3D-Rekonstruktion und Analyse dünner subzellulärer neuronaler Strukturen mit Hilfe von Rasterelektronenmikroskopiedaten mit fokussiertem Ionenstrahl

Summary

Eine flexible methodische Pipeline zur Identifizierung, Visualisierung und Quantifizierung dünner subzellulärer neuronaler Prozesse innerhalb von Bildvolumina der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie unter Verwendung benutzerfreundlicher Open-Source-Softwarepakete.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der Rasterelektronenmikroskop-Technologie ermöglichen nun die schnelle dreidimensionale (3D) Analyse ultradünner subzellulärer Prozesse. Hier wird eine methodische Pipeline vorgestellt, um dünne neuronale Prozesse zu identifizieren, zu visualisieren und zu analysieren, wie sie beispielsweise in die präsynaptischen Boutons anderer Neuronen (sogenannte "Spinules") projizieren. Unter Verwendung frei verfügbarer Softwarepakete demonstriert dieses Protokoll, wie ein Entscheidungsbaum verwendet werden kann, um gemeinsame neuronale subzelluläre Strukturen anhand morphologischer Kriterien innerhalb der Bildvolumina der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) zu identifizieren, mit besonderem Augenmerk auf die Identifizierung einer Vielzahl von Spinuli, die in präsynaptische Boutons projizieren. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie Spinulen innerhalb neuronaler Synapsen verfolgt werden können, um 3D-Rekonstruktionen dieser dünnen subzellulären Projektionen, ihrer Elternneuriten und postsynaptischen Partner zu erstellen. Darüber hinaus enthält das Protokoll eine Liste frei verfügbarer Open-Source-Softwareprogramme zur Analyse von FIB-SEM-Daten und bietet Tipps (z. B. Glättung, Beleuchtung) zur Verbesserung von 3D-Rekonstruktionen für die Visualisierung und Veröffentlichung. Dieses anpassungsfähige Protokoll bietet einen Einstieg in die schnelle nanoskalige Analyse subzellulärer Strukturen innerhalb von FIB-REM-Bildvolumen.

Introduction

Untersuchungen zu den Struktur-Funktions-Beziehungen nanometerdünner subzellulärer Bauteile profitieren häufig von der 3D-Visualisierung und -Analyse¹. Transmissionselektronenmikroskopie-Studien mit seriellen Schnitten waren jedoch zeitlich und räumlich durch die Notwendigkeit eingeschränkt, ein Diamantmesser zu verwenden, um Hunderte bis Tausende von seriellen ultradünnen Schnitten von ≥40 nm zu schneiden und auszurichten. Diese Einschränkungen haben die Fähigkeit eingeschränkt, dünne subzelluläre Strukturen (<40 nm Durchmesser) zu beproben und effektiv zu analysieren, und die Notwendigkeit, sich mit ultradünn....

Protocol

1. Bildvolumendaten und subzelluläre Objektgröße: Überlegungen und Registrierung

1. Erhalten Sie ein qualitativ hochwertiges FIB-REM-Bildvolumen des interessierenden Bereichs, der die subzellulären Objekte von Interesse enthält.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Segmente eines FIB-REM-Bildvolumens aus dem primären visuellen Kortex eines Frettchens im späten Adoleszenten (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, isotrope Voxel von 4 nm) und ein frei zugängliches FIB-SEM-Volumen aus dem CA1-Hippocampus adulter Ratten (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; isotrope Voxel von 5 nm), die vom Knott-Labor zur Verfügung gestellt wurden (https://www.epfl.ch/labs/cv....

Results

Quantifizierung des Prozentsatzes synaptischer Spinulen innerhalb der exzitatorischen präsynaptischen Bouton-Population im primären visuellen Kortex von Frettchen
Obwohl spinulenartige Ausstülpungen von Neuriten in exzitatorische präsynaptische Boutons seit Jahrzehnten beobachtet werden^19,26, ist ihre potentielle Bedeutung für die synaptische Funktion bisher unklar geblieben. Diese Experimente wurden entwickelt, um den Anteil exzitatorischer p.......

Discussion

Diese FIB-REM-Pipeline zur Bildvolumenanalyse kann zuverlässige 3D-Rekonstruktionen und quantitative Messungen dünner subzellulärer Strukturen erstellen. Während derzeitige halbautomatische Techniken, die tiefe neuronale Netze und Segmentierungsalgorithmen verwenden, die Geschwindigkeit und Effizienz bei der Rekonstruktion zellulärer Strukturen mit relativ hohem Membrankontrast innerhalb großer Bildvolumina erhöhen können³³, werden viele subzelluläre Strukturen (z.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fidschi (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org