Bestimmung des basalen Energieverbrauchs und der Fähigkeit thermogener Adipozyten, Energie bei übergewichtigen Mäusen zu verbrauchen

Metabolismus kann als die Integration der biochemischen Reaktionen definiert werden, die für die Aufnahme, Speicherung, Umwandlung und den Abbau von Nährstoffen verantwortlich sind, die Zellen verwenden, um zu wachsen und ihre Funktionen zu erfüllen. Stoffwechselreaktionen wandeln die in Nährstoffen enthaltene Energie in eine Form um, die von Zellen genutzt werden kann, um neue Moleküle zu synthetisieren und Arbeit zu verrichten. Diese biochemischen Reaktionen sind von Natur aus ineffizient, um diese Energie in eine nutzbare Form zur Erhaltung des Lebens ^umzuwandeln1. Eine solche Ineffizienz führt zu einer Energieableitung in Form von Wärme, wobei diese Wärmeproduktion zur Quantifizierung der Standard metabolic Rate (SMR) eines Organismus verwendet ^wird1. Die Standardbedingung wurde klassisch definiert als Wärmeproduktion, die bei einem wachen, aber ruhenden Erwachsenen auftritt, der keine Nahrung aufnimmt oder verdaut, bei Thermoneutralität und ohne ^Stress1. Der Grundumsatz (BMR) oder der basale Energieverbrauch bei Mäusen wird als SMR bezeichnet, jedoch bei Personen, die unter leichtem thermischem Stress (Umgebungstemperaturen 21-22 °^{C) Nahrung} aufnehmen und verdauen1. Die Herausforderungen und Schwierigkeiten bei der direkten Messung der Wärmeproduktion machten die indirekte Kalorimetrie, nämlich die Berechnung der Wärmeproduktion aus Sauerstoffverbrauchsmessungen, zum beliebtesten Ansatz zur Bestimmung des BMR. Die Berechnung des BMR aus dem Sauerstoffverbrauch ist möglich, da die Oxidation von Nährstoffen durch Mitochondrien zur Synthese von ATP für 72% des gesamten in einem Organismus verbrauchten Sauerstoffs verantwortlich ist, wobei 8% des gesamten Sauerstoffverbrauchs auch in Mitochondrien auftreten, jedoch ohne ATP (entkoppelte Atmung)¹. Der Großteil der verbleibenden 20% des verbrauchten Sauerstoffs kann auf die Nährstoffoxidation an anderen subzellulären Orten (peroxisomale Fettsäureoxidation), anabole Prozesse und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies zurückgeführt ^werden1. So stellte Lusk 1907 eine Gleichung auf, die auf empirischen Messungen basierte und häufig verwendet wurde, um den Sauerstoffverbrauch und die _{CO2-Produktion} in Energieableitung als Wärme umzuwandeln. Beim Menschen macht das Gehirn ~ 25% der BMR aus, der Bewegungsapparat ~ 18,4%, die Leber ~ 20%, das Herz ~ 10% und das Fettgewebe ~ 3-7% ². Bei Mäusen ist der Gewebebeitrag zur BMR etwas anders, wobei das Gehirn ~ 6,5%, der Skelettmuskel ~ 13%, die Leber ~ 52%, das Herz ~ 3,7% und das Fettgewebe ~ 5% ³ ausmachen.

Bemerkenswert ist, dass die biochemischen Reaktionen, die die BMR definieren, nicht fixiert sind und sich als Reaktion auf unterschiedliche Bedürfnisse ändern, wie z.B. äußere Arbeit (körperliche Aktivität), Entwicklung (Gewebewachstum), innere Belastungen (Entgegenwirken von Infektionen, Verletzungen, Gewebeumsatz) und Veränderungen der Umgebungstemperatur (Kälteabwehr)¹. Einige Organismen rekrutieren aktiv Prozesse, um Wärme bei Kälteeinwirkung zu erzeugen, was bedeutet, dass die durch den Stoffwechsel erzeugte Wärme nicht nur ein zufälliges Nebenprodukt ist. Stattdessen wählte die Evolution Regulationsmechanismen aus, die die Wärmeproduktion durch Veränderung der Geschwindigkeit der Stoffwechselreaktionen spezifisch hochregulieren ^könnten1. So können dieselben Sauerstoffverbrauchsmessungen verwendet werden, um die Fähigkeit eines Organismus zu bestimmen, Wärme als Reaktion auf Kälte zu erzeugen.

