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Methodenartikel

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

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DOI:

10.3791/63072

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28. Oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.

Zusammenfassung

Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochenkrebs bei Kindern und Jugendlichen, wobei die Lunge die häufigste metastasierende Stelle ist. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Osteosarkom-Patienten mit Lungenmetastasen beträgt weniger als 30%. Daher ist die Verwendung von Mausmodellen, die die Osteosarkomentwicklung beim Menschen nachahmen, von großer Bedeutung für das Verständnis des grundlegenden Mechanismus der Osteosarkomkarzinogenese und Lungenmetastasierung zur Entwicklung neuartiger Therapeutika. Hier werden detaillierte Verfahren berichtet, um die primären Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle über die Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen zu erzeugen. In Kombination mit dem Biolumineszenz- oder Röntgen-Live-Imaging-System werden diese lebenden Mausmodelle verwendet, um das Wachstum und die Metastasierung von Osteosarkomen zu überwachen und zu quantifizieren. Um dieses Modell zu etablieren, wurde eine Basalmembranmatrix, die Osteosarkomzellen enthielt, in eine Mikrovolumenspritze geladen und nach der Anästhesie in eine Tibia jeder athymischen Maus injiziert. Die Mäuse wurden geopfert, als das primäre Osteosarkom die Größenbeschränkung im IACUC-genehmigten Protokoll erreichte. Die Beine mit Osteosarkom und die Lunge mit Metastasenläsionen wurden getrennt. Diese Modelle zeichnen sich durch eine kurze Inkubationszeit, schnelles Wachstum, schwere Läsionen und Empfindlichkeit bei der Überwachung der Entwicklung primärer und pulmonaler metastasierender Läsionen aus. Daher sind dies ideale Modelle, um die Funktionen und Mechanismen spezifischer Faktoren in der Osteosarkom-Karzinogenese und Lungenmetastasierung, der Tumormikroumgebung und der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in vivo zu untersuchen.

Einleitung

Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochenkrebs bei Kindern und Jugendlichen1,2, der hauptsächlich das umliegende Gewebe infiltriert und sogar in die Lunge metastasiert, wenn die Patienten diagnostiziert werden. Lungenmetastasen sind die größte Herausforderung für die Osteosarkom-Therapie, und die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Osteosarkom-Patienten mit Lungenmetastasen bleibt so niedrig wie 20% -30% 3,4,5. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate des primären Osteosarkoms ist jedoch seit den 1970er Jahren aufgrund der Einführung der Chemotherapie auf etwa 70% gestiegen6. Daher ist es dringend notwendig, den grundlegenden Mechanismus der Osteosarkom-Karzinogenese und Lungenmetastasierung zu verstehen, um neuartige Therapien zu entwickeln. Die Anwendung von Mausmodellen, die das Fortschreiten des Osteosarkoms beim Menschen am besten nachahmen, ist von großer Bedeutung7.

Die Osteosarkom-Tiermodelle werden durch spontane, induzierte Gentechnik, Transplantation und andere Techniken erzeugt. Das Modell des spontanen Osteosarkoms wird aufgrund der langen Tumorbildungszeit, der inkonsistenten Tumorauftretensrate, der geringen Morbidität und der schlechten Stabilität selten verwendet 8,9. Obwohl das induzierte Osteosarkommodell zugänglicher ist als das spontane Osteosarkom, ist die Anwendung des induzierten Osteosarkommodells begrenzt, da der induzierende Faktor die Mikroumgebung, die Pathogenese und die pathologischen Merkmale des Osteosarkoms10 beeinflusst. Transgene Modelle helfen, die Pathogenese von Krebs zu verstehen, da sie die physiologischen und pathologischen Umgebungen des Menschen besser simulieren können; Die transgenen Tiermodelle haben jedoch auch ihre Grenzen aufgrund der Schwierigkeit, der langfristigen und der hohen Kosten der transgenen Modifikation. Darüber hinaus traten selbst in den am weitesten verbreiteten transgenen Tiermodellen, die durch p53- und Rb-Genmodifikation erzeugt wurden, nur 13,6% des Sarkoms in den vier Gliedmaßenknochenauf 11,12.

