On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Zusammenfassung

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

Zusammenfassung

Biochemische Reaktionen und biologische Prozesse können am besten verstanden werden, indem gezeigt wird, wie Proteine zwischen ihren funktionellen Zuständen übergehen. Da kryogene Temperaturen unphysiologisch sind und die Proteinstrukturdynamik verhindern, abschrecken oder sogar verändern können, ist eine robuste Methode für routinemäßige Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur sehr wünschenswert. Das Crystal-on-Crystal-Gerät und die dazugehörige Hard- und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind so konzipiert, dass sie eine In-situ-Röntgenbeugung bei Raumtemperatur für Proteinkristalle unterschiedlicher Größe ohne Probenmanipulation ermöglichen. Hier stellen wir die Protokolle für die wichtigsten Schritte von der Gerätemontage, On-Chip-Kristallisation, optischem Scannen, Kristallerkennung bis hin zur Röntgenaufnahmeplanung und automatisierten Datenerfassung vor. Da diese Plattform keine Kristallgewinnung oder andere Probenmanipulation erfordert, können Hunderte bis Tausende von Proteinkristallen, die auf Chip gezüchtet werden, programmierbar und mit hohem Durchsatz in einen Röntgenstrahl eingebracht werden.

Einleitung

Aufgrund der ionisierenden Wirkung von Röntgenstrahlung war die Proteinkristallographie in den letzten drei Jahrzehnten weitgehend auf kryogene Bedingungen beschränkt. Daher ergibt sich das aktuelle Wissen über Proteinbewegungen während seiner Funktion weitgehend aus Vergleichen zwischen statischen Strukturen, die in verschiedenen Zuständen unter kryogenen Bedingungen beobachtet wurden. Kryogene Temperaturen behindern jedoch unweigerlich das Fortschreiten einer biochemischen Reaktion oder Interkonversion zwischen verschiedenen Konformationszuständen, während Proteinmoleküle arbeiten. Um die Proteinstrukturdynamik mit atomarer Auflösung direkt durch Kristallographie zu....

Protokoll

1. Gerätevormontage

1. Beschriften Sie den Außenring (30 mm Durchmesser) zur Probenidentifikation. Geben Sie ggf. den Projektnamen, die Gerätenummer, die Kristallisationsbedingung und das Datum an (Abbildung 1A). Legen Sie den äußeren Ring kopfüber auf eine saubere Oberfläche (Abbildung 1B), und legen Sie vorsichtig einen Quarzwafer in den Ring (Abbildung 1C). Dieser erste Quarzwafer dient als Eingangsfenster für die einfallenden Röntgenstrahlen.
2. Gießen Sie eine kleine Menge Mikroskop-Tauchöl (Viskosität von 150 cSt) in eine Petrischale. Tauchen ....

Ergebnisse

Mehrere repräsentative Datensätze wurden in den letzten Jahren veröffentlicht 10,12 zusammen mit den kristallographischen Ergebnissen und wissenschaftlichen Erkenntnissen aus einer Vielzahl von Proteinproben, einschließlich Photorezeptorproteinen und Enzymen, zum Beispiel einem pflanzlichen UV-B-Photorezeptor UVR8, einer lichtgetriebenen DNA-Reparaturphotolyase PhrB^10, einem neuartigen Fern-Rotlicht-Sensorprotein aus einer multidomänensensorischen Histidinkinase .......

Diskussion

Die Proteinkristallographie in den frühen Jahren, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, hatte enorme Schwierigkeiten, Röntgenstrahlenschäden zu bekämpfen. Daher wurde es durch die robustere Kryokristallographie-Methode ersetzt, da Synchrotron-Röntgenquellen leicht verfügbar wurden²⁰. Mit dem Aufkommen von Freie-Elektronen-Röntgenlasern wurde die Proteinkristallographie bei Raumtemperatur in den letzten Jahren wiederbelebt, wobei viele neue Entwicklungen von dem Wunsch angetrieben wurden, die .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Analysesoftware	Eigenentwickelte
			Ce:Y3Al5O12, YAG-Einkristallsubstrate
Chiphalter	Eigenentwickelte
Steuerungssoftware	Eigenentwickelte
Immersionsöl	Cargille Laboratories	16482	Typ A niedrig Viskosität 150
cSt inSituX-Plattform	Eigenentwickelte
IR-Lichtquelle	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED mit Glaslinse, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Mikroskop	Zeiss		SteREO Discovery V8
Außenring	Eigenentwickelte
Petrischale	Fisher Scietific FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
Pumplaser	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW und Oslash; 9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Sicherungsring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 Sicherungsring für Ø 1" Linsentuben und Halterungen
Seedless Quarzkristall	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25,4 mm Durchmesser Z-Schnitt 0,05 mm Dicke doppelseitig poliert 8 mm auf -X
Unterlegscheibe	Eigenentwickelter
Röntgenstrahlanschlag	Eigenentwicklung

Cer-dotierte Yttrium-Aluminium-Granate-Verbrauchsmaterialien