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Methodenartikel

Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

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DOI:

10.3791/63036

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30. Dezember 2021

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1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.

Zusammenfassung

Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe sind zunehmend attraktiver geworden, da sie geeignete Merkmale aufweisen und eine zugängliche Quelle für regenerative klinische Anwendungen darstellen. Verschiedene Protokolle wurden verwendet, um aus Fett gewonnene Stammzellen zu erhalten. Dieser Artikel beschreibt verschiedene Schritte eines verbesserten zeitsparenden Protokolls, um eine signifikantere Menge an ADSC zu erhalten, und zeigt, wie ADSC kryokonserviert und aufgetaut wird, um lebensfähige Zellen für die Kulturexpansion zu erhalten. Einhundert Milliliter Lipoaspirate wurden mit einer 26 cm langen Dreiloch- und 3-mm-Spritzen-Fettabsaugung aus dem Bauchbereich von neun Patienten entnommen, die sich anschließend einer elektiven Bauchdeckenstraffung unterzogen. Die Isolierung der Stammzellen wurde mit einer Reihe von Wäschen mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) -Lösung, ergänzt mit Kalzium und der Verwendung von Kollagenase, durchgeführt. Zellen der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) wurden kryokonserviert und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Immunphänotypisierung überprüft. Die SVF-Zellausbeute betrug 15,7 x 105 Zellen / ml, zwischen 6,1-26,2 Zellen / ml. Adhärente SVF-Zellen erreichten nach durchschnittlich 7,5 (±4,5) Tagen eine Konfluenz mit einer durchschnittlichen Zellausbeute von 12,3 (± 5,7) x 105 Zellen/ml. Die Lebensfähigkeit von aufgetautem SVF nach 8 Monaten, 1 Jahr und 2 Jahren lag zwischen 23,06% und 72,34% mit einem Durchschnitt von 47,7% (±24,64), wobei die niedrigste Lebensfähigkeit mit Fällen von zweijährigem Einfrieren korrelierte. Die Verwendung von DPBS-Lösung, ergänzt mit Kalzium und Beutelruhezeiten für die Fettfällung mit einer kürzeren Zeit der Kollagenase-Verdauung, führte zu einer erhöhten Zellendausbeute der Stammzellen. Das detaillierte Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten lebensfähiger Stammzellen war in Bezug auf Zeit und Zellertrag effizienter als die Techniken aus früheren Studien. Selbst nach einer langen Zeit der Kryokonservierung wurden lebensfähige ADSC-Zellen im SVF gefunden.

Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung von Vorteil. Die Verwendung dieses adulten Zelltyps überwindet ethische Fragen - verglichen mit der Verwendung embryonaler oder anderer Zellen - und ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete in der autologen Geweberegeneration und Zelltherapie1, wie der neoplastische Bereich, die Behandlung degenerativer Erkrankungen und therapeutische Anwendungen im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie 2,3,4, 5. Es wurde bereits berichtet, dass es eine reichliche Quelle von mesenchymalen multipotenten und pluripotenten Stammzellen in der stromalen vaskulären Zellfraktion des Fettgewebesgibt 6,7. Diese ADSC gelten als hervorragende Kandidaten für den Einsatz in der Zelltherapie und Transplantation/Infusion, da eine beträchtliche Anzahl von Zellen mit einer starken Expansionskapazität ex vivo leicht mit einer hohen Ausbeute aus einem minimalinvasiven Verfahren gewonnen werden kann 5,8.

Es wurde auch gezeigt, dass Fettgewebe eine größere Fähigkeit zur Bereitstellung mesenchymaler Stammzellen aufweist als zwei andere Quellen (Knochenmark und Nabelschnurgewebe)9. ADSC ist nicht nur schlecht immunogen und besitzt eine hohe Fähigkeit, sich in das Wirtsgewebe zu integrieren und mit dem umgebenden Gewebe zu interagieren4,10, sondern hat auch eine multipotente Fähigkeit zur Differenzierung in Zelllinien, mit Berichten über chondrogene, osteogene und myogene Differenzierung unter geeigneten Kulturbedingungen11,12,13, und in Zellen wie Pankreas, Hepatozyten, und neurogene Zellen14,15,16.

Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist sich einig, dass die immunmodulatorische Wirkung der mesenchymalen Stammzellen ein relevanterer Wirkmechanismus für die Zelltherapieist 17,18,19 als ihre Differenzierungseigenschaft. Einer der wichtigsten Vorteile der ADSC-Verwendung ist die Möglichkeit der autologen Infusion oder Transplantation, die zu einer alternativen Behandlung für mehrere Krankheiten wird. Für die regenerative Medizin wurden ADSC bereits bei Leberschäden, Rekonstruktion des Herzmuskels, Regeneration von Nervengewebe, Verbesserung der Skelettmuskelfunktion, Knochenregeneration, Krebstherapie und Diabetesbehandlung eingesetzt20,21.

Bis heute gibt es 263 registrierte klinische Studien zur Bewertung des Potenzials von ADSC, die auf der Website der United States National Institutes of Health22 aufgeführt sind. Verschiedene Protokolle zur Entnahme von Fettgewebe wurden etabliert, aber es gibt keinen Konsens in der Literatur über eine standardisierte Methode zur Isolierung von ADSC für den klinischen Gebrauch23,24. Lipoaspirate-Verarbeitungsmethoden während und nach der Operation können sich direkt auf die Zelllebensfähigkeit, die endgültige Zellausbeute25 und die Qualität der ADSC-Population20 auswirken. In Bezug auf die chirurgische Vorbehandlung ist nicht genau bekannt, welche chirurgische Vorbehandlungstechnik nach der Isolierung eine signifikantere Anzahl lebensfähiger Zellen ergibt oder ob die in das Fettgewebe injizierte Anästhesielösung die Zellausbeute und ihre Funktionen beeinflusst26. In ähnlicher Weise kann der Unterschied zwischen den Techniken zur Gewinnung von Fettzellen zu einer Verringerung der Anzahl lebensfähiger ADSC 20 um bis zu70% führen. Nach der Literatur sollten mechanische Behandlungen zur Gewinnung von Zellpopulationen mit hoher Lebensfähigkeit - einschließlich Ultraschall - vermieden werden, da sie das Fettgewebe abbauen können20. Die manuelle Fettaspirationsmethode mit Spritzen ist jedoch weniger schädlich und verursacht weniger Zellzerstörung, wobei die Tumeszenzfettabsaugung eine signifikante Anzahl von Zellen mit der besten Qualität ergibt26.

Diese Technik verwendet eine Kochsalzlösung mit Lidocain und Epinephrin, die in den Fettabsaugungsbereich injiziert wird. Für jedes injizierte 3-ml-Volumen der injizierten Lösung wird 1 ml aspiriert. In dieser Studie wurde die nasse Fettabsaugungstechnik durchgeführt, bei der für jeden injizierten 1 ml Adrenalin und Kochsalzlösung 0,2 ml Fettgewebe abgesaugt werden. Die Verwendung von Verdauungsenzymen, insbesondere Kollagenase, ist für den Prozess der Isolierung von ADSC üblich.

Nach dem ersten Isolationsschritt im Labor wird das endgültige Pellet als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bezeichnet. Es enthält verschiedene Zelltypen27, einschließlich endothelialer Vorläuferzellen, Endothelzellen, Makrophagen, glatter Muskelzellen, Lymphozyten, Perizyten, Präadipozyten und ADSCs, die adhäsionsfähig sind. Sobald die endgültige Isolierung aus In-vitro-Kulturen abgeschlossen ist, werden Zellen, die nicht am Kunststoff haften, im Medienaustausch eliminiert. Nach acht Wochen Expansion, Mediumsveränderungen und Passagen repräsentieren ADSCs den größten Teil der Zellpopulation in den Kolben20. Einer der wichtigsten Vorteile der Verwendung isolierter Stammzellen aus Fettgeweben für eine mögliche zukünftige Therapie ist die Möglichkeit der Kryokonservierung. Es wurde gezeigt, dass kryokonserviertes Lipoaspirate auch nach 6 Wochen des Einfrierens eine potenzielle Quelle von SVF-Zellen ist28, mit biologischer Aktivität auch nach 2 Jahren Kryokonservierung29 und voller Fähigkeit, in Kultur30 zu wachsen und zu differenzieren. Während des Auftauvorgangs geht jedoch in der Regel ein erheblicher Prozentsatz der Zellen verloren31. Daher müssen der Prozess der Lipoaspirateentfernung und die folgenden Methoden der Zellisolierung die höchste Zellausbeute gewährleisten.

