Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.
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Methodenartikel
Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Brustkrebs ist eine häufige heterogene Malignität und die zweithäufigste Todesursache bei Frauen, hauptsächlich aufgrund von entfernten Organmetastasen. Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, darunter die weit verbreiteten orthotopen Mausmodelle, bei denen Krebszellen in das Brustfettpolster injiziert werden. Diese Modelle können jedoch nicht dazu beitragen, die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung zu überwachen. Modernste Werkzeuge zur Echtzeitüberwachung von Krebszellen in Mäusen werden das Verständnis der Tumorbiologie erheblich verbessern.
Hier wurden Brustkrebszelllinien etabliert, die Luziferase und grün fluoreszierendes Protein (GFP) stabil exprimieren. Insbesondere enthält diese Technik zwei aufeinanderfolgende Schritte, die durch die Messung der Luciferase-Aktivität in vitro eingeleitet werden, gefolgt von der Implantation der Krebszellen in Brustfettpolster von nicht fettleibigen diabetisch-schweren kombinierten Immunschwächemäusen (NOD-SCID). Nach der Injektion werden sowohl das Tumorwachstum als auch die metastasierende Besiedlung in Echtzeit durch das nichtinvasive Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht. Dann wird die Quantifizierung von GFP-exprimierenden Metastasen in der Lunge mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die beobachteten Biolumineszenzergebnisse zu validieren. Dieses ausgeklügelte System, das Luciferase und fluoreszenzbasierte Erkennungswerkzeuge kombiniert, bewertet Krebsmetastasen in vivo, was ein großes Potenzial für den Einsatz in Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement hat.
Einleitung
Brustkrebs ist weltweit eine häufige Krebsart, mit etwa 250.000 neuen Fällen, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten diagnostiziertwerden 1. Trotz seiner hohen Inzidenz hat eine neue Reihe von Krebsmedikamenten die Ergebnisse von Brustkrebspatientinnen signifikant verbessert2. Diese Behandlungen sind jedoch immer noch unzureichend, da viele Patienten einen Krankheitsrückfall und eine metastatische Ausbreitung auf lebenswichtige Organe2 erfahren, was die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität der Patienten ist. Daher besteht eine der größten Herausforderungen in der Brustkrebsforschung d....
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Protokoll
Alle Mausexperimente wurden unter dem vom Hebrew University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll MD-21-16429-5 durchgeführt. Darüber hinaus ist die Hebrew University von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zertifiziert.
1. Pflege der Zelllinie
HINWEIS: Die menschlichen Brustkrebs-Zelllinien (MCF-7, MDA-MB-468 und MDA-MB-231) wurden in diesem Protokoll verwendet.
- Kultivieren Sie alle Brustkrebszelllinien in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 3....
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Ergebnisse
Wir erzeugten Brustkrebs-Zelllinien (MDA-MB-231, MCF-7 und MDA-MB-468), die GFP- und Luciferase-Vektoren exprimieren. Konkret wurde dies durch eine sequentielle Infektion erreicht. Zuerst wurden die Brustkrebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor infiziert, der fluoreszierendes GFP exprimierte. Die GFP-positiven Zellen (GFP+) wurden 2 Tage nach der Infektion sortiert (Abbildung 1A,B) und mit dem pLX304 Luciferase-V5-Vektor infiziert. Dann wurde Blasticidin verwen.......
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Diskussion
Tierversuche sind für die Krebsforschungobligatorisch 7,8,9, und in der Tat wurden viele Protokolle entwickelt 3,6,10,11,12,13,14. Die meisten dieser Studien bestimmten die biologische Wirkung jedoc.......
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Offenlegungen
Alle Autoren haben offengelegt, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern des Y.D.S.-Labors. Wir danken dem Wohl Institute for Translational Medicine am Hadassah Medical Center, Jerusalem, für die Bereitstellung der Kleintierbildgebungsanlage. Diese Studie wurde durch den Research Career Development Award des Israel Cancer Research Fund unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,7 mL Eppendorf Röhrchen | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 & Mikro; L Spitzen | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µ L-Spitzen | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL Röhrchen | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µ L-Spitzen | Lifegene | LRT200 | |
| 6-Well-Zellkulturplatte | COSTAR | 3516 | |
| 96-Well-Platten SCHWARZ | Flachboden-Bar Naor | BN30496 | |
| Automatisierte Zellzähler | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III Sortierer | BD | ||
| BD Mikrolanze 3 Nadeln 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Spritzen 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess Zellzählkammer Objektträger | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, kein Glutamin | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i Mikroskop | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Geschenk aus dem Labor von Dr. Yossi Buganim (Hebräische Universität Jerusalem | ||
| )HEK293T | Geschenk aus dem Labor von Dr. Lior Nissim (Hebräische Universität Jerusalem) | ||
| Isofluran, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS-Spektrum In-vivo-Bildgebungssystem | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamin-Lösung | Biologische Industrie | 03-020-1A | |
| Lebendbild-Software | PerkinElmer | Biolumineszenz Messung | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteurpipetten | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Zur Verfügung gestellt von David M. Sabatini' s lab (Whitehead Institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Bereitgestellt von David M. Sabatini' s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petrischale 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipetten 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipetten 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipetten 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 Blastenplasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagenzreservoire | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereomikroskope | Nikon | ||
| Natriumchlorid | Bio-Labor | ||
| Spritzenvorsatzfilter | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypanblau 0,5%ige Lösung | Biologische Industrie | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Lösung B (0,25%), EDTA (0,05%) | Biologische Industrie | 03-052-1a | |
| Vakuumfilter | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | Desinfektionsmittel | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagenz | Sigma Aldrich | #6366236001 |
Referenzen
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).
- Saha, D., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