Die Transplantation ist aufgrund ihres einfachen Manövers, der stabilen Tumorbildungsrate und der besseren Homogenität in den letzten Jahren eine der am häufigsten verwendeten primären und fernmetastasierenden Krebsmodell-produzierenden Methoden13. Die Transplantation umfasst die heterotope Transplantation und die orthotope Transplantation entsprechend den Transplantationsstellen. Bei der heterotopen Osteosarkomtransplantation werden die Osteosarkomzellen außerhalb der primären Osteosarkomstellen (Knochen) der Tiere, üblicherweise unter die Haut, subkutan14 injiziert. Obwohl die heterotope Transplantation unkompliziert ist, ohne dass eine Operation an Tieren durchgeführt werden muss, stellen die Stellen, an denen die Osteosarkomzellen injiziert werden, nicht die tatsächliche Mikroumgebung des menschlichen Osteosarkoms dar. Osteosarkom orthotope Transplantation ist, wenn die Osteosarkom-Zellen in die Knochen der Tiere, wie Tibia15,16, injiziert werden. Im Vergleich zu den heterotopen Transplantaten zeichnen sich orthotope Osteosarkomtransplantate durch eine kurze Inkubationszeit, schnelles Wachstum und starke erosive Natur aus; Daher sind sie ideale Tiermodelle für osteosarkombezogene Studien17.

Die am häufigsten verwendeten Tiere sind Mäuse, Hunde und Zebrafische18,19. Das spontane Modell des Osteosarkoms wird normalerweise bei Hunden verwendet, da das Osteosarkom einer der häufigsten Tumoren bei Hunden ist. Die Anwendung dieses Modells ist jedoch aufgrund der langen Tumorbildungszeit, der niedrigen Tumorentstehungsrate, der schlechten Homogenität und Stabilität begrenzt. Zebrafische werden aufgrund ihrer schnellen Reproduktion häufig zur Konstruktion transgener oder Knockout-Tumormodelleverwendet 20. Aber Zebrafischgene unterscheiden sich von menschlichen Genen, so dass ihre Anwendungen begrenzt sind.

Diese Arbeit beschreibt die detaillierten Verfahren, Vorsichtsmaßnahmen und repräsentativen Bilder zur Erzeugung des primären Osteosarkoms in der Tibia mit pulmonaler Metastasierung durch Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen in athymischen Mäusen. Diese Methode wurde angewendet, um das primäre Osteosarkom in Maus-Tibia für die therapeutische Wirksamkeitsbewertung zu erzeugen, die eine hohe Reproduzierbarkeitzeigte 21,22.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Tierschutzkomitee der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigt. Vier Wochen alte männliche BALB / c-athymische Mäuse wurden eine Woche lang vor der Operation zur orthotopen Injektion von Osteosarkomzellen akklimatisiert. Die Mäuse wurden in individuell belüfteten Mäusekäfigen mit fünf Mäusen pro Käfig in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Ad-libitum-Zugang zu SPF-Futter und sterilem Wasser untergebracht.

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Am Tag der Injektion von Osteosarkomzellen (143B-Luciferase) waschen Sie 80% -90% konfluierende Zellen, die in einer 10 cm Zellkulturschale kultiviert wurden, zweimal mit PBS (pH 7,4) und trypsinisieren Sie mit 1,5 ml 0,25% Trypsin für 3 min. Dann fügen Sie 6 ml 10% serumhaltige MEM-Medien hinzu, um das Trypsin abzuschrecken, und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: 143B-Luciferase-Zelllinie wird aus 143B-Zelllinientransfekt mit pLV-Luciferase-Vektor23 erhalten.
  2. Saugen Sie 20 μL Zellsuspension in die Zellzählkammer und berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle).
  3. Zentrifen Sie die Zellen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Zellpellet in einer 8,5 mg/ml-Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) auf eine Endkonzentration von 2 x 107 Zellen/ml.
  5. Halten Sie die Zellen auf Eis und bringen Sie sie in den Operationssaal. Die Zellen sind innerhalb von 2 h zu verwenden.
    HINWEIS: Um ungenaue Injektionsdosen zu vermeiden (z. B. aufgrund des Totraums in Spritzen), wird eine zusätzliche Zellsuspension hergestellt (normalerweise das Doppelte des erforderlichen Zellsuspensionsvolumens). Die Basalmembranmatrix wird die ganze Zeit auf Eis gehalten, da sie oberhalb der Raumtemperatur24 eine Gerinnungseigenschaft aufweist.

