Method Article

Eine nicht-degradative Extraktionsmethode zur Charakterisierung der molekularen Struktur von bakteriellen Glykogenpartikeln

DOI:

10.3791/63016

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February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die bakterielle Glykogenstruktur wird durch Extraktionsmethoden stark beeinflusst, was zu molekularem Abbau und/oder verzerrter Probenahme führen kann. Es ist wichtig, Methoden zu entwickeln, um diese Probleme zu minimieren. In dieser Arbeit wurden vier Extraktionsmethoden verglichen, wobei die Größenverteilung und die Kettenlängenverteilung als Schlüsselkriterien für die Minimierung von Extraktionsartefakten herangezogen wurden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Derzeit gibt es eine Vielzahl von Glykogen-Extraktionsmethoden, die entweder die räumliche Struktur des Glykogens schädigen oder Glykogen nur teilweise extrahieren, was zu einer verzerrten Charakterisierung der feinen molekularen Struktur des Glykogens führt. Um die dynamischen Veränderungen der Glykogenstrukturen und die vielseitigen Funktionen von Glykogenpartikeln in Bakterien zu verstehen, ist es unerlässlich, Glykogen mit minimalem Abbau zu isolieren. In dieser Studie wird eine milde Glykogenisolationsmethode unter Verwendung von Kaltwasserfällung ( CW) mittels Zuckerdichtegradienten-Ultrazentrifugation (SDGU-CW) demonstriert. Zum Vergleich wurden auch die traditionelle Methode der Trichloressigsäure (TCA) und der Kaliumhydroxid (KOH)-Methode durchgeführt. Ein häufig verwendeter Laborstamm, Escherichia coli BL21(DE3), wurde in dieser Studie zu Demonstrationszwecken als Modellorganismus verwendet. Nach Extraktion von Glykogenpartikeln mit verschiedenen Methoden wurden deren Strukturen mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) für die Partikelgrößenverteilung und Fluorophor-gestützter Kapillarelektrophorese (FACE) für lineare Kettenlängenverteilungen analysiert und verglichen. Die Analyse bestätigte, dass das über SDGU-CW extrahierte Glykogen nur einen minimalen Abbau aufwies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glykogen ist ein stark verzweigtes Polysaccharid, das aus Glucosylresten und auch einer kleinen, aber signifikanten Menge an Proteinen besteht, bei denen alle Glucosylreste über α-1,4-glykosidische Bindungen in linearen Ketten und α-1,6-glykosidische Bindungen an den Verzweigungspunkten1 miteinander verknüpft sind. Die Struktur von Glykogenpartikeln wird im Allgemeinen in drei Hierarchien unterteilt: 1) kurzkettige Oligomere, 2) kugelförmige β Partikel (~20 nm Durchmesser) und 3) große rosettenförmige α Partikel, die durch β Partikel zusammengeballt werden, deren Durchmesser ungefähr bis zu 300 nm reicht. Kürzlich wurde festgestellt, dass Glykogen α Partikel in Eukaryoten zwei strukturelle Zustände aufweisen, d.h. einen fragilen und einen stabilen Zustand. Unter Fragilität versteht man hier die Dissoziation von größeren α Partikeln in kleinere β Partikel in Gegenwart eines chaotropen Mittels wie DMSO2. Weitere Analysen ergaben, dass Glykogen-α-Partikel in der diabetischen Leber durchweg fragilsind 3 und die fragilen α-Partikel viel schneller abgebaut werden als stabile α-Partikel4. Daher kann die strukturelle Fragilität des Glykogens hyperglykämische Zustände bei Diabetesverschlimmern 2,4, was fragile α-Partikel zu einem potenziellen pathologischen Biomarker für Diabetes auf molekularer Ebene macht. Über das Vorhandensein von Glykogen-α-Partikeln in Prokaryoten wird jedoch nur sporadisch berichtet5, und es gibt keine Berichte über die zwei unterschiedlichen Strukturzustände von Glykogen-α-Partikeln in Bakterien.

