSGL-1 auch ein mechanos....

Protokoll

1. Oligonukleotid-Markierung und Hybridisierung

1. Reduktion von Protein G Disulfidbindungen
   1. Lösen Sie 10 mg Protein G (ProtG) in 1 ml Reinstwasser auf.
      HINWEIS: Das Protein G ist hier mit einem einzelnen Cysteinrest am C-Terminus und einem N-Terminus-Polyhistidin-Tag modifiziert.
   2. Pufferaustausch ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) in 1x PBS (pH 7,2) mit einer P6-Säule.
   3. Messen Sie die Proteinkonzentration nach dem Pufferaustausch.
      ANMERKUNG: Typische Konzentration von 7-8 mg/ml.
   4. Herstellen von 120 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) durch Lösen von 3 mg TCEP in 90 μL 1x PBS (pH 7,2), gefolgt von 10 μL 0,5 M....

Ergebnisse

Das obige Protokoll beschreibt das experimentelle Verfahren des Adhäsion Footprint Assays. Der allgemeine Experimentablauf ist in Abbildung 1 dargestellt, von der Durchflusskammeranordnung (Abbildung 1A) über die Oberflächenfunktionalisierung (Abbildung 1B) bis hin zu den Experiment- und Bildgebungsschritten (Abbildung 1C).

Abbildung 2 ist ein re.......

Diskussion

Der Adhäsions-Footprint-Assay ermöglicht die Visualisierung der molekularen Adhäsionsereignisse zwischen PSGL-1 und P-Selektin während der Zellrollenadhäsion. Dieser Prozess wird durch P-Selektin-vermittelte Erfassung eingeleitet, gefolgt von einem Walzen unter fluidischer Scherspannung. Mögliche Probleme während des Experiments beinhalten in der Regel ein schlechtes Zellrollen oder fehlende fluoreszierende Spuren, selbst wenn die Zellen gut rollen. Diese Probleme resultieren häufig aus Qualitätskontrollen an den kritisc.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4-Kanal-Bohrschablone	Maßanfertigung		3D-gedruckt mit ABS-Filament
4-Loch-Schiene	, Maßanfertigung		: Bohren Sie saubere Mikroskopschiene mit einem Dremel mit diamantbeschichteten Bohrern auf einer 4-Kanal-Bohrführung, deren Layout mit den Zentren der 8-32 Gewindelöcher an der Aluminiumklemme übereinstimmt.
Aceton	VWR	BDH1101-4LP
Acryl Abstandhalter	Sonderanfertigung		Schneiden Sie zwei Blöcke Acrylplatten mit den Maßen 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Bohren Sie auf jedem Block zwei 3-mm-Löcher, die genau mit den 4-40 Löchern auf dem Aluminiumhalter ausgerichtet sind.
	Sonderanfertigung		Maschinenförmiger eloxierter Aluminiumblock zu einem C-förmigen Halter mit den Außenmaßen von 640 mm x 500 mm x 65 mm und den Öffnungsmaßen 400 mm x 380 mm x 65 mm. Ein- und Auslässe sind mit 8-32 Gewinde versehen.
Aminosilan	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotische / antimykotische Lösung	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strepto/Fungiezone
Beads, ProtG beschichtetes Polystyrol	Spherotech	PGP-60-5
Rinderserumalbumin	VWR	332
Puffer, DNA PAINT			0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA-Puffer
, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Puffer, Rollierender			HBSS mit 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1% BSA-Puffer
, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20
Calciumchlorid	VWR	BDH9224
Zellkulturflaschen	VWR	10062-868
Konzentrierte Schwefelsäure	VWR	BDH3072-2,5LG	95-98%
Deckglas-Haltepinzette	Techni-Tool	758TW150
Diamantbeschichteter Bohrer Bits	Schleiftechnologie	C5250510	0,75 mm Diamantbohrer-DNA
, Amin-ssDNA (oberer Strang)	IDT DNA	Custom Oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (unterer Strang)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCCCCGG
DNA, Imager-Strang für DNA-PAINT	IDT DNA	Custom	oligo GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, Imager-Strang für die dauerhafte Markierung	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Doppelseitiges Klebeband	Scotch	237	3/4 Zoll Breite, permanentes doppelseitiges Klebeband
EDTA	Thermofisher	15575020	0,5 M EDTA, pH 8,0
Epoxy	Gorilla	42001	5 Minuten Aushärtungszeit
Fötales Rinderserum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Eisessig	VWR	BDH3094-2.5LG
Glas, Deckgläser	Fisher Scientific	12-548-5P
Glas, Objektträger	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glas, Färbeglas	VWR	74830-150	Wheaton Färbeglas (900620)
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hämozytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 Zellen	ATCC	CCL-240
Feuchtekammer-Objektträgerhalterung	Maßgeschneiderte		3D-gedruckt mit ABS-Filament
Wasserstoffperoxid	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Einlässe/Auslässe	Sonderanfertigungen		Bohren Sie mit Kobaltbohrern durch acht Stellschrauben 8-32. Einsatz 1,5 cm  Polyethylenschlauch (Tygon, I.D. 1/32" O.D. 3/32") in jede hohle Stellschraube
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesiumchlorid	VWR	BDH9244
Magnetische Ni-NTA-Kügelchen	Invitrogen	10103D
Versandhülsen	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gelsäulen	Biorad	7326200	In SSC Puffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-Biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Kaliumhydroxid	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-Terminus His-Tag und C-Terminus
Cysteinprotein, P-Selektin-Fc	R& D-System	137-PS	Rekombinantes humanes P-Selectin/CD62P Fc-Chimärenprotein,
CF-Protein, Streptavidin	Cedarlan	CL1005-01-5MG
Pumpenspritze	Harvard-Gerät	704801
Natriumbicarbonat	Ward' s Science	470302-444
Natriumchlorid	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
	Spritze Hamilton	81520	Spritzen mit PTFE-Luer-Lock, 5 mL
Spritzennadeln	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Zoll Länge
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Schlauch, Adapter	Tygon	ABW00001	Formulierung 3350, Innendurchmesser 1/32"; Außendurchmesser 3/32"
Schlauch, Polyethylen	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) Innendurchmesser 0,38 mm; Außendurchmesser 1,09 mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773

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