Zwei Hauptprozesse tragen zur Wärmeerzeugung bei Kälteeinwirkung bei. Die erste ist das Zittern, das Wärme erzeugt, indem es die mitochondriale oxidative Phosphorylierung und Glykolyse im Muskel erhöht, um die körperliche Arbeit durch unwillkürliche Muskelkontraktion zu decken. Daher erhöht die Kälteeinwirkung den Sauerstoffverbrauch in den ^Muskeln1. Die zweite ist die nicht zitternde Thermogenese, die durch eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs in braunen und beigen Adipozyten (BA) auftritt. Die Ableitung von Energie in Wärme in BA wird durch das mitochondriale Entkopplungsprotein 1 (UCP1) vermittelt, das den Wiedereintritt von Protonen in die mitochondriale Matrix ermöglicht und den mitochondrialen Protonengradienten verringert. Die Dissipation des mitochondrialen Protonengradienten durch UCP1 erhöht die Wärmeproduktion durch die Erhöhung des Elektronentransfers und des Sauerstoffverbrauchs und die Energie, die durch die Protonendissipation an sich freigesetzt wird, ohne ATP (entkoppelt) zu erzeugen. Darüber hinaus kann thermogenes BA zusätzliche Mechanismen rekrutieren, die den Sauerstoffverbrauch erhöhen, ohne eine große Dissipation im Protonengradienten zu verursachen, indem es sinnlose oxidative ATP-Synthese- und Verbrauchszyklen aktiviert. Die hier beschriebenen Stoffwechselkäfige, nämlich das CLAMS-Oxymax-System von Columbus Instruments, bieten die Möglichkeit, den Energieverbrauch bei unterschiedlichen Umgebungstemperaturen zu messen. Um jedoch die thermogene BA-Kapazität unter Verwendung von Ganzkörper-Sauerstoffverbrauchsmessungen zu bestimmen, muss man: (1) den Beitrag von Zittern und anderen Nicht-BA-Stoffwechselprozessen zum Energieverbrauch eliminieren und (2) die thermogene Aktivität von BA in vivo spezifisch aktivieren. So beschreibt ein zweites Protokoll, wie BA in vivo selektiv unter Verwendung der Pharmakologie in anästhesierten Mäusen bei Thermoneutralität (30 °C) aktiviert werden kann, wobei Anästhesie und Thermoneutralität andere thermogene Prozesse (d.h. körperliche Aktivität) ohne BA begrenzen. Die pharmakologische Strategie zur Aktivierung von BA ist die Behandlung von Mäusen mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten CL-316,246. Der Grund dafür ist, dass Kälteexposition eine sympathische Reaktion fördert, die Noradrenalin freisetzt, um β-adrenerge Rezeptoren in BA zu aktivieren, die UCP1 und Fettoxidation aktivieren. Darüber hinaus ist die β3-adrenerge Rezeptorexpression im Fettgewebe bei Mäusen stark angereichert.

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Los Angeles (UCLA) genehmigt. Mäuse erhielten ihre Diät und wasser ad libitum im Stoffwechselkäfig, untergebracht in einer temperaturkontrollierten Umgebung (~ 21-22 oder 30 ° C) mit einem 12h Hell / Dunkel-Zyklus. 8 Wochen alte weibliche Mäuse, die 8 Wochen lang mit einer fettreichen Diät oder Chow-Diät gefüttert wurden, wurden für diese Studie verwendet.

1. Messung des Grundumsatzes (BMR)

1. Messen Sie das Gesamteibgewicht der Maus mit einer Waage mit einer Genauigkeit im Bereich von 0,1 g.
   HINWEIS: Dies muss vor der Unterbringung der Mäuse in Stoffwechselkäfigen und nach der 2-3-tägigen Eingewöhnungszeit an die Stoffwechselkäfige erfolgen.
2. Messen Sie die Körperzusammensetzung, einschließlich Fett und magerer Masse bei nicht betäubten Mäusen, mit einem geeigneten Analysesystem für die Körperzusammensetzung (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Diese Messungen werden zur Bestimmung des Energieverbrauchs benötigt und parallel zu den Gesamtkörpergewichtsmessungen durchgeführt (Schritt 1.1).
3. Stellen Sie die Stoffwechselkäfige auf und beginnen Sie mit der Eingewöhnungsphase.
   HINWEIS: Das metabolische Käfigsystem umfasst ein Gehäuse, mit dem der Benutzer die Gehäusetemperatur und das Licht von 12 Käfigen steuern kann (Abbildung 1A, B). Jeder Käfig verfügt über eine Wasserflasche, einen Feeder und ein Gitter (Abbildung 1C). Das Gitter trennt die Maus von der Unterseite des Käfigs und ermöglicht die Fäkaliensammlung. Sobald der Käfig auf jedem vordefinierten Raum installiert ist, umfasst ein Deckel, der den Käfig versiegelt, den Wasserflaschenschlitz, die Schlauchprobenahmeluft, das Luftstromsystem und den Sensor für körperliche Aktivität (Abbildung 1D).
   1. Schalten Sie das Temperaturgehäuse, das Luftstromsystem und den Computer 2 Stunden ein, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
   2. Öffnen Sie nach 2 Stunden die Software, die das Gehäuse steuert (siehe Materialtabelle) und den Luftstrom und lassen Sie die Software die Kommunikation des Computers mit dem Gerät testen.
      HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurde die Oxymax-Software verwendet.
   3. Sobald die Kommunikation hergestellt ist, klicken Sie auf Datei, dann auf Experimentkonfiguration öffnen (Abbildung 2A) und wählen Sie die vom Hersteller vorentwickelte (oder aus einem früheren Assay eingerichtete) Experimentkonfiguration aus.
