Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Zusammenfassung

Techniken zur Messung der Aktivität von Schlüsselenzymen des Glykogenstoffwechsels werden vorgestellt, wobei ein einfaches Spektralphotometer verwendet wird, das im sichtbaren Bereich arbeitet.

Zusammenfassung

Glykogen wird als Speicherform von Glukose von einer Vielzahl von Organismen synthetisiert, die von Bakterien bis hin zu Tieren reichen. Das Molekül besteht aus linearen Ketten von α1,4-verknüpften Glucoseresten, deren Verzweigungen durch Zugabe von α1,6-Bindungen eingebracht werden. Um zu verstehen, wie die Synthese und der Abbau von Glykogen reguliert werden und wie Glykogen seine charakteristische verzweigte Struktur erreicht, müssen die Enzyme der Glykogenspeicherung untersucht werden. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung dieser Enzymaktivitäten verwenden jedoch typischerweise Reagenzien oder Techniken, die nicht allen Forschern zur Verfügung stehen. Hier diskutieren wir eine Reihe von Verfahren, die technisch einfach, kostengünstig und dennoch in der Lage sind, wertvolle Einblicke in die Steuerung der Glykogenspeicherung zu liefern. Die Techniken erfordern den Zugang zu einem Spektralphotometer, das im Bereich von 330 bis 800 nm arbeitet, und werden unter der Annahme beschrieben, dass die Benutzer Einweg-Kunststoffküvetten verwenden. Die Verfahren sind jedoch leicht skalierbar und können für den Einsatz in einem Mikrotiterplatten-Reader modifiziert werden, was eine hochgradig parallele Analyse ermöglicht.

Einleitung

Glykogen ist in der Natur weit verbreitet, wobei die Verbindung in Bakterien, vielen Protisten, Pilzen und Tieren gefunden wird. In Mikroorganismen ist Glykogen wichtig für das Überleben der Zellen, wenn Nährstoffe begrenzt sind, und in höheren Organismen wie Säugetieren dienen Synthese und Abbau von Glykogen dazu, den Blutzuckerspiegel zu puffern ^1,2,3. Die Untersuchung des Glykogenstoffwechsels ist daher für so unterschiedliche Bereiche wie die Mikrobiologie und die Säugetierphysiologie von Bedeutung. Um den Glykogenstoffwechsel zu verstehen, müssen die Schlüsselenzyme der ....

Protokoll

1. Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität

1. Bereiten Sie die Stammlösungen der erforderlichen Reagenzien gemäß Tabelle 1 (vor dem Versuchstag) vor.

Bestandteil	Wegbeschreibungen
50 mM Tris pH 8,0	Lösen Sie 0,61 g Tris-Base in ~ 80 ml Wasser auf.  Auf 4 °C abkühlen.   Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,0 ein und erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 ml.
20 mM HEPES-Puffer	0,477....

Ergebnisse

Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität
Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von Glykogensynthase-Assays unter Verwendung gereinigter Enzyme. In Panel A kam es nach einer leichten Verzögerung zu einer linearen Abnahme der Absorption bei 340 nm über einen Zeitraum von etwa 12 min. Die Änderungsrate der Absorption in Abbildung 1A betrug ~0,12 Absorptionseinheiten/min. Eine Änderungsrate der Absorption zwischen ~0,010 und ~0,20 Absorpti.......

Diskussion

Im Allgemeinen sind die Hauptvorteile aller vorgestellten Methoden ihre niedrigen Kosten, Einfachheit, Geschwindigkeit und fehlende Abhängigkeit von Spezialgeräten. Der größte Nachteil, den sie alle teilen, ist die Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden. Die Sensitivität der Verfahren, die die Produktion oder den Verbrauch von NADH / NADPH beinhalten, ist leicht abzuschätzen. Da der Extinktionskoeffizient von NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 beträgt, zeigt einfache Arithmetik, dass ~^10-20 μM Konz.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amylopektin (amylosefrei) aus Wachsmais	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, Dinatriumsalz	MilliporeSigma	A3377
D-Glukose-1,6-bisphosphat, Kaliumsalz	MilliporeSigma	G6893
D-Glukose-6-phosphat, Natriumsalz	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Grad I, aus Hefe	MilliporeSigma	10127655001
Glykogen, Typ II aus Austern	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylat-Küvetten, 1,5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylat ist erforderlich, da einige Verfahren durchgeführt bei 340 nm oder darunter
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Natriumsalz	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes Dinatriumsalz	MilliporeSigma	43420
Nukleosid-5'-Diphosphatkinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvat, Monokaliumsalz	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase aus Kaninchenmuskel	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A aus Kaninchenmuskel	MilliporeSigma	P1261
Pyruvatkinase/Milchsäuredehydrogenase Enzyme aus Kaninchenmuskel	MilliporeSigma	P0294
UDP-Glukose, Dinatriumsalz	MilliporeSigma	U4625