Um die physiologischen Funktionen bakterieller Glykogenpartikel zu verstehen, ist es wichtig, die Feinstruktur von Glykogenmolekülen zu bestimmen, die eine Glykogenisolierung mit maximaler Ausbeute und minimalem Abbau erfordert1. Bisher wurden verschiedene Techniken für die Glykogenextraktion entwickelt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Heißwasserextraktion, die Extraktion von Trichloressigsäure (TCA) und die Extraktion von heißalkalischen (Kaliumhydroxid, KOH)6. Darüber hinaus wurde eine andere Methode, die häufig für die Isolierung eukaryotischer Glykogen verwendet wird, die Zuckerdichtegradienten-Ultrazentrifugationsmethode (SDGU), auch für die Isolierung von bakteriellen Glykogen in Selenomonas ruminantium und Fibrobacter succinogenes berichtet 7,8. Obwohl die Vor- und Nachteile dieser Methoden in eukaryotischen Studien ausführlich diskutiert wurden 9,10, gibt es selten vergleichende Studien von Glykogen-Feinstrukturen, die mit verschiedenen Extraktionsmethoden in Bakterien aus der Perspektive der Glykogenpartikelstrukturen isoliert wurden.

In dieser Studie wurde dieses Problem anhand von Escherichia coli BL21(DE3) als Modellorganismus gelöst. Insgesamt wurden vier Glykogen-Extraktionsmethoden verglichen, nämlich die TCA-gefällte Heißwasserextraktion (TCA-HW), DIE TCA-gefällte Kaltwasserextraktion (TCA-CW), die Extraktion mit heißer 30%iger KOH-Lösung (KOH-HW) und die Kaltwasserextraktion mittels Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (SDGU-CW). Die Größenverteilung der Glykogenpartikel wurde dann mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) gemessen, während die Kettenlängenverteilung mittels Fluorophor-gestützter Kohlenhydratelektrophorese (FACE) nachgewiesen wurde, die beide zur Beurteilung der Qualität der Extraktionsmethoden verwendet wurden. Darüber hinaus wurden auch die Stabilität und Fragilität von bakteriellen Glykogen- α Partikeln zwischen den verschiedenen Extraktionsmethoden verglichen, indem die Partikelgrößenverteilung vor und nach der Behandlung mit dem häufig verwendeten Chaotropikum Dimethylsulfoxid (DMSO) verglichen wurde. Im Folgenden werden die detaillierten Verfahren zur Glykogenextraktion und strukturellen Charakterisierung vorgestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die SDGU-CW-Methode die beste Gesamtwirkung in Bezug auf die strukturelle Integrität des Glykogens hat und daher in zukünftigen relevanten Studien für die bakterielle Glykogenextraktion empfohlen wird.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakterienkultur und -sammlung

  1. Reanimieren Sie E. coli BL21(DE3) aus bakteriellem Glycerinbestand (-80 °C) durch Beimpfen einer sterilen LB-Agarplatte (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl und 15 g/l Agar). Stellen Sie die Platte in einen normalen Inkubator und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
  2. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie und inokulieren Sie sie in ein steriles 10 ml steriles LB-Flüssigmedium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl). Durch Vortexen gut mischen und über Nacht bei 37 °C kultivieren und bei 220 U/min schütteln.
    HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, betrugen alle Flüssigkulturbedingungen 37 °C mit einer Schüttelrate von 220 U/min.
  3. 1 ml der E. coli-Kultur über Nacht in 100 ml steriles LB-Flüssigmedium überführen und 5 Stunden lang kultivieren. 50 mL auf 1 l 1x M9 minimales Medium (3 g/LKH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na2HPO4 und 1 g/L NH4Cl) mit 0,8 % D-(+)-Glukose übertragen. Gut mischen und 20 Stunden lang kultivieren.
    HINWEIS: 1x M9 Minimalmedium und Glukose wurden getrennt sterilisiert und dann beim Abkühlen auf Raumtemperatur aseptisch gemischt.
  4. Nach 20 h Kultivierung die Bakterienlösung bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Lagern Sie das Zellpellet über Nacht bei -80 °C und trocknen Sie das Pellet anschließend gefrier.
  5. Verschließen Sie das lyophilisierte Bakterienpulver und bewahren Sie es für die spätere Verwendung im Kühlschrank (-20 °C) auf.