   4. Klicken Sie auf Experiment und dann auf Eigenschaften, wodurch das Fenster Experimenteigenschaften geöffnet wird (Abbildung 2B).
   5. Legen Sie im Eigenschaftenfenster die Parameter des Umgebungsgehäuses fest, einschließlich der Umgebungstemperatur (21 °C) und der 12-Stunden-Lichtzyklen.
      HINWEIS: Wenn Sie die Software geöffnet und in Betrieb halten, kann Luft in die Käfige und das Gehäuse strömen, um die ausgewählten Temperatur- und Lichtzyklen aufrechtzuerhalten. So kann das gesamte System mehrere Tage mit Mäusen in den Käfigen arbeiten, auch ohne Sauerstoff und _CO2 zu messen.
   6. Klicken Sie auf Experiment, dann auf Setup, und das Fenster Experiment Setup öffnet sich, in dem die Parameter jedes Stoffwechselkäfigs definiert sind.
   7. Weisen Sie jede Maus-ID dem einzelnen Käfig zu, in dem die Maus untergebracht ist (Abbildung 2C).
   8. Beziehen Sie die magere Masse oder das Gesamtkörpergewicht für jede Maus nur dann ein, wenn keine Unterschiede im Körpergewicht zwischen den Gruppen beobachtet werden.
      HINWEIS: Die Ermittlung von Rohwerten des Sauerstoffverbrauchs und des Energieverbrauchs erleichtert DIE ANCOVA-Analysen.
   9. Stellen Sie die Luftstromrate für den Stoffwechselkäfig auf 0,5-0,6 l/min ein.
   10. Wählen Sie im Fenster Experiment-Setup den Pfad und den Namen der Dateispeicherung aus. Wählen Sie das Sicherungsverzeichnis aus (Abbildung 2D).
   11. Fügen Sie den Feedern eine vorgewichtete Menge an Lebensmitteln hinzu, die mindestens die Nahrungsaufnahme für 1 Tag abdeckt.
       HINWEIS: Wenn die Käfige über eine integrierte Waage verfügen, kann das Futter direkt hinzugefügt werden, und die Software zeichnet es auf.
   12. Fügen Sie die Wasserflaschen hinzu. Überprüfen Sie, ob die Flasche korrekt verschlossen ist und nicht ausläuft.
   13. 24 h nach Zugabe des Futters, wiegen Sie das Futter, das auf dem Käfig verbleibt.
       HINWEIS: Die zugesetzten Gramm Lebensmittel abzüglich der verbleibenden Gramm Nahrung messen die Nahrungsaufnahme.
   14. Beginnen Sie mit den Sauerstoff-, _CO2- und Aktivitätsmessungen (Schritt 1.4.10), sobald die Nahrungsaufnahmewerte mit denen von Mäusen übereinstimmen, die in normalen Käfigen untergebracht sind.
       HINWEIS: Hier ist die Eingewöhnungszeit (in der Regel 2-3 Tage) abgeschlossen und die Messungen des Energieverbrauchs können beginnen.
4. Indirekte Kalorimetrie und Aktivitätsmessungen zur Bewertung des Energieverbrauchs
   1. Messen Sie das Körpergewicht, das Fett und die magere Masse aller Mäuse, bevor Sie mit den Messungen beginnen.
      HINWEIS: Dies sind die Körpergewichts- und Magermassewerte, die zur Durchführung von ANCOVA-Analysen verwendet werden.
   2. Kalibrieren Sie den _{O2- und CO2-Zirkonoxid-basierten} Detektor des CLAMS-Systems (siehe Materialtabelle) mit der empfohlenen Sauerstoffkonzentration; Kalibrieren Sie den Detektor immer neu, bevor Sie ein neues Experiment starten.
   3. Verwenden Sie ein Kalibriergas bekannter Zusammensetzung (20,50% Sauerstoff und 0,50% _CO2).
      HINWEIS: Gasversorger bezeichnen dieses Gas oft als "Primary Standard Grade".
   4. Schalten Sie ein und stellen Sie sicher, dass der Ausgangsdruck des Tanks bei 5-10 psi liegt.
   5. Öffnen Sie die Calibration Utility-Software zum Kalibrieren und Testen der Gassensoren (Abbildung 2E). Klicken Sie auf Experiment und dann auf Kalibrieren.
   6. Drücken Sie Start. Warten Sie dann, bis die Sensoren getestet wurden und die Software den Benutzer auffordert, die Knöpfe des Gassensors zu drehen (Abbildung 2F), bis der Wert der _{O2-Identität} 1 ist (Abbildung 2G-H). Klicken Sie auf Weiter, wenn der Schritt abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Wenn das Kalibrierungsdienstprogramm alle aktuellen Schritte ausführt, fährt die Kalibrierung automatisch mit dem nächsten Schritt fort, wenn der Fortschrittsbalken gefüllt ist.
   7. Überprüfen Sie die Kalibrierungsergebnisse, wenn alle Schritte abgeschlossen sind und die Ergebnisse angezeigt werden.