2. Operation zur orthotopen Injektion der Osteosarkomzellen

HINWEIS: Die chirurgischen Werkzeuge sind in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Mäuse wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen aufgezogen. Alle Verfahren wurden in einem aseptischen Schrank mit sterilen Werkzeugen durchgeführt.
  2. Betäuben Sie die Mäuse, indem Sie sie 2% Isofluran und 98% Sauerstoff (Sauerstoffdurchfluss, 2 L/min) aussetzen.
  3. Tragen Sie eine kleine Menge Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    HINWEIS: Führen Sie den gesamten Vorgang in einem gut belüfteten Bereich durch. Stellen Sie vor der Injektion von Osteosarkomzellen sicher, dass jede Maus durch eine Zehenprise unter tiefer Narkose steht. Wenn die Maus immer noch Antworten wie Zucken oder Ruckeln hat, warten Sie lange, bis die obigen Antworten verschwinden.
  4. Halten Sie jede Maus in Rückenlage. Halten Sie den Knöchel der Maus mit Daumen und Zeigefinger fest und desinfizieren Sie die Injektionsstelle der Tibia mit einem 70% igen Ethanolabstrich.
    HINWEIS: Um den Mausknöchel fest zu halten, sind sowohl der Daumen als auch die Zeigefingerspitzen für die nachfolgenden Verfahren von großer Bedeutung.
  5. Drehen Sie das Sprunggelenk jeder Maus nach außen, um die Tibia und das Wadenbein zu bewegen, und beugen Sie das Kniegelenk in eine geeignete Position, bis das proximale Tibiaplateau (die Oberseite der Tibia) durch die Haut deutlich sichtbar ist (Abbildung 2A).
  6. Befestigen Sie die Nadel an einer 1-ml-Spritze und richten Sie die Nadelspitze auf die Injektionsstelle. Stellen Sie sicher, dass sich die Spritzennadel parallel zur Längsachse der Tibia befindet.
    1. Führen Sie die Nadel perkutan durch oder neben dem Patellaband ein, während sie durch die Haut- / Gelenkkapsel geht; th0en, drehen Sie die Spritze (1/2 bis 3/4-Kreis), um ein Loch durch die Tibia-Plattform in Richtung des distalen Endes der Tibia (Markhöhle) für die Osteosarkom-Zellinjektion mit einer Mikrovolumenspritze zu bohren (Abbildung 2B,C).
      HINWEIS: Die gleichzeitige Rotation der Tibia kann während des Bohrens gefühlt werden, wenn die Nadelspitze genau ist. Stellen Sie sicher, dass sich die Vernadelung mit der Spritzenrotation vorwärts bewegt, anstatt direkt nach vorne gedrückt zu werden, bis sich etwa die Hälfte der Nadel in der Tibia befindet.
  7. Prüfen Sie, ob die Spritzennadel eine markante Bewegung in den Markkanal gemacht hat, um ein erfolgreiches Bohren zu gewährleisten.
    HINWEIS: Führen Sie eine Röntgenuntersuchung durch (siehe Materialtabelle), um die richtige Position der Nadel zu bestätigen und die Bilder zu sammeln.
  8. Laden Sie die 143B-Osteosarkom-Zellsuspension (ab Schritt 1.5) in eine Mikrovolumenspritze und ersetzen Sie die 1-ml-Spritze in der Tibia durch die 143B-Zellladungsspritze (Abbildung 2D). Injizieren Sie langsam ~ 10 μL (ignorieren Sie bereits vorhandene Lösung in der Nadel) der 143B-Zellsuspension in die Tibia jeder athymischen Maus (ca. 2 x 105 Zellen), ohne hohen Druck auszuüben.
  9. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem Wattestäbchen für 20-30 s, wenn die Mikrovolumenspritze entfernt wird.
  10. Legen Sie jede Maus zurück in einen sauberen Käfig und überwachen Sie sie genau, bis sich die Maus vollständig von der Narkose erholt hat (ca. 10 min).
  11. Überwachen Sie das Tumorwachstum in vivo mit einem Röntgenbildgebungssystem. Messen Sie den längeren Durchmesser (a) und den kurzen Durchmesser (b) der Krebsmasse jede Woche mit einem Bremssattel für die Berechnung des Tumorvolumens (V): V = 1/2 x a x b2.
    HINWEIS: Anästhesieren Sie die Mäuse, indem Sie sie 2% Isofluran und 98% Sauerstoff aussetzen. Die Mäuse wurden für die Röntgenbildgebung betäubt. Die Intratibia-Injektion von Luciferase- oder fluoreszierenden Protein-markierten Osteosarkom-Zellen ermöglicht die Verfolgung von primären und metastasierten Osteosarkom-Läsionen.
    HINWEIS: Humane Endpunkte der Mäuse mit Osteosarkom aufgrund des Tumorwachstums der Knie- und Lungenmetastasen basierten auf den folgenden Kriterien: (1) Body Condition Score, (2) Gewichtsverlustschwelle von 20%, (3) durchschnittlicher maximaler Durchmesser von Tumoren von 2 cm oder (4) stark eingeschränktes Tierverhalten.