2. Glykogen-Extraktion

  1. Extraktion von Trichloressigsäure mit gefälltem Heißwasser (TCA-HW)
    1. Wiegen Sie 500 mg gefriergetrocknetes E. coli BL21 (DE3)-Pulver genau ab und resuspendieren Sie es in 20 ml eiskaltem 0,05 M Triethanolamin (TEA)-Puffer. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zellbrecher (25 % Energie, 4 °C), um Bakterienzellen 3 Minuten lang aufzubrechen (30 s Arbeitszyklen und 2 s Intervalle). Stellen Sie sicher, dass sich keine offensichtlichen Pellets in der Lösung befinden.
      HINWEIS: Der Zellaufschluss wurde auf dem Eis durchgeführt. Stellen Sie den pH-Wert des TEA-Puffers durch HCl-Zugabe auf pH 7 ein und lagern Sie ihn bei Raumtemperatur.
    2. Übertragen Sie das gesamte bakterielle Homogenat in zwei 10,4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen (10 ml/Röhrchen). Füllen Sie die Röhrchen bis zum Rand mit entionisiertem Wasser und zentrifugieren Sie bei 104.000 x g in einer Ultrazentrifuge bei 4 °C für 90 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Fügen Sie 2 mL deionisiertes Wasser hinzu, um das Pellet in jedem Röhrchen wieder zu suspendieren. Die Suspension in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und deionisiertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 ml hinzufügen. Erhitzen und 5 Minuten kochen lassen, um alle Proteine zu denaturieren.
    4. Die Suspension wird 10 min lang bei 18.000 x g zentrifugiert und der Überstand (S1) bleibt erhalten. Behandeln Sie den Niederschlag auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.1.3. Den neuen Überstand (S2) mit S1 zusammenfassen.
    5. Geben Sie 50 % TCA (0,1 Volumen) zum Überstand (S1+S2) und legen Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis, um Makromoleküle wie DNA, RNA, Proteine usw. auszufällen. Das Gemisch wird bei 18.000 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand mit 1,5 Volumenprozent absolutem Ethanol vermischt.
      HINWEIS: Die Konzentration von TCA beträgt 50 % v/v. Halten Sie es zur Aufbewahrung lichtgeschützt.
    6. Glykogen 20 min auf Eis ausfällen und 10 min bei 18.000 x g zentrifugieren. Überstand ausgießen.
    7. Das Pellet wird in 5 mL ddH2O aufgelöst und anschließend 5 mL eiskaltes absolutes Ethanol hinzugefügt. Die Lösung über Nacht bei 4 °C inkubieren und 10 min bei 18.000 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf.
    8. Wiederholen Sie die Schritte "Waschen und Ausfällen" wie in Schritt 2.1.7 noch zwei weitere Male.
    9. Zum Schluss wird das gefällte Glykogen in 400 μl ddH2O in einem 2-ml-Röhrchen gelöst, bei -80 °C vorgefroren und gefriergetrocknet, um trockenes Glykogenpulver zu erhalten.
  2. Trichloressigsäure gefällte Kaltwasserextraktion (TCA-CW)
    ANMERKUNG: Die TCA-CW-Methode ist die gleiche wie die TCA-HW-Methode, mit der Ausnahme, dass das Pellet nach dem Verwerfen des Überstands ohne Sieden behandelt wird (siehe Schritt 2.1.3) und in 20 ml ddH2O mit 1 mg/ml Proteasehemmer-Cocktail resuspendiert wird.
    1. Zur Herstellung einer Proteasehemmer-Cocktaillösung von 1 mg/ml lösen Sie 50 mg Proteasehemmer-Cocktail in 1 ml deionisiertem Wasser auf und verdünnen Sie es im Verhältnis 50:1 (deionisiertes Wasser: Proteasehemmer-Cocktaillösung).
  3. Kaltwasserextraktion mittels Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (SDGU-CW)
    1. 1 g gefriergetrocknetes E. coli-Pulver in 4 ml Glykogen-Extraktionspuffer (GEB) mit einem 1 mg/ml-Proteasehemmer-Cocktail auflösen und homogenisieren.