   8. Schalten Sie das Kalibriergas aus.
   9. Wechseln Sie die Nahrung und fügen Sie ausreichend Nahrung für einen Zeitraum von 48-72 h hinzu.
      HINWEIS: Obwohl Käfige während der Energieverbrauchsmessungen geöffnet werden könnten, um das Körpergewicht zu überwachen und das Futter täglich zu wechseln, können Mäuse durch diese Manipulationen gestresst werden, und Messungen gehen verloren, wenn die Käfige geöffnet werden. Daher wird empfohlen, manipulationen während des Messzeitraums zu vermeiden.
   10. Klicken Sie in der Software auf Experiment und dann auf Ausführen , um die Sauerstoff-, _CO2 - und Aktivitätsmessungen zu starten (Abbildung 3A).
       HINWEIS: Die Ausführung der Messungen kann in Echtzeit in einem Feld im unteren linken Bereich der Software verfolgt werden (rotes Rechteck, Abbildung 3B). Das rote Rechteck in Abbildung 3B zeigt, dass das System Käfig Nr. 1 in Intervall Nr. 3 misst, nämlich der 3. Messung. Eine Messung in einem Käfig kann ca. 1 min dauern. So kann bei 12 angeschlossenen Käfigen der Sauerstoffverbrauch etwa alle 12 Minuten gemessen werden. Kontinuierliche Messungen für mindestens 48 h werden empfohlen.
   11. Beenden Sie den Versuch, indem Sie auf Experiment und dann auf Beenden klicken (Abbildung 3C).
   12. Öffnen Sie die Käfige, wiegen Sie die Mäuse und das Futter. Sammeln Sie den Kot, um die Anzahl der Kalorien und Lipide zu berechnen, die über den Messzeitraum von 48-72 h ausgeschieden werden.
       HINWEIS: Kot kann bei -20 °C für spätere Analysen gelagert werden. Diese Käfige können nicht effektiv zum Sammeln von Urin verwendet werden.
   13. Klicken Sie auf Experimente, dann auf Exportieren und exportieren Sie alle Probanden als CSV-Datei (Abbildung 3D).
       HINWEIS: Um ANCOVA-Analysen zu erleichtern, ist es wichtig, rohe Sauerstoffverbrauchs- (_VO2) und _{CO2-Produktionswerte} (_VCO2) zu exportieren, ohne durch das Körpergewicht normalisiert zu werden.
5. Datenanalyse und Qualitätskontrolle
   1. Verwenden Sie im exportierten CSV-Blatt (Abbildung 3D) (ab Schritt 1.4.13) die Rohwerte des Sauerstoffverbrauchs (_VO2) und der _{CO2-Produktion} (VCO2), die alle 12 Minuten in den 2-3 Tagen gemessen werden und von der Software automatisch aufgelistet werden und einen Zeitstempel enthalten, nämlich die Stunde und das Datum, an dem sie gemessen wurden.
      HINWEIS: _VO2 - und _VCO2-Werte werden automatisch korrigiert, wenn Körpergewichts- oder Magermassewerte addiert werden.
   2. Verwenden Sie im exportierten CSV-Blatt die Rohwerte des Atemaustauschverhältnisses (RER: _VCO2/_VO2), die von der Software automatisch berechnet und entsprechend ihrem Zeitstempel aufgelistet werden.
      HINWEIS: Werte nahe 1 zeigen, dass die Maus hauptsächlich Kohlenhydrate oxidiert, während Werte näher an 0,7 darstellen, dass die Maus hauptsächlich Fett oxidiert. RER über 1 kann während des anaeroben Trainings auftreten, da der Körper mehr _CO2 ausstößt, um die durch Laktat verursachte Azidose auszugleichen. RER höher als 1 kann auf Stress hinweisen. Die exportierte CSV-Datei enthält auch die Rohwerte aus Energieverbrauch (EE) oder Wärmeproduktion in Kalorien pro Minute pro Maus, gemessen alle 12 Minuten in den 2-3 Tagen. Hier enthalten alle aufgelisteten Werte einen Zeitstempel.
   3. Da für eine ANCOVA einzelne EE-Werte pro Maus benötigt werden, wird die EE-Werte zwischen 09:00 und 16:00 Uhr für die helle (Tag-)Phase und 19:00-04:00 Uhr für die dunkle (Nacht-)Phase pro Maus und Tag gemittelt.
      HINWEIS: Dies kann manuell mit Excel oder Graph Pad erfolgen. Durch die Auswahl dieser zwei Zeitfenster wird vermieden, dass die mittleren, allmählichen und instabilen EE-Werte, die dem Hell-Dunkel-Phasenübergang zugeordnet sind, gemittelt werden.
   4. Berechnen Sie für einen Zeitraum von 48 h den Durchschnitt der beiden Tageslichtwerte und der beiden Dunkelphasenwerte pro Maus mit Excel oder Graph Pad.