Diese Studie beschreibt eine schnellere Methodik zur Erfassung und Isolierung von ADSC und zeigt eine hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit für eine bessere Effizienz von Zelltherapeutika. Darüber hinaus wurde die Wirkung dieser verbesserten Technik nach Langzeit-SVF-Kryokonservierung evaluiert.

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Protokoll

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der UNIFESP genehmigt (Protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), durchgeführt nach schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki (2004). Die Stichprobe der vorliegenden Studie besteht aus neun Patientinnen im Alter von 33 bis 50 Jahren (Durchschnittsalter 41,5 Jahre) und einem durchschnittlichen anfänglichen Body-Mass-Index (BMI) von 24,54 (zwischen 22,32 und 26,77) (Tabelle 1), die sich einer ästhetischen Bauchdeckenstraffung aufgrund eines Hautüberschusses nach Schwangerschaften in der Abteilung für Plastische Chirurgie der Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) unterzogen haben. Brazilien. Um Verzerrungen zu reduzieren, wurden die Patienten als homogene Gruppe unter Berücksichtigung von Geschlecht, Alter und BMI ausgewählt. Die während dieser Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

1. Sammlung von Lipoaspirate

HINWEIS: Dieser Schritt muss im Operationszentrum durchgeführt werden.

  1. Verwenden Sie 4% Chlorhexidingluconat (siehe Materialtabelle) für die Hautvorbereitung und Asepsis.
    1. Führen Sie einen 2 mm subkutanen Hautschnitt durch (zwischen der Unterdermis und der Aponeurose). Führen Sie eine Klein-Kanüle von 26 mm 3 G Dreiloch- und 3-mm-Kaliber und eine Spritze ein, um ein Gesamtvolumen von 500 ml einer Adrenalinlösung (1 mg/ml) (siehe Materialtabelle) in Kochsalzlösung (1:1.000.000) im infraumbilicalen Bereich zu injizieren.
  2. Schließen Sie eine 60-ml-Spritze an eine 26 mm 3 G Dreiloch- und 3-mm-Fettabsaugungskanüle an und führen Sie sie durch den Hautschnitt ein, wobei der Kolben verriegelt wird, um ein Vakuum zu erzeugen.
    1. Führen Sie Schiebe- und Zugbewegungen aus, so dass das Lipoaspirate mit dem erzeugten Vakuum in der 60-ml-Spritze verbleibt.
  3. Die 100 ml des gesammelten Lipoaspirates werden mit einem sterilen Stecker mit einem Ventil in einen 150-ml-Polyvinylchlorid-Transferbeutel überführt (siehe Materialtabelle).
    1. Packen Sie den Transferbeutel in eine Styroporbox bei Raumtemperatur (~25 °C) und bringen Sie ihn sofort ins Labor. Nehmen Sie sich nicht länger als 30 Minuten Zeit, um mit der Gewebeverarbeitung zu beginnen.

2. Verarbeitung von Lipoaspirate

HINWEIS: Dieser Schritt muss im Labor durchgeführt werden.

  1. Wiegen Sie zuerst den Beutel, messen Sie die Temperatur mit einem digitalen berührungslosen Infrarot-Klinikthermometer und lassen Sie den Beutel 5 Minuten in der Laminar-Flow-Kammer ruhen, um die fettigeren Schichten (Blasen) und die Gewebetrennung mit den interessierenden Zellen auszufällen.
    1. Führen Sie eine Reihe von Taschentüchern durch. Erstes Waschen: 100 ml DPBS mit Kalzium (1x) in den Transferbeutel injizieren und mit den Händen mischen.
    2. Lassen Sie es 5 Minuten stehen und entfernen Sie den größten Teil der Basalflüssigkeit, die ausfällt.
    3. Entsorgen Sie die Basalflüssigkeit mit einer 60-ml-Spritze, die am Beuteladapter befestigt ist. Dieser Vorgang muss zweimal wiederholt werden.
  2. 100 ml Aufschlusslösung in den Beutel geben (93 ml kalziumfreies DPBS + 60 μL Calciumchlorid (1 g/L) + 7 ml 0,075% sterile Kollagenase, siehe Materialtabelle) und 30 min bei 37 °C unter langsamem Rühren stehen lassen.
  3. Der gesamte Inhalt des Beutels wird in vier konische Röhrchen von 50 ml umgefüllt und bei 400 x g bei 22 °C für 10 min zentrifugiert.
    1. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 5 ml Sulbeccos modifizierte Eagle's Medium (DMEM) niedrige Glukose hinzu, ergänzt mit 20% FBS (Fetal Rinderserum) (Abbildung 1).