      HINWEIS: GEB besteht aus 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF und 5 mM Natriumpyrophosphat. Der GEB muss mit HCl auf pH 8 eingestellt werden.
    2. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zellbrecher (25 % Energie, 4 °C), um Bakterienzellen 3 Minuten lang zu zerkleinern (8 s Arbeitszyklen und 9 s Intervalle). Stellen Sie sicher, dass der gesamte Vorgang auf dem Eis durchgeführt wird. Nach der Sonifikation wird das bakterielle Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen überführt, es mit GEB bis zu einem Endvolumen von 10 mL gefüllt und das Röhrchen zum Mischen vortexen.
      HINWEIS: Nicht zu lange homogenisieren, da die erzeugte Hitze das Glykogen abbauen kann.
    3. Zentrifugieren bei 6.000 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein 10,4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen, füllen Sie das Röhrchen bis zum Rand mit GEB und zentrifugieren Sie dann bei 360.000 x g für 2 Stunden bei 4 °C.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schlauch gefüllt ist und keine Luftblasen vorhanden sind.
    4. Der Überstand wird nach der Zentrifugation verworfen und der Niederschlag mit 2 mL entionisiertem Wasser resuspendiert.
    5. In einem neuen Ultrazentrifugenröhrchen langsam 4 ml 75%ige Saccharoselösung mit 4 ml 37,5%iger Saccharoselösung schichten. Anschließend wird die in Schritt 2.3.4 gewonnene Suspension auf die Saccharoselösung aufgetragen und mit entionisiertem Wasser aufgefüllt (siehe Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Saccharosekonzentration beträgt 75 % [v/v] und 37,5 % [v/v]. Seien Sie vorsichtig bei der Erstellung des Saccharose-Dichtegradienten und stellen Sie sicher, dass zwischen den beiden Saccharoselösungen eine beobachtbare Schichtung vorhanden ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich keine Luftblasen im Ultrazentrifugenröhrchen befinden.
    6. Bei 360.000 x g für 2,5 h bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Lösen Sie das Pellet in 200 μl entionisiertem Wasser auf. Für die Glykogenfällung werden 800 μl absolutes Ethanol zugegeben.
    7. Glykogen über Nacht bei -20 °C ausfällen. Bei 4.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    8. Das resultierende Pellet wird in 400 μl ddH2O in einem 2-ml-Röhrchen aufgelöst, bei -80 °C vorgefroren und gefriergetrocknet, um trockenes Glykogenpulver zu erhalten. Trockenes Glykogenpulver für die Strukturanalyse bei 4 °C aufbewahren.
      HINWEIS: Die detaillierte Vorgehensweise ist in Abbildung 1 dargestellt.
  4. Extraktion aus heißer 30%iger Kaliumhydroxidlösung (KOH-HW)
    1. Kochen Sie gefriergetrocknetes E. coli-Pulver (50 mg) in 1 ml 30 % [w/v] KOH für 1 h.
    2. 67 % [v/v] Ethanol mit 15 mM LiCl zur Fällung bei -20 °C für mindestens 1 h zugeben. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g bei 4 °C für 20 min.
      HINWEIS: 67 % [v/v] Ethanol mit 15 mM LiCl enthalten 0,6358 g LiCl, 67 mL absolutes Ethanol und 33 mL deionisiertes Wasser.
    3. Die Pellets werden in 1 mL ddH2O wieder aufgelöst und 10 min lang bei 95 °C unter intermittierendem Rühren erhitzt.
    4. Wiederholen Sie den Schritt der Ethanolfällung noch dreimal, wie in Schritt 2.4.2 beschrieben. Das fertige Pellet in 400 μl ddH2O in einem 2-ml-Röhrchen wieder auflösen, bei -80 °C vorfrieren und gefriertrocknen, um trockenes Glykogenpulver zu erhalten.