   5. Um die gesamte körperliche Aktivität zu quantifizieren, verwenden Sie Excel oder Graph Pad, um die x-, y- und z-Balkenbruchzahlen zu summieren, die in den Stoffwechselkäfigen gemessen und in der CSV-Datei für jede Maus aufgeführt sind.
      HINWEIS: Die x,y,z Gesamtaktivität wird berechnet, indem zuerst der Durchschnittswert jedes X, Y, Z pro Maus und Zyklus durchgeführt wird. Dann wird die Summe der durchschnittlichen X-, Y-, Z-Werte pro Maus und Zyklus bestimmt, um die Daten wie in Abbildung 5E darzustellen (der Durchschnitt von 2 Tagen).
   6. Alternativ können Sie die Daten darstellen, die jeden Messwert im Laufe der Zeit zeigen, wodurch Kurven generiert werden, die die Änderungen der EE während des Übergangs von hellen zu dunklen Zyklen veranschaulichen.
      HINWEIS: Bitte beachten Sie den Diskussionsabschnitt darüber, wie und wann ANCOVA-Analysen durchzuführen sind, und die verschiedenen Formeln, die zur Berechnung von _VO2, _VCO2 und EE verwendet werden, finden Sie in der Ergänzenden Datei 1.

2. Messung der Fähigkeit thermogener Adipozyten, Energie zu verbrauchen

1. Richten Sie die Messungen und Mausbehandlungen ein. Siehe Schritt 1 für Einzelheiten zu den experimentellen Präparaten zur Überwachung des Sauerstoffverbrauchs, da die thermogene Kapazität in Adipozyten indirekt durch den Sauerstoffverbrauch nach den Schritten 2.1.1-2.2.2 bestimmt wird.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert eine Mausanästhesie und eine akute Behandlung mit dem Beta-3-Rezeptoragonisten CL-316,243 (siehe Materialtabelle), was eine schnelle Beurteilung der thermogenen BA-Kapazität ermöglicht.
   1. Führen Sie eine Analyse der Körperzusammensetzung durch und wiegen Sie die Mäuse. Schalten Sie das CLAMS ein, stellen Sie die Temperatur auf 30 °C (Thermoneutralität) ein und warten Sie 2 h, bis sich das gesamte System erwärmt hat.
   2. Richten Sie die restlichen Assay-Bedingungen ein, einschließlich Licht, weisen Sie jedem Käfig die Maus-ID zu und addieren Sie den Körpergewichtswert jeder Maus im entsprechenden Käfig, wenn kein Unterschied im Körpergewicht zwischen den Gruppen beobachtet wird.
   3. Kalibrieren Sie den Sauerstoff-/_CO2-Detektor gemäß den Schritten 1.4.2-1.4.7.
   4. Starten Sie das Experiment in der Software.
   5. Injizieren Sie jeder Maus Pentobarbital (60-120 mg/kg) und legen Sie jede Maus in den ihr zugewiesenen Stoffwechselkäfig (Schritt 2.1.2).
      HINWEIS: Die Dosis von Pentobarbital, die erforderlich ist, um Mäuse bei Thermoneutralität (30 °C) schlafen zu lassen, variiert je nach Mausstamm und Genotyp. Es wird empfohlen, verschiedene Pentobarbital-Dosen von 50 bis 120 mg/kg zu testen und diejenige zu wählen, die die Maus während 2-3 h bei 30 °C betäubt. Eine effiziente Anästhesie ist unerlässlich, um den Beitrag körperlicher Aktivität zum Energieverbrauch zu beseitigen.
   6. Um eine Anästhesie zu gewährleisten, beobachten Sie Mäuse nach der Pentobarbital-Injektion, bis sie vollständig schlafen und ihr verminderter Sauerstoffverbrauch stetig wird.
   7. Warten Sie, um mindestens 3 stabile aufeinanderfolgende Sauerstoffverbrauchsraten zu erhalten, bevor Sie CL-316.243 injizieren.
      HINWEIS: Während Sie auf die Stabilisierung des Sauerstoffverbrauchs warten, bereiten Sie die Spritzen mit CL-316.243 für jede Maus (1 mg/kg) vor.
   8. Öffnen Sie Käfig Nr. 1 und injizieren Sie CL-316.243 subkutan unmittelbar nach einer _VO2 - und _VCO2-Messung in Käfig Nr. 1. Bringen Sie die Maus unmittelbar nach der Injektion in Käfig Nr. 1 zurück.
      HINWEIS: Die Messungen werden in Echtzeit im unteren linken Bereich der Software angezeigt (Abbildung 3B, rotes Rechteck).
   9. Warten Sie, bis Käfig Nr. 2 gemessen wurde (Abbildung 3B, rotes Rechteck), und fahren Sie dann wie in Schritt 2.1.8 für Käfig Nr. 2 fort.
      HINWEIS: Die Injektion von CL-316,243 unmittelbar nach einer Messung ermöglicht es, die Zeit zwischen den Injektionen konstant zu halten. Zum Beispiel, wenn 12 Mäuse / Käfige laufen, mit Messungen in einzelnen Käfigen nacheinander gesammelt und die Sammlung dauert 55 s pro Käfig, dann sollten Sie eine Maus pro Minute injizieren. Bei diesen Injektionsraten erfolgt die erste Messung nach 12 minuten nach der Injektion in allen 12 Käfigen.
