Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.

Zusammenfassung

Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe sind zunehmend attraktiver geworden, da sie geeignete Merkmale aufweisen und eine zugängliche Quelle für regenerative klinische Anwendungen darstellen. Verschiedene Protokolle wurden verwendet, um aus Fett gewonnene Stammzellen zu erhalten. Dieser Artikel beschreibt verschiedene Schritte eines verbesserten zeitsparenden Protokolls, um eine signifikantere Menge an ADSC zu erhalten, und zeigt, wie ADSC kryokonserviert und aufgetaut wird, um lebensfähige Zellen für die Kulturexpansion zu erhalten. Einhundert Milliliter Lipoaspirate wurden mit einer 26 cm langen Dreiloch- und 3-mm-Spritzen-Fettabsaugung aus dem Bauchbereich von neun Patienten entnommen, die sich anschließend einer elektiven Bauchdeckenstraffung unterzogen. Die Isolierung der Stammzellen wurde mit einer Reihe von Wäschen mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) -Lösung, ergänzt mit Kalzium und der Verwendung von Kollagenase, durchgeführt. Zellen der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) wurden kryokonserviert und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Immunphänotypisierung überprüft. Die SVF-Zellausbeute betrug 15,7 x 10⁵ Zellen / ml, zwischen 6,1-26,2 Zellen / ml. Adhärente SVF-Zellen erreichten nach durchschnittlich 7,5 (±4,5) Tagen eine Konfluenz mit einer durchschnittlichen Zellausbeute von 12,3 (± 5,7) x 10⁵ Zellen/ml. Die Lebensfähigkeit von aufgetautem SVF nach 8 Monaten, 1 Jahr und 2 Jahren lag zwischen 23,06% und 72,34% mit einem Durchschnitt von 47,7% (±24,64), wobei die niedrigste Lebensfähigkeit mit Fällen von zweijährigem Einfrieren korrelierte. Die Verwendung von DPBS-Lösung, ergänzt mit Kalzium und Beutelruhezeiten für die Fettfällung mit einer kürzeren Zeit der Kollagenase-Verdauung, führte zu einer erhöhten Zellendausbeute der Stammzellen. Das detaillierte Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten lebensfähiger Stammzellen war in Bezug auf Zeit und Zellertrag effizienter als die Techniken aus früheren Studien. Selbst nach einer langen Zeit der Kryokonservierung wurden lebensfähige ADSC-Zellen im SVF gefunden.

Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung von Vorteil. Die Verwendung dieses adulten Zelltyps überwindet ethische Fragen - verglichen mit der Verwendung embryonaler oder anderer Zellen - und ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete in der autologen Geweberegeneration und Zelltherapie¹, wie der neoplastische Bereich, die Behandlung degenerativer Erkrankungen und therapeutische Anwendungen im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie ^{2,3,4, 5}. Es....

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der UNIFESP genehmigt (Protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), durchgeführt nach schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki (2004). Die Stichprobe der vorliegenden Studie besteht aus neun Patientinnen im Alter von 33 bis 50 Jahren (Durchschnittsalter 41,5 Jahre) und einem durchschnittlichen anfänglichen Body-Mass-Index (BMI) von 24,54 (zwischen 22,32 und 26,77) (Tabelle 1), die sich einer ästhetischen Bauchdeckenstraffung aufgrund eines Hautüberschusses nach Schwangerschaften in der Abteilung für Plastische Chirurgie der Universidade Federa....

Ergebnisse

Die Charakterisierung der neun untersuchten Personen, einschließlich Alter, Gewicht, Größe und BMI, ist in Tabelle 1 dargestellt.

Entsprechend der anfänglich dargestellten Zellausbeute wurde das in Kultur inokulierte Zellvolumen so berechnet, dass es so nah wie möglich an der Kapazität des 75^cm2 Kulturkolbens liegt. Das jeweils ausgesäte Probenvolumen ist in Tabelle 2 beschrieben. Dann wurde entsprechend der anfänglichen Zellausbeute ein variables Z.......

Diskussion

Isolationsausbeute
Es ist allgemein bekannt, dass der Kryokonservierungsprozess, der häufig in der Zelltherapie erforderlich ist, zu einem signifikanten Zellverlust führt, manchmal mehr als 50%29,30,35. Daher ist eine technische Verbesserung zur Erzielung einer hohen anfänglichen Zellausbeute in Isolation von grundlegender Bedeutung. Die Sammelmethode der Lipoaspirate und die Isolierungsmethode der Zellen müs.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,8 mL Kryoröhrchen	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL Polyvinylchlorid-Transferbeutel	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Lösung, pH 4,2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenalin (1 mg/ml)	Hipolabor	NA
Alcian Blue Lösung	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotikum-Antimykotikum 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Durchflusszytometer mit BD CellQues Pro Analyse	BD BioSciences	NA
Calciumchlorid 10%	Merck	102379
Chlorhexidingluconat 4%	VIC PHARMA	NA
Kollagenase, Typ I, Pulver	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium)	Gibco	11966025
DPBS kein Calcium, kein Magnesium (Dulbecco's Phosphat Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS mit Calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fötales Rinderserum	Gibco	10500056
Formaldehyd 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverses Lichtmikroskop	Nikon Eclipse TS100	NA
Assay für lebende und tote Zellen	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoklonaler Antikörper: CD105	BD BioSciences	745927
Monoklonaler Antikörper: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoklonaler Antikörper: CD19	BD BioSciences	745907
Monoklonaler Antikörper: CD34	BD BioSciences	747822
Monoklonaler Antikörper: CD45	DAKO	M0701
Monoklonaler Antikörper: CD73	BD BioSciences	746000
Monoklonaler Antikörper: CD90	BD	BioSciences 553011
Monoklonaler Antikörper: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Gefrierbehälter	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 1x pH 7,4	Gibco
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Steriler Konnektor mit einem Spike mit Nadelinjektionsstelle	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Codemarke: IBS
Trypanblau Lösung 0,4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0,25% 1x, phenolrot	Gibco	25200056