3. Bestimmung der Glykogenstruktur

  1. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
    1. Resuspendieren Sie Glykogenpulver in 50 mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7) mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml.
    2. Verdünnen Sie die Suspension 10-fach und tragen Sie die verdünnte Suspension auf das 400-Mesh-Kupfergitter mit Glimmentladung auf.
    3. Nach 2 Minuten ziehen Sie die überschüssige Probe mit einem Filterpapier vom Gitter und färben Sie das Gitter mit 2-3 Tropfen 1% Uranylacetat.
    4. Verwenden Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, das bei 75 kV arbeitet, um die Präparate zu untersuchen.
  2. Größenausschluss-Chromatographie (SEC)
    1. Vorbereitung der mobilen Phase: Bereiten Sie 0,02 % (w/w) Natriumazid und 50 mM Natriumnitratlösungen in entionisiertem Wasser vor und filtrieren Sie durch eine 0,45 μm Filtermembran. Verwenden Sie das oszillierende Ultraschall-Wasserbad, um die Lösung mehr als 15 Minuten lang zu beschallen, um Luftblasen zu entfernen.
    2. Probenvorbereitung: Verwenden Sie die mobile Phase, um Glykogenpulver so aufzulösen, dass die Endkonzentration 1 mg/ml beträgt. Die Lösung über Nacht bei 80 °C in einem Thermomischer inkubieren. Die gelöste Probe wird bei 6.000 x g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand in ein Standard-SEC-Fläschchen überführt.
    3. Vorbereitung von DMSO-behandelten Glykogenproben
      1. 1 mg Glykogenpulver in 300 μl DMSO auflösen und über Nacht bei 80 °C in einem Thermomischer inkubieren. Fügen Sie 4x Volumen Ethanol hinzu, um Glykogen auszufällen, und zentrifugieren Sie die Lösung bei 6.000 x g.
      2. Das Pellet zweimal mit Ethanol waschen, das Pellet in ddH2O auflösen und lyophilisieren.
      3. Analysieren Sie das gefriergetrocknete Glykogenpulver mittels SEC, indem Sie die Proben wie oben beschrieben vorbereiten.
    4. Verwenden Sie das SEC-System mit Vorsäulen und 1000- und 10000-Säulen für die Analyse der Glykogenpartikelgrößenverteilung. Halten Sie die Säulen bei 80 °C und die Flussrate bei 0,3 mL/min.
  3. Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE)
    1. Glykogen-Entzweigung
      HINWEIS: Bei der Verwendung von FACE zum Nachweis der Kettenlängenverteilung (CLD) müssen alle zu testenden Proben einer Vorbehandlung der Entzweigung unterzogen werden.
      1. Geben Sie 0,5 mg Glykogenpulver, 90 μl heißes Wasser (90 °C), 1,5 μlNaN-3-Lösung , 3,5 μl Isoamylase (200 U/ml) und 8 μl Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 3,5) in ein Reagenzglas.