   10. Setzen Sie die Energieverbrauchsmessungen fort, bis die Energieaufwandswerte für 5-6 aufeinanderfolgende Messungen, normalerweise 90-180 Minuten nach der Injektion, ein Plateau erreicht haben.
       HINWEIS: Mäuse könnten während der Experimente aus der Narkose aufwachen. Diese Mäuse müssen aus der Analyse entfernt werden. Daher wird das Testen der Pentobarbital-Dosen im Voraus die Effizienz der Studien erhöhen.
   11. Stoppen Sie die Energieverbrauchsmessungen, aber halten Sie mäuse in ihren Käfigen bei 30 ° C, bis sie aufwachen.
   12. Nachdem die Mäuse vollständig wach sind, untersuchen Sie die Gesundheit der Mäuse und bringen Sie sie in ihre ursprünglichen Käfige zurück.
   13. Exportieren Sie die Daten jeder Maus als CSV-Datei mit der Gerätesoftware, wie in Abschnitt 1.4.13 beschrieben.
2. Datenanalyse
   HINWEIS: Die Datenanalyse wurde von Excel oder Graphpad durchgeführt
   1. Zeichnen Sie die 3-5 aufeinanderfolgenden Werte von _VO2, _VCO2 und EE auf, die im Laufe der Zeit stabil und konstant sind, da dies die Werte sind, die die Stoffwechselrate darstellen, wenn Mäuse vollständig betäubt sind.
   2. Zeichnen Sie dann die ersten und die folgenden aufeinanderfolgenden _VO2-, _VCO2- und EE-Messungen nach der Injektion auf.
      ANMERKUNG: Die absoluten Werte von EE und der durch Injektion induzierte Falzanstieg der EE zeigen die thermogene Funktion ^{von BA an7}.

Abbildung 4 zeigt VO2-, VCO2-, Wärmeproduktions-/Energieverbrauchs- (EE), Atemaustauschverhältnis (RER) und X-, Y-, Z-Werte für körperliche Aktivität, die mit den Stoffwechselkäfigen des CLAMS-Systems ermittelt wurden. Die vom CLAMS-System bereitgestellten VO2 und VCO2 sind das Gasvolumen (ml) pro Minute und können bereits durch eingabe dieser Gewichtswerte in der CLAMS-Software vor Beginn der Messungen durch das Körpergewicht oder die Magermassenwerte dividiert werden. Körpergewichtswerte dürfen jedoch nicht eingegeben werden, wenn Unterschiede im Körpergewicht zwischen Gruppen von Mäusen beobachtet werden, da eine ANCOVA-Analyse erforderlich ist und die Oxymax-Software diese Berechnungen nicht durchführen kann. Der Energieaufwand (Wärme) wird in kcal/h unter Verwendung der Lusk-Gleichung berechnet. Mäuse sind nachtaktiv und verbrauchen mehr Energie während der Nacht- / Dunkelperiode, was bedeutet, dass die Berechnungen des Energieverbrauchs nach dem Lichtzyklus getrennt werden müssen. Wie erwartet, haben Mäuse während der Dunkelphase einen höheren O2-Verbrauch, eine höhere CO2-Produktion und damit eine höhere EE, wie in Abbildung 4C dargestellt. Mäuse, die sich regelmäßig ernähren und sich im gefütterten Zustand befinden, wobei die Nahrungsaufnahme im dunklen Zyklus erfolgt, zeichnen sich durch RER-Werte nahe 1 aus (Abbildung 4D), was eine Präferenz für die Verwendung von Kohlenhydraten bedeutet. Während des Lichtzyklus, wenn Mäuse meist schlafen und somit schnell sind, kommt es zu einer Verschiebung zur Fettoxidation, wobei die RER-Werte näher bei 0,7 liegen. Dementsprechend nimmt die körperliche Aktivität, gemessen als x,y,z Laserstrahlbruchzahl, während der Dunkelphase zu und nimmt während der Hellenphase ab (Abbildung 4E).