3. Zählen der SVF-Zellen

  1. Eine frische Lösung von 10 μL Trypanblau bei 0,05% in destilliertem Wasser mit 10 μL Zellsuspension für 5 min mischen.
  2. Zählen Sie lebensfähige Zellen in einer Neubauer-Zellzählkammer32 mit einem Inverslichtmikroskop (siehe Materialtabelle) bei 20-facher Vergrößerung.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem kryoprotektiven Medium (5 ml FBS + 10% Dimethylsulfoxid - DMSO) in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml.
  4. Geben Sie 1 ml dieser Mischung in Kryoeinheiten. Verwenden Sie einen Gefrierbehälter (siehe Materialtabelle) mit einer Abkühlgeschwindigkeit von (1 °C/min bis -80 °C).
    1. Bei -80 °C 1 Jahr lagern.
    2. Nach dieser Zeit in Standard-Kassettenboxen lagern, die in die flüssige Stickstoffdampfphase (-165 °C) eingetaucht sind.

4. Auftauprozess der Zellen

  1. Nehmen Sie die Durchstechflaschen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie sofort für 1 min in das 37 °C warme Wasserbad.
  2. Legen Sie die SVF-Zellen in ein konisches Röhrchen mit 4 mL DMEM (niedrige Glukose ergänzt mit 20% FBS), vorgeheizt bei 37 °C.
  3. Zentrifugieren bei 400 x g bei 22 °C für 5 min.
  4. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml DMEM (niedrige Glukose) + 10% FBS hinzu. Führen Sie eine Immunphänotypisierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.

5. Durchflusszytometrie-Technik (Immunphänotyp-Mehrfachmarkierung)

  1. 1 ml Zellpellet (Konzentration von 1.000 Zellen/μL) in fünf Zytometrieröhrchen (je 200 μL) geben.
  2. Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
  3. 300 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10x) zugeben, bei 400 x g bei 22 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
  4. Bereiten Sie fünf Röhrchen für verschiedene Markerkombinationen wie folgt vor: 5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Zelllebensfähigkeitstest-5 μL fluoreszierender Reaktivfarbstoff. (siehe Materialtabelle) und ein Röhrchen mit ungefärbten Zellen und PBS als Negativkontrolle. Im Wirbel homogenisieren und 30 min bei 4 °C inkubieren.
    1. Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren, den Überstand mit einer Pipette verwerfen, 500 μL PBS (10x) hinzufügen und mit der Zellsortierung fortfahren.
      HINWEIS: Fünftausend Ereignisse werden pro Antikörpersatz im Durchflusszytometer mit vier Farben und fünf Parametern erfasst und mit der CellQuest-Software analysiert.

6. Aussaat von Passage 1 (P1)

  1. Aussaat 2 x 105 Zellen in einem 75 cm2 Kulturkolben.
  2. Fügen Sie 12 ml DMEM niedrige Glukose + 20% FBS + 10% Antibiotikum / Antimykotikum (mit 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 μg Amphotericin B pro ml, 0,1 μm) hinzu.
  3. Wenn die Zellen zwischen 80% -90% Konfluenz erreichen, führen Sie eine Trypsinisierung der adhärenten Zellen mit 2 ml 0,25% EDTA-Trypsin für 3 min durch.
  4. Zählen Sie die Zellen erneut (wie in Schritt 3 erwähnt).
  5. Führen Sie die Immunphänotypisierung erneut durch (wie in Schritt 5 erwähnt).

7. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie Spearmans Rho-Rechner33 , um die Stärke der Assoziation zwischen den folgenden Variablen mit P < 0,05 zu messen, wie unten erwähnt.
    1. Wählen Sie die SVF-Zellausbeute und die Anzahl der Tage, die SVF in Kultur in der ersten Passage (P1) bis 80%-90% Konfluenz (Tage bis P1) verbleibt.
    2. Wählen Sie SVF-Zellertrag vor und nach dem Wechsel zu P1.
    3. Berücksichtigen Sie Tage bis P1 und Zellertrag, bevor Sie zu P1 gehen.
    4. Wählen Sie SVF-Mobilfunkausbeute mit dem durchschnittlichen Prozentsatz der bestätigten ADSC.
    5. Berechnen Sie den Prozentsatz der bestätigten ADSC und die zelluläre Ausbeute, bevor Sie zu P1 gehen.
    6. Bestimmen Sie die BMI- und SVF-Zellausbeute.

8. Differenzierungstest

  1. Führen Sie den Differenzierungstest nach einem Differenzierungskit-Protokoll durch (siehe Materialtabelle). Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse für Fall 1.

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Ergebnisse

Die Charakterisierung der neun untersuchten Personen, einschließlich Alter, Gewicht, Größe und BMI, ist in Tabelle 1 dargestellt.

Entsprechend der anfänglich dargestellten Zellausbeute wurde das in Kultur inokulierte Zellvolumen so berechnet, dass es so nah wie möglich an der Kapazität des 75cm2 Kulturkolbens liegt. Das jeweils ausgesäte Probenvolumen ist in Tabelle 2 beschrieben. Dann wurde entsprechend der anfänglichen Zellausbeute ein variables Z...

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Diskussion

Isolationsausbeute
Es ist allgemein bekannt, dass der Kryokonservierungsprozess, der häufig in der Zelltherapie erforderlich ist, zu einem signifikanten Zellverlust führt, manchmal mehr als 50%29,30,35. Daher ist eine technische Verbesserung zur Erzielung einer hohen anfänglichen Zellausbeute in Isolation von grundlegender Bedeutung. Die Sammelmethode der Lipoaspirate und die Isolierungsmethode der Zellen müs...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken den Patienten, die sich freiwillig zur Teilnahme gemeldet haben, und dem medizinischen und pflegerischen Personal des Krankenhauses São Paulo. Diese Studie wurde von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,8 mL KryoröhrchenNunc Thermo Fisher Scientific340711
150 mL Polyvinylchlorid-TransferbeutelJP FARMA80146150059
2% Alizarin Red S Lösung, pH 4,2Sigma AldrichA5533
Adrenalin (1 mg/ml)HipolaborNA
Alcian Blue LösungSigma Aldrich1,01,647
Antibiotikum-Antimykotikum 100xGibco15240062
BD FACSCalibur Durchflusszytometer mit BD CellQues Pro AnalyseBD BioSciencesNA
Calciumchlorid 10%Merck102379
Chlorhexidingluconat 4%VIC PHARMANA
Kollagenase, Typ I, PulverGibco17018029
DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium)Gibco11966025
DPBS kein Calcium, kein Magnesium (Dulbecco's Phosphat Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS mit Calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Fötales RinderserumGibco10500056
Formaldehyd 4%Sigma Aldrich1,00,496
Inverses LichtmikroskopNikon Eclipse TS100NA
Assay für lebende und tote ZellenThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Monoklonaler Antikörper: CD105BD BioSciences745927
Monoklonaler Antikörper: CD11BBD BioSciences746004
Monoklonaler Antikörper: CD19BD BioSciences745907
Monoklonaler Antikörper: CD34BD BioSciences747822
Monoklonaler Antikörper: CD45DAKOM0701
Monoklonaler Antikörper: CD73BD BioSciences746000
Monoklonaler Antikörper: CD90BDBioSciences 553011
Monoklonaler Antikörper: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty GefrierbehälterThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 1x pH 7,4Gibco 
StemPro Adipogenesis Differentiation KitGibcoA1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation KitGibcoA1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation KitGibcoA1007201
Steriler Konnektor mit einem Spike mit NadelinjektionsstelleOrigen Biomedical Connector, USANACodemarke: IBS
Trypanblau Lösung 0,4%Sigma Aldrich93595
Trypsin-EDTA 0,25% 1x, phenolrotGibco25200056
10010023

Referenzen

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