        HINWEIS: Isoamylase wird zugesetzt, um die verzweigte Kette der zu testenden Probe spezifisch zu durchtrennen. Isoamylase ist ein entzweigendes Enzym, das die α-(1-6)-Bindung spezifisch zerstören kann, ohne die α-(1-4)-Bindung zu zerstören, so dass es die Glykogen-Seitenkette spezifisch spalten kann, ohne die Struktur der Hauptkette zu zerstören.
      2. Die Mischung bei 37 °C 3 h in einem Thermomischer inkubieren. Nachdem Sie den pH-Wert mit 8 μl 0,1 M NaOH-Lösung neutral gemacht haben, inkubieren Sie die Mischung bei 80 °C für 1 h in einem Thermomischer.
      3. Fügen Sie der Mischung 4x Volumen absolutes Ethanol hinzu, um Glykogen auszufällen. Anschließend bei 6.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Das Pellet zweimal mit Ethanol waschen, das Pellet in ddH2O auflösen und lyophilisieren.
    2. Herstellung der Fluoreszenzlösung
      1. Zentrifugieren Sie die APTS (8-Aminopyren-1,3,6-Trisulfonsäure-Trinatriumsalz) Reagenzflasche (jede Flasche enthält 5 mg APTS) bei 4.000 x g für 2 min. Fügen Sie 50 μl 15%ige Essigsäurelösung hinzu, um das Pulver aufzulösen, mischen Sie gut und zentrifugieren Sie sie bei 4.000 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur, um 0,2 M APTS-Essigsäurelösung zu erhalten.
        HINWEIS: Bewahren Sie die APTS-Lösung im Kühlschrank bei -20 ° C auf C.It muss nach dem Öffnen innerhalb von zwei Wochen vollständig verbraucht werden. Andernfalls wird es deaktiviert. APTS ist ein häufig verwendeter negativ geladener Farbstoff, der an das reduzierende Ende der Glykogenkette bindet. Da die Ketten mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden (DP) alle nur eine negative Ladung tragen, kann FACE sie anhand ihres unterschiedlichen Masse-Ladungs-Verhältnisses trennen. Auf diese Weise werden Signale unterschiedlicher DP-Werte vom Fluoreszenzdetektor detektiert.
    3. Übertragen Sie das entzweigte Glykogen in ein Reagenzglas und fügen Sie 1,5 μl APTS-Lösung und 1,5 μl Natriumcyanoborohydrid-Lösung hinzu. Bei 60 °C 1,5 h im Dunkeln inkubieren. 80 μl entionisiertes Wasser zugeben, bei 4.000 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand aufbewahren.
    4. Die Probe wird durch Injektion für 3 s bei 0,5 psi (3,4 kPa über dem Atmosphärendruck) in das Kapillarelektrophoresesystem eingeführt.
      HINWEIS: Fluoreszenzmarkierte lineare Glucane wurden durch eine angelegte Spannung von 30 kV und einen Strom von ca. 14 mA bei 25 °C getrennt. Die Peakbereiche ergaben relative Mengen an Glucanen mit unterschiedlichen Massen (Polymerisationsgrad (DP) von Glucanen in benachbarten Peaks unterschied sich um 1 DP). Die Probentemperatur wurde bei 18 °C gehalten.