Wir verglichen 16 Wochen alte weibliche Mäuse, die mit einer fettreichen Diät (8 Wochen) gefüttert wurden, mit Chow-gefütterten Mäusen, was den Vergleich des Energieverbrauchs zwischen Gruppen von Mäusen mit Unterschieden im Körpergewicht ermöglichte. Wie erwartet, erhöht die fettreiche Diätzufuhr die Fettmasse, ohne die magere Masse zu verändern (Abbildung 5A-C). Mäuse mit fettreicher Diät aßen mehr Kcal / Tag, hauptsächlich aufgrund einer höheren Kaloriendichte pro Gramm Nahrung (Abbildung 5D). Darüber hinaus war die körperliche Aktivität zwischen Chow und fettreichen, mit Diät gefütterten Mäusen ähnlich, selbst während der dunklen Periode (Abbildung 5E). Die niedrigeren WERTE der RER zeigen die Präferenz von mit fettreicher Diät gefütterten Mäusen, Fett als primäres Substrat für die Oxidation zu verwenden, wie es bei höherer Fettaufnahme und Muskelinsulinresistenz zu erwarten ist (Abbildung 5F). Der Sauerstoffverbrauch steigt bei fettreichen, diätetisch gefütterten Mäusen, aber nicht bei der CO2-Produktion (Abbildung 5G-H). Der Anstieg des Sauerstoffverbrauchs bei fettreichen, diätetisch gefütterten Mäusen geht mit einem signifikanten Anstieg der Wärmeproduktion/des Energieverbrauchs pro Maus einher (Abbildung 5I). Die Division des Energieverbrauchs durch die magere Masse jeder Maus führte jedoch zu keinen Unterschieden im Energieverbrauch (Abbildung 5J), während die Division durch das Gesamtkörpergewicht eine Abnahme des Energieverbrauchs bei fettreichen, mit Diät gefütterten Mäusen zeigte (Abbildung 5K). Kumulativ deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Division der Energieverbrauchsdaten durch magere Masse oder Gesamtkörpergewicht zu gegenteiligen Schlussfolgerungen über die Auswirkungen einer fettreichen Ernährung auf den Energieverbrauch führen kann. Wie aus mehreren Studien hervorgeht, erlaubt die Analyse der Kovarianz (ANCOVA) festzustellen, ob Unterschiede im Energieverbrauch unabhängig von den Veränderungen des Körpergewichts bestehen. Um diesen Punkt zu veranschaulichen, wurde eine ANCOVA-Analyse unter Verwendung der gleichen Daten in Abbildung 5A-K durchgeführt, wobei der Energieverbrauch die abhängige Variable und das Körpergewicht oder die magere Masse als Kovariaten waren. Während die Durchführung von ANCOVA unter Verwendung des gesamten Körpergewichts als Kovariat nur einen Trend für fettreiche, mit Diät gefütterte Mäuse einen höheren Energieverbrauch zeigt (Abbildung 5L), zeigen die mit fettreicher Diät gefütterten Mäuse einen signifikanten Anstieg des Energieverbrauchs, wenn magere Masse verwendet wird (Abbildung 5M). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Verwendung des Gesamtkörpergewichts zur Durchführung von ANCOVA-Analysen den Energieverbrauch unterschätzen könnte4. Die Gründe können sein, dass: (1) Fettgewebe nur zu ~ 5% des gesamten Energieverbrauchs beiträgt und (2) der durch fettreiche Futterfütterung induzierte Fettmassezuwachs hauptsächlich auf eine Ausweitung des Triglyceridgehalts in Adipozyten und nicht auf eine Erhöhung der Anzahl oxidativer thermogener Adipozyten zurückzuführen ist.

Braune und beige Adipozyten (BA) tragen zur Thermogenese und damit zum Energieverbrauch bei Nagetieren bei. Der Beitrag von BA zum Energieverbrauch in vivo kann nicht allein durch Messung des Sauerstoffverbrauchs des ganzen Körpers und Berechnung des BMR bestimmt werden, da mehrere Gewebe Sauerstoff verbrauchen. Der Ansatz zur Bestimmung der thermogenen BA-Kapazität in vivo beinhaltet zunächst eine Anästhesie, die erforderlich ist, um den Sauerstoffverbrauch in allen Geweben zu begrenzen. Dann wird die Anästhesie mit einem pharmakologischen Ansatz kombiniert, um die Thermogenese zu aktivieren, hauptsächlich bei thermogenem BA. Da beta-3-adrenerge Rezeptoren hauptsächlich im Fettgewebe exprimiert werden, kann der beta-3-adrenerge Agonist CL-316,243 verwendet werden, um die thermogene Ba-Funktion zu aktivieren. Darüber hinaus können die betäubten Mäuse in einem temperaturgesteuerten Gehäuse bei 30 °C untergebracht werden, um eine unkontrollierte sympathische BA-Aktivierung zu verhindern, die durch thermischen Stress in der Umgebung induziert wird. Abbildung 6 zeigt Mäuse, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden, die mit Pentobarbital betäubt und bei 30 °C in die Stoffwechselkäfige gegeben wurden, um den Energieverbrauch bei der unterdurchschnittlichen Stoffwechselrate aufzuzeichnen (Abbildung 6A-C, D). Auf diese Messung folgte die Injektion von CL-316.243, die den Sauerstoffverbrauch, die CO2-Produktion und den Energieverbrauch erhöhte, wie von der BA-Aktivierung erwartet (Abbildung 6A-C). Ein 2-3-facher Anstieg des Energieverbrauchs nach einer Beta-3-Agonistenbehandlung kann festgestellt werden7.