3. Pathologische Untersuchung (Sammeln von primären und pulmonalen metastasierenden Osteosarkomproben zur Analyse)

  1. Sechs Wochen nach der Injektion von Osteosarkomzellen die Mäuse durch Zervixdislokation opfern, nachdem Sie sie für die CO 2-Inhalation ausgesetzt haben.
  2. Halten Sie die Maus in Rückenlage und dehnen Sie beide Hintergliedmaßen.
  3. Trennen Sie die ganzen Beine, die ein Osteosarkom tragen, vom Leistenbereich.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Beine von derselben anatomischen Stelle getrennt sind.
  4. Bereiten Sie die histologische Probe der Beine mit Osteosarkom vor, indem Sie die Haut, Muskeln und Füße entfernen, und fixieren Sie dann die Probe jeder Maus in einem 50-ml-Röhrchen mit 20 ml Formalinlösung (10%) für 24 h, gefolgt von einer Entkalkung in 10% EDTA-Lösung für 14 Tage mit gelegentlichem Pufferwechsel.
  5. Betten Sie die Probe in Paraffin ein und bereiten Sie Abschnitte für die histologische Untersuchung nach bereits veröffentlichten Arbeitenvor 25.
  6. Trennen Sie die Lungen vorsichtig und geben Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen, das mit 20 ml Formalinlösung (10%) gefüllt ist. Nach 24 h die Lungen jeder Maus in eine 15-ml-Röhre mit 70% Ethanol überführen. Betten Sie die Lunge in Paraffin für Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung und Immunhistochemie-Assay25.

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Ergebnisse

Erfolgreiche orthotope (primäre) Osteosarkom- und metastasierende Lungenmodelle hängen von der genauen orthotopen Injektion von Osteosarkomzellen ab. Hier wurde erfolgreich ein orthotopes (primäres) Osteosarkom-Modell mittels intratibialer Osteosarkom-Zellinjektion entwickelt. Abbildung 3A zeigt eine repräsentative Maus mit orthotopem (primärem) Osteosarkom, und Abbildung 3B zeigt ein repräsentatives isoliertes orthotopes (primäres) Osteosarkom. Das Tum...

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Diskussion

Die orthotope Injektion von Osteosarkomzellen ist ein ideales Modell, um die Funktion und den Mechanismus spezifischer Faktoren bei der Karzinogenese des Osteosarkoms zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Um Unterschiede im Tumorwachstum zu vermeiden, werden die meisten aktiven Osteosarkomzellen bei 80% -90% Konfluent mit der gleichen Anzahl vorsichtig in die Tibia jeder Maus injiziert, und die Zelltrypsinisierungszeit wird streng kontrolliert, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Da ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse von (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 und 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Automatischer ZellzählerShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Zählzellen
AnästhesiemaschineShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR500IPDie Ausrüstung von Anästhesiemäusen
BALB / c athyme MäuseShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.animal
Basalmembran-MatrixShanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd356234, BD, Matrigelre-suspendierte Zellen
Biolumineszenz-BildgebungssystemShanghai Baitai Technology Co., LtdVieworksVerfolgung des Tumorwachstums und der Lungenmetastasierung, wenn die Injektionszelle durch Luziferase markiert wird
Zentrifugenröhrchen (15 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningZentrifuge die Zellen
IsofluranShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASYAnästhesiemäuse
MEM MedienShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Zellkulturmedium
MikrovolumenspritzeShanghai Hochtaubenindustrie und Handel Co., Ltd0-50 μ LInjizieren Sie präzise Zellen in das Schienbein
Phosphatgepufferte KochsalzlösungBeyotime BiotechnologyST447waschen Sie die menschlichen Osteosarkomzellen
1ml SpritzenShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd20200411Bohren
143B ZelllinieATCCCRL-8303Osteosarkom-Zelllinie
Trypsin (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, GibcoTrypsin-Behandlung von Zellen
TrypanblauBeyotime BiotechnologyST798Färben von Zellen zur Beurteilung des
Aktivitätsvektors (pLV-Luciferase)Shanghai YueNian Biotechnology Co., LtdVL3613Plasmid
Lipofectamine 2000Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd11668027, Thermo fisherPlasmid-Transfektionsreagenz
Röntgenbildgebung SystemBrook (Beijing) Technology Co., LtdFX PRORöntgenbilder wurden zur Erkennung des Tumorwachstums aufgenommen
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