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Results

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Größenverteilung von Glykogenpartikeln
Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass Glykogen-α-Partikel in der diabetischen Leber zerbrechlich sind und im Wasserstoffbrückendisruptor DMSO 11,12,13,14 leicht auseinander gebrochen werden können. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, wie sich die Partikelgröße und die strukturelle Stabilität von bakteriellem Glykogen verände...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glykogen ist eine wichtige Energiereserve, die in vielen Bakterien nachgewiesen wurde16. Um die physiologischen Funktionen von Glykogenpartikeln zu verstehen, ist es wichtig, die Feinstruktur der Glykogenmoleküle besser zu verstehen. Bisher wurde eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um Glykogen aus Bakterienkulturen zu gewinnen. Bei verschiedenen Extraktionsmethoden wurden jedoch unterschiedliche Größenverteilungen von Glykogenpartikeln beobachtet, was auf eine ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind Professor Robert G. Gilbert von der University of Queensland und der Yangzhou University sehr dankbar, der uns Einblicke und Fachwissen zur Verfügung gestellt hat, die den Abschluss dieser Studie sehr unterstützt haben. Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Nr. 31900022, Nr. 32171281), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Jiangsu (Nr. BK20180997), Young Science and Technology Innovation Team der Xuzhou Medical University (Nr. TD202001) und Jiangsu Qinglan Project (2020).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC SystemAgilent1260 infinity IIPartikelgrößenverteilung
AnalysesäulePSS10-1000-Zentrifuge
Eppendorf5420-Filtermembran
CambioKm-0220-
Fluoreszenzgestütztes KapillarelektrophoresesystemBeckmanSchar-Kettenlängenverteilung
GefriertrocknerXinzhiSCIENTZ-10NGefriertrocknung von Bakterien und Glykogen
GefrierschrankThermo FisherForma 900Probenlagerung
VorsäulePSSSUPPERMA-Inkubator
Thermo FisherPR505750R-CN-
Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit und großer KapazitätHexiHR/T20MMProbenzentrifugation
Multiskan FC Mikroplatten-ReaderThermo Fisher1410101-Optima
XPN UltrazentrifugeBeckmanXPN-100/90/80Für Glykogenoszillator
XinbaoSHZ-82-PA-800
Plus SystemBeckman ScharA66528-pH-Messgerät
Mettler ToledoFE28 -TRIS-Brechungsindex-Detektor
WyattOptilab T-rEX-Kühlschrank
HaierBCD-406WDPD-Thermomixer
Shanghai JingxinJXH-100Probeninkubation
TransmissionselektronenmikroskopHitachi CorporationH-7000Glykogenpartikel-Morphologie
UltrazentrifugenröhrchenBeckman355651-Ultraschall-Küvettenbrecher
Ningbo XinzhiScientz-IID  Bakteriendisruptor
Ultraschall-oszillierendes WasserbadJietuoJT-1027HTD-Vortex-Mischer
TiangenOSE-VX-01-Wassersystem
Merck MilliporeH2O-MM-UV-TDeionisiertes Wasser
Material
8-Aminopyren-1,3,6-Trisulfonsäure TrinatriumsalzSigma-Aldrich196504-57-1-Absolutes
EthanolGuoyao10009228-Agar
PulverSolarbioA1890-Alpha-Amylase
MegazymeE-BLAAM-40ML-Amyloglucosidase
MegazymeE-AMGDF-40ML-cOmplete
MiniRoche4693159001-D
- (+)GlukoseSigma-AldrichG8270-1kg-D-Glukose-Assay-Kit
(GOPOD-Format)MegazymeK-GLUCGlykogen-Quantifizierung
DimethylsulfoxidVicmedVic147Chaotropes Mittel
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-Ethylendiamintetraessigsäure
VicmedVic1488-
EisessigGuoyao10000218-Glycerin
Guoyao10010618Bakterieller Speicher
SalzsäureGuoyao
10011008-HydroxymethylaminomethanSigma-AldrichV900483-500g-Isoamylase
MegaZyme9067-73-6Glykogendebranch
LithiumchloridSigma-Aldrich62476-100G-M9
, Minimale Salze, 5-fach;Sigma-AldrichM6030-1kgBakterienkultur
KaliumhydroxidGuoyao
10017008-Pullulan StandardPSS-
NatriumacetattrihydratGuoyao10018718-Natriumazid
Sigma-Aldrich26628-22-8-Natriumchlorid
Guoyao10019318Bakteriell Kultur
NatriumcyanoborohydridHuaweiruikehws001297-Natriumdiphosphat
Sigma-Aldrich71515-250g-Natriumfluorid
MacklinS817988-250g-Natriumhydroxid
Guoyao10019762-Natriumnitrat
Guoyao
10019928-NatriumpyrophosphatSigma-AldrichV900195-500g-Saccharose
Guoyao10021463-Trichloressigsäure
Guoyao
40091961-TryptonOxoidLP0042Bakterienkultur
HefeextraktOxoidLP0021Bakterienkultur

References

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  1. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
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