Abbildung 1: Die Stoffwechselkäfige mit der Umwelteinhausung und dem Aufbau einzelner Stoffwechselkäfige. (A) Die Stoffwechselkäfige im Umweltgehege. (B) Das Gehäuse kann 12 Stoffwechselkäfige aufnehmen und ermöglicht die Kontrolle von Temperatur und Licht. (C) Bestandteile der Stoffwechselkäfige vor dem Zusammenbau. (D) Mit dem Deckel verschlossene Stoffwechselkäfige. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Versuchsaufbau und Kalibrierung des Sauerstoffsensors. (A) Ein Screenshot der Oxymax-Software, die die Stoffwechselkäfige steuert und die Auswahl und Öffnung eines Fensters "Experimentelle Konfiguration" zeigt, um die (B) experimentellen Eigenschaften, nämlich Umgebungslicht und Temperatur, einzustellen. Dann wird das Experiment mit dem Fenster (C) "Versuchsaufbau" konfiguriert, um jedem Käfig eine Maus-ID, ein Körpergewicht oder eine magere Masse sowie die Luftstromrate für die 12 Käfige zuzuweisen. (D) Im selben Fenster "Versuchsaufbau" kann ein Dateispeicherpfad ausgewählt werden. (E) Um den Gassensor zu kalibrieren, muss der Benutzer den Knopf am (F) Gasdetektor drehen, um die (G-H) O2-Identität auf 1 einzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Start und Stopp der Messungen. (A) Das Experiment wird durch Klicken auf "Experiment" und dann auf "Ausführen" gestartet. (B) Die Benutzer können in Echtzeit sehen, welcher der 12 Käfige gerade gemessen wird (rotes Rechteck), sowie eine Tabelle mit den bereits gesammelten Messungen. (C) Das Experiment kann gestoppt werden, indem Sie auf "Experiment" und dann auf "Stop" klicken. (D) Die Daten können nach Excel exportiert werden, indem Sie auf "Datei", dann auf "Exportieren" und dann auf "Alle Themen CSV exportieren" klicken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Erhaltene Stoffwechselparameter. (A) Sauerstoffverbrauch. B) CO2-Produktion. (C) Energieverbrauch (EE) normalisiert auf magere Masse. (D) Respiratorisches Austauschverhältnis (RER). (E) Die körperliche Aktivität wird als Summe der X-, Y- und Z-Laserstrahlbruchzahlen berechnet. Die Daten zeigen den mittleren ± SEM. Student's t-Test, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 weibliche Mäuse pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die ANCOVA-Analyse ermöglicht eine angemessene Interpretation von Veränderungen des Energieverbrauchs bei übergewichtigen Mäusen. (A-M) Messungen an weiblichen Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Chow oder einer fettreichen Diät (HFD) gefüttert wurden. (A) Körpergewicht. (B) Fettmasse. (C) Magere Masse. (D) Nahrungsaufnahme. Schüler-t-Test, ***P < 0,001. (E) Die körperliche Aktivität wurde mit den Stoffwechselkäfigen als Anzahl der Laserstrahlbrüche in X, Y, Z bewertet. (F) Das Respiratory Coefficient Ratio (RER). (G) Sauerstoffverbrauch (VO2). (H) CO2-Produktion (VCO2). (I) Der Energieverbrauch (EE) wurde mittels indirekter Kalorimetrie gemessen. Der Energieverbrauch wurde auf (J) Magermasse und (K) Körpergewicht normalisiert. *P < 0,05 mit Zwei-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Kovariatenanalyse (ANCOVA) des Energieverbrauchs (EE) in der Nacht im Vergleich zum gesamten Körpergewicht oder (M) der mageren Masse. Gestrichelte Linien stellen die durchschnittlichen Körpergewichtswerte dar, die modelliert wurden, um VO2 und EE in jeder Gruppe zu bestimmen. *P < 0,05 mit ANCOVA. n = 7-8 weibliche Mäuse pro Gruppe. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Der selektive β3-Agonist CL-316.243 erhöht akut den Energieverbrauch bei anästhesierten Mäusen bei Thermoneutralität. Weibliche Mäuse wurden mit Pentobarbital (60 mg/kg) betäubt und in die Stoffwechselkäfige bei 30 °C gebracht. Der Energieverbrauch unter Narkose wurde aufgezeichnet, bis 3 aufeinanderfolgende Messungen die gleichen Werte zeigten, die eine vollständige Anästhesie widerspiegeln. Der Maus aus Käfig Nr. 1 wurde unmittelbar nach einer Sauerstoffverbrauchsmessung CL-316.243 (1 mg/kg) injiziert. In den anderen Käfigen wurde derselbe Injektionsansatz verwendet, um sicherzustellen, dass zwischen der Injektion und der ersten Messung bei allen Mäusen die gleiche Zeit verging. (A) Sauerstoffverbrauch. B) CO2-Produktion . (C) Energieverbrauch. n = 4 weibliche Mäuse. Die Daten zeigen die mittlere ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Formeln, die von der Oxymax-Software im CLAMS-System verwendet werden, um den Sauerstoffverbrauch, die CO2-Produktion und den Energieverbrauch zu berechnen.

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt zu diesem Protokollpapier. M.L. ist Mitbegründer und Berater von Enspire Bio LLC.